교신저자：조중생, 130-702 서울 동대문구 회기동 1번지  경희대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   호산구는 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염 등 알레르기 질환의 병태 생리에 중요한 역할을 하며, 호산구 화학주성에는 많은 cytokine과 chemokine이 관여하는 것이 밝혀져 있다.¹⁾ Chemokine 중 특히 RANTES(regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted), eotaxin, MCP-3, -4(monocyte chemotactic protein-3, -4)가 호산구에 주로 작용하며,²⁾ 조직 내 호산구 축적에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 이들의 단백 발현 기전과 분비세포에 대한 연구가 계속 되어왔다.³⁾ 섬유아세포는 chemokine 단백 발현을 통해 호산구와 상호 작용하여 기도질환의 병태 생리에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 피부의 섬유아세포에 Th2 cytokine의 하나인 IL-4(interleukin-4)가 작용하여 eotaxin 단백 발현이 증가하고, Th1 cytokine의 하나인 TNF-α(tumor necrosis factor alpha)를 처리했을 때는 RANTES 단백 발현이 증가하며, IL-4와 TNF-α를 같이 처리했을 때 eotaxin이 다량 발현된다는 보고가 있었고,⁵⁾ 폐의 섬유아세포에서도 IL-4가 eotaxin 단백 발현을 증가시키며 TNF-α와 상승작용이 있고, 반면에 TNF-α와 IFN-γ(interferon gamma)는 RANTES 단백 발현에 상승작용이 있어, 각기 다른 Th1, Th2 cytokine의 자극에 chemokine의 분비 양상이 달라짐을 밝혔다.⁶⁾ 이에 저자들은 TNF-α, IFN-γ, 그리고 IL-4와 수용체를 공유하며 비슷한 기능을 하는 IL-13을 배양된 인간 비점막섬유아세포에 처리하여 eotaxin과 RANTES의 mRNA와 단백 발현을 확인하고, 또한 각 cytokine간 상호작용이 발현 결과에 어떤 영향을 미치는 지를 연구하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   부속병원 이비인후과에서 비중격만곡증으로 진단 받고 수술 받은 환자 5명에서 하비갑개 점막을 채취하여 섬유아세포를 배양하였다. 수술전 2개월 내에 전신 혹은 국소 스테로이드, 항히스타민제, 항생제를 복용했거나 알레르기병력, 만성 부비동염, 비용이 있는 환자는 대상에서 제외하였다.

방  법

비점막 섬유아세포의 분리 및 배양
   수술 중 얻은 비점막을 500 U/ml penicillin(GIBCO, Grand Island, NY, USA), 500 μg/ml streptomycin(GIBCO), 6 μg/ml Fungizon(GIBCO)이 함유된 Ca^2＋, Mg^2＋ free phosphate buffered saline(PBS)로 3회 세척하고 2 mm로 잘게 썰어 0.25% collagenase를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, GIBCO)에 넣어 30분 동안 37°C, 5% CO₂ 하에서 배양한 후 collagenase를 버리고 50 μg/ml gentamicin이 함유된 DMEM 용액 10 ml가 들어있는 배양 용기에 절편을 옮기고 겸자를 이용하여 절편에서 비점막 상피세포와 내피세포가 떨어지게 압력을 가하였다. 남은 조직에 2% fetal bovine serum(FBS, GIBCO), 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml Fungizon을 첨가하고 37°C, 5% CO₂ 하에서 섬유아세포를 3~4주간 계대 배양하여 4세대의 섬유아세포를 얻었다.

비점막섬유아세포의 Cytokine자극
   Cytokine은 재조합된 인간 TNF-α, IFN-γ, IL-13(R & D system, Minneapolis, MN, USA)을 사용하였는데, PBS로 녹인 후 섬유아세포에 각각 IL-13(20 ng/ml), TNF-α(10 ng/ml), IFN-γ(20 ng/ml), IL-13(20 ng/ml)＋TNF-α(10 ng/ml), IL-13(20 ng/ml)＋IFN-γ(20 ng/ml), TNF-α(10 ng/ml)＋IFN-γ(20 ng/ml)을 6, 24, 48시간 처리하고 배양하여, cytokine을 처리하지 않고 PBS만 첨가한 대조군(6, 24, 48시간)과 eotaxin, RANTES의 mRNA와 단백 발현을 비교하였다. IL-13은 0.2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml, 200 ng/ml로 양을 달리하여 6시간 처리하고 양의 증가에 따른 eotaxin의 mRNA와 단백 발현을 확인하였다. 각각의 경우에서 상등액과 세포들을 분리하여, 상등액은 ELISA로 측정할 때까지 -70°C에 보관하였고, 세포는 0.05% trypsin을 5분간 처리한 후 PBS로 세척하고 14,000 rpm으로 5분간 원심 분리시켜 얻어진 pellet를 Trizol^®(Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 1 ml로 녹인 후 RNA를 추출하기 전까지 -70°C에 보관하였다.

