교신저자：김 진, 137-705 서울 서초구 반포동 505  가톨릭대학교 의과대학 해부학교실
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현 근무지：권용식(해맑은 이비인후과)

서     론

   세포는 일반적으로 고삼투성(hyperosmotic) 환경에 노출되었을 때, 삼투조절능력(osmoregulatory mechanism)이 없으면 세포수축이 일어나고 사망하게 된다. 그러므로, 삼투조절능력은 세포가 여러 환경에서 원활한 생존과 기능을 유지하기 위한 중요한 방어기전이다. 콩팥수질(renal medulla)의 세포사이질(interstitium)은 1,200~2,000 mOsm/kg 정도의 고삼투성 환경을 조성하여 소변 농축 기전에 관여한다. 고삼투성 환경에 노출된 수질 내 세포들은 세포질 내에 myoinositol, betaine, sorbitol 등과 같은 compatable osmolyte가 축적되어 세포막에 발생된 삼투압 차를 극복할 수 있다. 만일 고장성 환경에 노출되어 있는 세포에 compatible osmolyte가 축적이 안되면 세포는 괴사에 빠져 죽게 된다. 이러한 compatable osmolyte 들의 세포내 축적에는 각각 고유한 운반체(transporter)나 합성효소가 관여한다.¹⁾²⁾³⁾4)> Myo-inositol은 sodium-coupled myo-inositol transporter(SMIT)에 의해, betaine은 sodium/chloride-coupled betaine γ-aminobutyric acid transporter(BGT1)에 의해 운반되며, sorbitol은 glucose가 aldose reductase(AR)의 촉매작용에 의해 생산된다. SMIT, BGT1 및 AR 각각에 대한 유전자에는 전사를 촉진하는 tonicity-responsive enhancer(TonE) 부분이 공통적으로 있는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 최근 Miyakawa 등¹⁾은 TonE 전사인자인 TonE binding protein(TonEBP)의 cDNA를 cloning하였다. 따라서 세포가 고삼투성 환경에 노출되었을 때 전사인자인 TonEBP가 TonE에 결합하여 SMIT, BGT1, AR 등을 증가시켜서 myo-inositol, betaine, sorbitol 등 compatible osmolyte를 세포 내에 축적시킴으로써 세포 내 등장성을 유지할 수 있다.^1)2)3)5)
   내이는 청력과 평형을 담당하는 기관으로, 정상적인 기능을 위해서는 내이 체액(inner ear fluid)의 항상성이 필요하다. 그러나, 내이 체액의 원활한 평형유지에 관하여서는 아직도 논란이 많은 상태이다. 와우의 체액은 내림프와 외림프로 이루어져 있고, 외림프는 혈청에서, 내림프는 외림프에서 형성되는 것으로 알려져 있으며, 체내에 삼투물질을 투여하면 외림프에서 보다 빠른 삼투성 변화를 일으키며 와우의 기능유지를 위해 다양한 삼투성 물질과 이온의 이동이 있는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 저자들은 내이 체액의 성분이 변화할 때, 원할한 내이 세포의 생존과 기능유지를 위해서는 와우 내에 긴장도(tonicity) 조절에 관여하는 물질이 있을 것으로 추정하고 면역화학적 염색법을 이용하여 TonEBP의 발현을 관찰하였다.

재료 및 방법

조직준비
   실험동물로 10마리의 정상 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley rats, 130~150 g)를 사용하였다. 복강내 마취로 펜토탈소디움(50 mg/kg)을 사용하였으며, 와우를 고정하기 위해 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)를 이용하여 심장관류와 외림프관류를 시행하였다. 측두골을 채취한 후, 동일 고정액으로 4°C로 하룻밤동안 고정하였으며, 4% 파라포름알데히드를 포함한 10% EDTA용액으로 4°C에서 3주간 탈회시켰다. 탈회된 측두골을 30% sucrose용액에 세척한 후 OCT compound(Tissue Tek, Sakura, Japan)에 올려놓았다. 동결 후, 조직을 6~10 μm 두께로 절편하고 Superfrost/Plus microscope slides(Fisher Biotech., PA, USA)에 부착시켰다. 일부의 탈회된 측두골은 순차적으로 희석된 에탄올에서 탈수시킨 후 왁스(polyethylene glycol 400 disterate；Polyscience, Inc, Warington, PA, USA)에 포매후 4~6 μm 두께로 왁스절편하여 면역조직화학 염색을 위한 준비를 마쳤다.

항  체
   흰쥐 와우에서 TonEBP를 발현을 보기 위해서, 기존의 연구에서 증명된¹⁾⁷⁾ specific rabbit polyclonal antibody(Johns Hopkins 대학의 권혁무 교수제공)를 사용하였다.

면역조직화학염색
   준비된 냉동 혹은 왁스 절편으로 avidin-biotin-horse-radish peroxidase technique(Elite Vectastain ABC kit for rabbit IgG；Vector Laboratories, Burlington, CA, USA)을 이용한 면역조직화학염색 과정을 시행하였다. 절편은 탈 왁스, 탈수과정을 거친 후, 내재성과산화효소의 작용을 방지하기 위해 1.4% methanolic H₂O₂에서 30분간 처리하였다. 절편을 30분간 blocking serum으로 처리한 후, 4°C에서 일차항체로 하룻밤동안 반응시켰다. PBS용액으로 세척한 후, 절편을 실온에서 1시간 동안 biotinylated goat anti-rabbit antibody에 반응시켰다. 절편을 다시 세척한 후, 실온에서 1시간동안 0.3% avidin-biotin-peroxidase complex에 반응시켰다. 항원-항체 반응을 관찰하기 위하여 DAB(3',3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 반응하였다. 순차적 농도로 에탄올에 의한 탈수과정을 거친 후, glass coverslip을 덮고 광학현미경으로 관찰하였다. 양성 대조군은 흰쥐의 신장조직을 이용하였고, 음성 대조군은 일차항원을 대신 TonEBP에 대한 preimmune serum을 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다.

결     과

와우내 TonEBP의 발현
   TonEBP-양성 세포들이 코르티기관, 나선연(spiral limbus), 나선인대(spiral ligaments) 그리고 기저막(basilar membrane)에서 관찰되었다(Fig. 1). 혈관선조(stria vascularis)와 라이스너 막(Reissner's membrane)에서는 TonEBP 면역반응성이 관찰되지 않았다. 코르티기관에서, TonEBP가 외유모세포와 Deiter 세포의 핵에서 발현되었으나, 회선의 위치에 따라 면역반응성이 서로 달랐다. 즉 외유모세포는 중간회선(middle turn)에서 기저회선(basal turn)보다 강하게 발현되었으나, Deiter 세포에서는 기저회선에서 중간회선보다 강하게 발현되었다(Fig. 2). 나선인대의 섬유세포(fibrocyte)의 핵에서도 TonEBP가 발현되었는데, 중간회선에서는 주로 1형(type I) 섬유세포에서 강하게 발현되는 반면 3형(type III) 섬유세포에서는 발현되지 않았으나, 기저회선에서는 1형 섬유세포 보다는 3형 섬유세포에서 보다 강하게 발현되었다(Fig. 3). 나선연의 결합조직과 고실계(scala tympani)와 연한 기저막의 상피조직에서도 TonEBP가 발현되었다(Fig. 3).

콩팥에서의 TonEBP에 대한 항체 및 preimmune serum의 반응
   콩팥에서 TonEBP는 바깥수질(outer medulla) 속줄무늬층(inner stripe)과 속수질(inner medulla)에서 강한 면역반응성을 띠었다(Fig. 4A). 바깥수질에서는 내림가는부분(descending thin limb) 세포의 세포질에서, 속수질에서는 거의 모든 세포의 핵에서 강한 양성반응을 띠었다(Fig. 4B and C). 피질(cortex)과 바깥수질 바깥줄무늬층(outer stripe)에서는 TonEBP에 대한 면역반응성을 관찰할 수 없었다. 또한 TonEBP에 대한 preimmune serum을 이용한 면역조직화학염색에서는 콩팥(Fig. 4D)과 와우(Fig. 4E)의 모든 조직에서 염색되지 않았다.