비점막섬유아세포에서 총 RNA추출
   세포가 녹아있는 Trizol^® 용액을 가압멸균된 RNA 미세원심 분리시험관에 넣고, 200 μl의 chloroform을 첨가 후 흔들어 잘 섞이게 하고, 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액 500 μl를 취하였다. 상등액과 동량의 isopropanol을 넣고 tube를 위, 아래로 흔들어 잘 섞어 10분 방치 후 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 얻어진 RNA pellet를 70% ethyl alcohol로 세척한 후 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 용액을 버리고 말리다가 Diethyl pyrocarbonate를 처리한 증류수 5~10 μl로 RNA pellet를 녹였다.

역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)
   Cytokine처리 전후의 eotaxin, RANTES의 mRNA 발현양상을 역전사 중합효소연쇄반응 키트(Takara Shuzo, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였으며, 이를 약술하면 다음과 같다.

역전사(Reverse transcription)
   각 군마다 2 μg의 총 RNA를 역전사반응액(5 mM MgCl 24 μl, 1×RNA PCR buffer 2 μl, 1 mM dNTP 2 μl, 1 unit/μl RNase inhibitor 0.5 μl, 0.125 μM oligo dT 1 μl, 0.25 unit/μl Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase 1 μl)과 혼합하여 수조에서 42°C, 1시간을 반응시키고 94°C에서 5분간 유지한 후 증류수로 희석하여 cDNA를 합성하였다.

중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)
   cDNA 3-5 μl를 중합효소연쇄반응액(5 unit/μl TaKaRa Taq polymerase, 10×PCR buffer, 2.5 mM dNTP mixture)과 혼합한 후, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 이용하고 eotaxin, RANTES 특이 시발체를 이용하여 반정량적 중합효소연쇄반응을 시행하였으며, 증폭된 산물은 1% agarose gel 상에서 전기영동으로 분석하였다. 시발체의 염기서열 및 증폭 산물의 크기는 Table 1에 나타내었다. GAPDH의 경우 95°C 1분(전변성반응, predenaturation), 94°C 30초(변성반응, denaturation), 58°C 45초(결합반응, annealing), 72°C 1분(연장반응, extension), 72°C 5분(재연장반응, reextension)으로 22cycle을, RANTES의 경우 결합반응온도만 60°C로 하여 32cycle로, eotaxin의 경우 결합반응온도만 62°C하에 32cycle로 DNA thermal cycler(Gene Amp PCR system 2400, Foster city, CA, USA)를 이용하여 증폭하였다.

상등액의 Chemokine정량
   Eotaxin enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 키트, RANTES ELISA 키트(Quantikine^®, R & D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 상등액에서 chemokine 양을 측정하였다. 각 키트의 민감도는 5 pg/ml, 8 pg/ml 이하였다. 모든 실험은 두 번 측정하였고, 결과는 2회 반복하여 실험치의 mean±standard errors of means(SEM)로 나타내었다.