고     찰

   본 연구는 와우에서 TonEBP의 발현에 관한 첫 번째 연구로, TonEBP는 와우의 코르티기관의 외유모세포, Deiter 세포, 나선연의 결체조직, 나선인대의 섬유세포, 그리고 고실계와 접한 기저막의 상피세포에서 발현되었다.
   와우는 전정계, 중간계, 고실계로 이루어져 있으며, 중간계는 내림프로, 전정계와 고실계는 외림프로 채워져 있으며, 구성하는 삼투성 물질과 이온은 각각 다른 농도로 이루어져 있다. 각 구획의 이온 농도는 확연한 차이를 보여, 내림프의 경우 K^＋농도가 상대적으로 높으며(157 mOsmol/kg H₂O), 외림프는 Na^＋농도가 상대적으로 높다(141 mOsmol/kg H₂O). 특히, K^＋ 이온은 와우에서 전위 차를 일으키는 기본물질로 생각되어지며, 와우 내에서 재순환(recycling)하는 것으로 생각되어진다.⁸⁾ 내림프로 구성된 중간계는 융합막(tight junction)으로 둘러싸여져 내림프와 외림프가 서로 섞일 수 없는 장벽역할을 하여, 각 구획은 다른 물질 조성을 보인다. 일반적으로 외림프는 혈액-외림프 장벽(blood-perilymph barrier)를 통해 혈액에서 생성되는 것으로 알려져 있으며, 내림프는 중간계를 둘러싼 세포를 통과하는 어떠한 기전(transcellular mechanism)에 의해 외림프에서 생성되는 것으로 알려져 있다.⁶⁾⁹⁾
   또한, 와우는 내이 체액의 항상성을 유지하기 위해 여러 효소(enzyme)과 운반체(transporter)를 갖고 있다. Na^＋-K^＋ adenosine triphosphatase, carbonic anhydrase, adenylate cyclase, Na^＋-K^＋-2Cl- co-transporter, 그리고 D-glucose facilitated transporter 등이 여러 연구에 의해 내이에서 증명되었다.^6)9)10) 이러한 물질에 의해, 내이체액을 조절함으로써 정상적인 청력과 평형의 기능을 수행할 수 있다. 또한, 요소, glycerol 등 삼투물질을 체내에 주입하면 빠른 속도로 외림프 삼투압의 증가를 초래하므로,¹¹⁾¹²⁾ 내이세포가 변화하는 삼투압 환경 속에서도 일정한 기능을 수행하기 위해서는 삼투조절능력이 필요하다고 생각된다. 그러나 지금까지 내이의 삼투조절기능에 관하여 증명된 기전은 없는 상태이다. 포유류의 신수질 세포의 경우, 삼투압의 변화(osmotic stress)가 발생하면 삼투조절능력으로 세포의 일정한 용적(volume)과 세포내부 이온 환경을 일정하게 유지시켜줄 수 있다. 예를 들어, 세포외부의 삼투압이 올라가면 세포는 물을 방출하여 세포의 용적을 줄이고 세포 내 물질의 농도는 올라가게 된다. 이때 무기용질(inorganic solute) 유입으로 세포용적을 증가시키는 삼투조절반응(osmoregulatory response)이 발생한다. 그러나, 이러한 반응은 세포내 일정한 Na^＋, K^＋농도를 유지시키기 어렵다. 그러므로, 세포의 수축방지와 이온의 일정한 농도유지를 위해서는 세포내 compatable osmolyte를 증가시키는 또 다른 삼투조절반응이 필요하며, TonEBP가 이 기능을 담당할 것으로 생각된다.²⁾¹³⁾ 그러므로, 본 연구 결과는 혈액의 삼투물질이나 이온 농도 변화에 대응하는 내이의 방어기전을 밝히는데 도움이 되리라 생각된다.