결     과

배양된 인간 비점막섬유아세포에서 Cytokine처리에 의한 RANTES, eotaxin의 mRNA 발현 양상
    RANTES의 경우 cytokine을 처리하지 않은 대조군이나 IL-13으로 처리한 군에서는 거의 발현이 되지 않았고, IFN-γ를 처리한 군은 6, 24시간에는 발현이 없다가 48시간에 약간 발현되었고, TNF-α, IL-13＋TNF-α, TNF-α＋IFN-γ를 처리한 군에 한하여 6, 24, 48시간 모두 mRNA 발현이 증가하는 양상을 보였으며, 자극한 시간이 증가할수록 mRNA의 발현이 증가하는 양상을 보여 48시간에 최고에 달하였다. 특히, TNF-α＋IFN-γ으로 자극한 경우에는 TNF-α, IFN-γ 단독으로 자극한 경우와 비교하여 발현이 6시간째부터 강하게 증가하였다(Fig. 1).
    Eotaxin mRNA 발현에 있어서는 아무 것도 처리하지 않은 대조군의 경우에도 시간이 지남에 따라 발현이 증가하는 양상을 보였으며, TNF-α로 처리한 경우에는 오히려 대조군보다도 발현이 적어 거의 발현되지 않는 양상이었고, IFN-γ로 처리한 경우에는 대조군과 거의 유사한 발현 양상을 보였다. IL-13으로 처리한 경우는 6, 24, 48시간 모두에서 강한 발현 양상을 보였고, 특히 6시간 처리군이 가장 강력한 발현 양상을 보였다. IL-13＋TNF-α의 경우 6시간대는 거의 발현이 되지 않았으나, 24, 48시간째는 강한 발현을 보여 IL-13 단독처리군과 차이를 보였다. 또한, IL-13＋IFN-γ, TNF-α＋IFN-γ는 6시간에만 발현이 현저하게 증가하였다(Fig. 2). IL-13의 농도 증가(0.2, 2, 20, 200 ng/ml)에 따른 mRNA의 발현 양상은 20 ng/ml까지는 농도에 비례하여 증가하였고, 20 ng/ml와 200 ng/ml 처리한 군은 비슷한 발현 양상을 보였다(Fig. 3).

배양액 내로 분비된 RANTES와 eotaxin의 ELISA분석
   RANTES의 단백 발현은 48시간에 대조군은 2.4±1.31 pg/ml, IL-13을 처리한 군에서는 5.42±0.46 pg/ml, IFN-γ로 처리한 군에서는 23.9±0.38 pg/ml이 단백 발현되었고, TNF-α 처리한 군에서 4033±20.59 pg/ml, TNF-α＋IL-13 처리한 군에서 6507.2±295.35 pg/ml, TNF-α＋IFN-γ로 처리한 군에서 45680.4±307.60 pg/ml으로 다량 발현되었으며, 이는 시간대별로 증가하는 양상을 보였다. 특히 TNF-α＋IFN-γ로 자극한 군의 경우에는 TNF-α와 IFN-γ 각각 자극한 경우보다 상승적으로 단백 발현되었다(Fig. 4). 반면에 eotaxin의 단백 발현은 48시간에 대조군은 21.78±0 pg/ml, TNF-α로 처리한 군에서 38.72±2.03 pg/ml, IFN-γ로 처리한 군에서 31.63±0.34 pg/ml, TNF-α＋IFN-γ로 처리한 군은 165.82±4.4 pg/ml이였다. IL-13으로 단독 처리한 군은 6시간째 77.84±0.32 pg/ml, 24시간째 275.37±4.55 pg/ml, 48시간째 482.19±15.3 pg/ml이 단백 발현되었고, IL-13＋IFN-γ로 처리한 군도 시간에 비례하여 단백 발현량이 증가했지만, 특히 6시간에 323.86±5.38 pg/ml로 다량 발현되어 6시간에만 강하게 발현된 mRNA의 발현 양상과 일치하는 결과를 보였다. IL-13＋TNF-α로 처리한 경우 6시간째 229.82±8.62 pg/ml, 24시간째 683.6±13.64 pg/ml, 48시간째 1027.41±26.87 pg/ml로 상승적으로 단백 발현되었고 시간에 따라 단백 발현량이 증가되었다. 따라서 IL-13을 단독으로 처리한 군보다 IL-13과 IFN-γ나 TNF-α를 함께 처리했을 때 그 단백 발현량이 증가함을 알 수 있었다(Fig. 5). 또한, IL-13은 농도별로 각각 0.2 ng/ml에서 31.2±4.23 pg/ml, 2 ng/ml에서 75.6±6.44 pg/ml, 20 ng/ml에서 79.4±0.64 pg/ml, 200 ng/ml에서 105.1±3.87 pg/ml의 eotaxin이 단백 발현되어 농도에 비례하여 단백 발현량이 증가하였고, 매우 낮은 농도(0.2 ng/ml)에서도 대조군보다 많은 eotaxin 단백이 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 6).