   외유모세포(OHC)는 원통모양의 세포로 수력적인 골격(hydraulic skeleton)을 이용하여 모양, 압축력, 그리고 탄력성을 유지한다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 수력적인 골격은 양성 내압(positive internal pressure)을 유지하는 탄력적인 외피로 세포의 모양을 유지하기 위한 세포질의 압력을 조절하는데 중요한 역할을 한다. Brownell은 OHC이 전기적인 환경이 변할 때 그 직경과 길이의 변화가 일어남을 알아내었다. OHC을 분리하여 탈분극시키면 세포 내부는 보다 positive상태로 변하고 그 길이는 길어지고 얇아지게 된다. 이 일련의 과정을 Dallos는 motor action으로 설명하였다.^16)17)18) 그러나, 이러한 일련의 변화를 위해서는 일정한 세포 용적(volume)을 함유한 상태를 유지하여야 한다. 저자들은 OHC에서 발현된 TonEBP가 삼투변화에 의한 slow motility의 기전을 설명하는데 도움을 줄 것으로 생각하지는 않는다. TonEBP mRNA는 고장성 환경에 노출된 지 12시간 후 절정에 이르고 SMIT, BGT1, 그리고 AR 등이 18시간 후 절정에 이르는 것으로 되어 있다.³⁾ 이 시간은 수초 내에 발생하는 OHC의 slow motility에 비하여 너무 오랫동안 반응하기 때문이다. 그러나, 저자들은 OHC이 그 모양을 유지하고 기능을 유지하기 위해서, 어떠한 삼투압의 코르티림프 환경에서도 일정한 용적과 이온의 조성이 필요하므로 여기에 TonEBP가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
   본 실험에서 OHC외에, 기능이 잘 알려져 있지 않은 Deiter 세포, 나선연의 결합조직, 나선연의 섬유세포, 그리고 고실계와 접한 상피세포에서 발현되었다. 나선인대의 섬유세포는 와우측벽에서 혈관선조를 지지해주는 구조물로 여겨왔으나, 최근 체액의 전달과 이온 농도차를 유지시키는데 중요한 구조물로 알려졌다.⁹⁾ Spicer와 Schulte는 carbonic anhydrase, creatine kinase, Na-K ATPase를 기준으로 나선인대의 섬유세포를 1형에서 4형으로 나누었으며, 1형, 2형 섬유세포가 K＋이온의 재 순환에 중요한 역할을 한다고 하였다.⁸⁾ 본 연구에서는 전반적으로 나선인대 섬유세포에서 TonEBP가 발현되었으며, 특히 3형에서 강한 양성을 보였다. 또한, Deiter 세포는 OHC의 지지구조물로만 여겨져 왔으나, 신경접합섬유가 존재하는 것으로 알려져 있고,¹⁹⁾ 내형질세망(endoplasmic reticulum)과 미토콘드리아가 발달되어 있는 것으로 미루어 물질 전달 역할(transporting activity)을 갖고 있을 것으로 생각되어진다.⁹⁾ 본 연구 결과로는 이들 세포에서의 TonEBP의 역할을 추정하기는 어려울 것으로 생각된다. 하지만, 이들은 모두 혈관 주위에 있는 세포들이다. 이 부위는 혈액-외림프 장벽을 넘어온 삼투성 물질에 쉽게 접하는 부위로, 와우내 다른 세포들에 비하여 삼투조절 능력이 보다 필요한 부위라고 생각된다.
   Miyakawa 등에 의해 최근 발견된 TonEBP는 고삼투성 환경에서 세포내 compatable osmolyte를 생산하게 하는 삼투조절기능의 중요한 단백질이다. 또한, TonEBP는 저삼투성 환경에 노출되었을 때 발현이 감소되는 양상을 보이며, 등장성 환경에서는 낮은 수준의 활성화 상태가 되고, 고삼투성 환경에서는 높은 수준의 활성상태를 보이므로, 세포내의 긴장도에 따라 증가와 감소를 보인다.³⁾ 그러나, 세포외액의 고삼투성 환경으로부터 세포내의 TonEBP가 발현하게 하는 센서(sensor)가 무엇인지 알려지지 않았고, TonEBP가 삼투조절능력 외에 어떠한 기능을 갖고 있는지 명확히 밝혀지지 않은 상태이며, 세포외액의 이온 변화에 따른 연구도 계속 진행 중에 있다. 저자들은 본 연구로 와우내 OHC을 비롯한 여러 세포에서 삼투조절기능이 있음을 증명하였지만, TonEBP가 발현되는 세포에서의 그 기능을 정확히 알 수는 없었다. 앞으로 여러 실험 모델을 포함한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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