고     찰

   섬유아세포가 IL-4, TNF-α자극에 의해 eotaxin을 단백 발현한다는 것은 피부나 폐의 섬유아세포에서 확인되었고,⁵⁾⁶⁾ 통년성 알레르기 비염 환자의 하비갑개 비점막에서 분리하여 배양한 섬유아세포에서도 IL-4나 IL-13이 TNF-α와 상승 작용하여 eotaxin의 발현을 증가시킨다는 연구결과도 있었다.¹⁾ 본 연구에서는 비중격 만곡증 환자를 대상으로 하비갑개 비점막에서 분리하여 배양한 섬유아세포에서 eotaxin 뿐만 아니라 RANTES의 mRNA와 단백발현을 확인하였다. IL-13은 IL-4 수용체의 α 사슬에 결합하여 B 세포와 단핵구에 대해 IL-4와 비슷한 생물학적 활성을 갖고 있는 것으로 알려져 있으나,⁷⁾ 국내에서 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구에서 IL-13 단독 처리시 많은 eotaxin 발현을 보였으며, 농도와 비례하여 발현이 증가되었고, TNF-α와 함께 자극한 경우에는 상승적으로 작용하여 더욱 많은 eotaxin이 발현되었다. 이 결과로 미루어 알레르기 염증 반응시 항원 자극에 의해 비반세포, 호염기구를 자극하여 IL-4와 TNF-α를 분비하고, 이들이 주위의 섬유아세포를 자극하여 eotaxin을 분비함으로써 생체 내에서 조직 호산구증다증에 중요한 역할을 할 것으로 생각할 수 있다. Terada 등¹⁾은 비점막섬유아세포를 IL-13으로 먼저 자극하고 이후에 TNF-α를 첨가하여 자극한 군, TNF-α로 먼저 자극하고 후에 IL-13을 첨가하여 자극한 군, 동시에 둘을 넣고 자극한 군으로 조건을 나누어 eotaxin의 단백 발현을 측정하였는데, TNF-α로 먼저 자극하고 후에 IL-13을 첨가하여 자극한 군에서 단백 발현이 상승적으로 증가하지 않음을 들어 IL-13과 TNF-α가 섬유아세포에서 eotaxin의 단백발현을 증가시키는 기전으로 IL-13이 섬유아세포에 작용하여 TNF-α에 대한 감수성을 증가시켜 상승적인 증가가 생기는 것으로 설명하였다. 반면에, Lugli 등⁸⁾은 IL-13과 TNF-α에 의한 eotaxin의 상승적인 단백 발현증가는 TNF-α가 IL-4 수용체 α사슬의 발현을 2, 3배 증가시키거나 혹은 TNF-α가 IL-4 특이 STAT-6(signal transducer and activator of the transcription protein)의 활성화를 촉진시키기 때문이라고 하였는데, 인간의 eotaxin 촉진자(promoter)부위 1 kb 이내에 적어도 4개의 STAT-6 결합인자가 있다는 연구결과로⁹⁾¹⁰⁾ 미루어 볼 때 후자가 옳을 가능성이 더 크다고 생각하였다.
   IFN-γ가 eotaxin 단백 발현에 미치는 영향에 대해서는 각기 다른 연구결과가 보고되고 있다. 사람의 피부섬유아세포에서는 TNF-α와 함께 처리한 경우 eotaxin 발현이 증가된다는 보고가 있지만,¹¹⁾ 폐의 섬유아세포에서는 IFN-γ와 TNF-α를 함께 처리한 경우 오히려 eotaxin 단백 발현이 억제된다는 상반된 연구가 있다.⁶⁾¹²⁾ 본 연구에서는 IFN-γ자체만으로는 eotaxin 단백 발현에 영향이 없었지만, 피부에서와 마찬가지로 TNF-α나 IL-13을 같이 처리한 경우 그 단백 발현이 억제되지 않고 증가하였다. 이는 IFN-γ가 항알레르기효과를 나타내는 기전 자체가 Sato 등¹²⁾이 주장한 것처럼 섬유아세포에 직접 작용하여 나타나는 것이 아니고, Th2 세포의 분화를 억제하여 간접적으로 나타나는 것으로 설명할 수 있다. 또한, 조직마다 그 결과가 상이하게 나타나는 것은 여러 문헌에서 보고되었던 섬유아세포의 조직간 이형질성에서 원인을 찾을 수 있다.¹³⁾¹⁴⁾
   한편, TNF-α와 IFN-γ로 처리한 군에서 eotaxin mRNA 발현은 6시간에 강하게 나타나서 빠른 시간대에 유도되는 반면, RANTES 발현은 시간이 지날수록 증가하여 48시간 처리군에서 가장 큰 발현정도를 보여 상대적으로 늦게 발현되었다. Terada 등¹⁾도 6시간째 eotaxin의 mRNA 발현이 가장 크고 시간이 흐를수록 그 정도가 낮아지는 결과를 얻었다. Stellato 등¹⁵⁾은 기관지 상피세포에서 TNF-α와 IFN-γ자극에 의해 eotaxin은 빨리, RANTES는 늦게 발현된다고 보고하였는 데, 이에 대해 RANTES를 발현 유도하는 것은 eotaxin을 발현 유도하는 것보다 더욱 높은 cytokine의 농도가 필요하고, 단백질합성이 주로 de novo protein synthesis를 통해 일어나기 때문이라고 설명하였다. RANTES, eotaxin 유전자의 촉진자부위의 몇몇 cis 조절인자가 규명되었는 데,^9)10)16) 특히 인간 RANTES 촉진자는 4개의 NF-κB(nuclear factor kappa B)결합부위를 가지고 있는 것이 밝혀졌다.¹⁷⁾ 쥐의 섬유아세포에서도 TNF-α와 IFN-γ에 의해 STAT-1이 NF-κB와 작용하여 RANTES의 늦은 발현에 관여한다는 연구도 있어,¹⁸⁾ 유전자의 전사를 지속시키는 데 어떤 조절인자가 관여할 것으로 생각된다. 그러므로, 빠른 시간대에 발현하는 eotaxin에 의해 많은 호산구들의 조직 내 축적이 시작되고 이는 늦게 발현하는 RANTES에 의해 계속 연장될 수 있으며, 특히 RAN-TES가 알레르기 염증의 후기 반응에 관여한다는 가설이 가능하지만, 이의 정확한 기전에 대해서는 앞으로 더 규명되어야 할 것이다.
   RANTES의 분비는 피부섬유아세포에서 TNF-α처리 후의 분비에 대해 보고된 바 있고,¹⁹⁾ Maune 등³⁾은 IL-1β, IFN-γ, TNF-α자극 후 비점막섬유아세포에서 RANTES 발현이 관찰되는 반면, 상피세포에서는 발현이 관찰되지 않아서 비점막에서의 RANTES 단백 발현이 주로 섬유아세포에서 이루어진다고 하였다. 본 연구에서도 TNF-α나 IFN-γ로 자극 시 RANTES 발현이 증가하였으며, 특히 TNF-α가 가장 강력한 자극원임을 알 수 있었다. 또한 TNF-α와 IL-13 혹은 IFN-γ를 같이 자극한 경우 상승적으로 분비가 증가하였고 특히 TNF-α와 IFN-γ를 함께 자극한 경우 TNF-α단독으로 자극한 경우보다 10배 이상의 농도가 분비되었다. 이는 Teran 등⁶⁾이 폐의 섬유아세포를 대상으로 했던 결과와 같은 것이다. 이의 기전으로는 사람에서 TNF-α와 IFN-γ가 NF-κB와 interferon regulatory factor 1(IRF-1) 전사인자를 통해 RANTES promoter를 활성화한다는 결과가 있어,²⁰⁾ 이를 뒷받침할 수 있을 것이다.

결     론

   인간 비점막섬유아세포에서 Th1 cytokine인 TNF-α, IFN-γ와 Th2 cytokine인 IL-13에 의해 eotaxin이나 RANTES가 발현되며, TNF-α, IFN-γ는 주로 RANTES를 IL-13은 주로 eotaxin을 유도하여 각기 다른 cytokine에 따라 다른 chemokine이 유도됨을 알 수 있었다. 또한, chemokine의 mRNA와 단백 발현에 각 cytokine간의 상승작용이 있음을 알 수 있었고, eotaxin과 RANTES의 발현시간의 차이를 통해 호산구들의 조직 내 축적이 빠른 시간대에는 eotaxin에 의해 주로 일어나며, 이는 늦게 발현하는 RANTES에 의해 계속 연장될 수 있다고 생각하였다. Eotaxin과 RANTES가 CCR3 수용체를 통하여 호산구 화학주성에 관여하기 때문에 이 수용체의 길항체의 개발이 호산구의 조직 내 축적을 막을 수 있을 것으로 생각된다.

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