교신저자：김상철, 100-032 서울 중구 저동 2가 인제대학교 의과대학 서울백병원 이비인후과학교실
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서     론

   많은 환자들이 이명으로 고통받고 있으나, 이명 발생의 정확한 기전에 대해서는 아직도 논란이 많아 치료에 있어 걸림돌이 되고 있다. 본 연구에서는 Jastreboff에 의해 주장된 실험동물의 이명 모델을 기초로 하여 이명의 기초 병태 생리를 좀 더 명확하게 밝혀 보고자 한다.¹⁾²⁾ 살리실산은 사람이나 동물에서 이명을 유도시키는 물질로 널리 알려져 있다.³⁾⁴⁾ 저자들의 연구는 살리실산으로 이명이 유도된 실험 동물과 동량의 생리식염수로 처리한 비교실험 동물군사이의 c-fos 면역조직염색 발현을 비교해 보는 비교대조군 실험이다.
   c-fos는 immediate early antigen으로 스트레스나 학습과 기억에 관련된 과정에서 중요한 조기 표식자이며, 최근 연구에서는 신경 활동성을 반영하는 선별 검사로도 사용되고 있다.⁵⁾ 기존 연구들에서 이명의 발생과정에 있어 중요하게 생각되는 부분인 중추신경계, 특히 대뇌 변연계(limbic system)에서의 유해 자극에 대한 선별인식(screening) 과정은 이명을 인지하는데 있어 가장 중요한 기전중 하나로 여겨지고 있으며 그외에도 장기간의 스트레스와 관련된 교감 신경계의 흥분성과도 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.⁶⁾
   이에 본 연구에서는 청각 중추신경계(auditory pathway)와 비청각 신경계(non-auditory pathway)로 구분하여 살리실산으로 이명이 유도된 실험 동물과 동량의 생리식염수를 처치한 비교 실험동물에서의 c-fos 면역 조직염색 발현 상태를 비교해 봄으로써 실험동물의 이명모델에서 이명이 중추신경계에서 어떠한 초기 변화를 유발시키는지 증명하여 이명의 병태 생리학적 발생기전을 연구하고자 한다.

재료 및 방법

재  료

실험동물
   실험동물은 평균체중 180~220 g 정도의 8주령 이상 Sprague-Dawley 계통의 흰쥐(대한 실험동물) 54마리를 사용하였다. 실험군 27마리와 대조군 27마리를 사용하여 총 27회의 실험을 실시하였고 성주기에 따른 오차를 줄이기 위해 수컷 흰쥐만을 사용하였으며 실험실 환경에 적응시키기 위하여 1주일 동안 안정을 시켰다. 사육환경은 소음이 없는 환경의 동물 사육장을 실내온도가 24±1°C를 유지하도록 하였으며, 낮과 밤의 주기는 12시간 light on/off system으로 조절하였고 실험기간 동안 실험동물 전용사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 동물은 시간 주기성 리듬의 영향을 피하기 위해 매번 같은 시간에 실험을 실시하였다.

이명의 유도
   실험군 흰쥐 복강 내로 살리실산(450 mg/kg)(Sigma Co. USA)를 생리 식염수에 녹여서 주사하여 이명을 유도시키며¹⁾²⁾ 비교 대조군 흰쥐 복강내로 동량의 생리식염수를 주사한 후 3시간 경과후에 ketamine(50 mg/kg)(유한양행, Korea)과 Xylazine hydrochloride(5 mg/kg)(Bayer Korea Ltd., Korea)를 주사하여 실험군과 대조군 흰쥐를 모두 마취시켰다.
   마취된 동물은 뇌를 적출하여 면역조직화학염색을 실시하였다.

조직 준비
   마취된 동물을 생리식염수와 4% paraformaldehyde(Merck, Germany)를 함유한 Phosphate Buffered Saline(PBS, 0.1M, pH 7.4)으로 심장을 통하여 관류시킨 후 뇌를 적출하여 동일한 고정액에 담가 냉장고(4°C)에서 하룻밤을 보낸 후 30% sucrose 용액에 넣고 12시간이상 방치하여 탈수시켜 조직을 고정하였다. 위에서 기술한 방법으로 적출하여 고정을 마친 뇌를 Cryo-Cut Microtome(American Optical Corp., USA)을 이용하여 20~40 μm 두께로 절단한 후 쥐 뇌조직 해부 단면도를 참고로 하여 원하는 부위를 얻었다.⁷⁾ 채취한 절편을 poly-L-lysine으로 도포한 슬라이드에 붙이고 c-fos에 대한 항체(InnoGenex, USA)를 사용하여 면역조직화학염색을 시행하였다.

면역조직화학염색
   조직절편을 붙인 슬라이드를 증류수에 30분 동안 담근 후 Triton X-100(Sigma Co., USA)(0.3%)을 함유한 PBS에서 30분간 방치한 후 PBS로 조직을 세척하였다. 0.3% 과산화수소수를 조직에 처리하여 endogenous peroxide의 활성을 차단시켰다. 조직을 충분히 세척한 후 10% normal gout serum(NGS)(Vector Laboratories, Inc., USA)와 1% bovine serum albumin(Vector Laboratories, Inc.,USA)를 함유한 PBS 용액으로 1시간 동안 처리하였다. c-fos에 대한 항체(InnoGenex, USA)를 PBS 용액에 10 μg/ml로 희석하여 4°C에서 24시간 이상 반응시켰다. 반응 후에 PBS(0.1% Tween 20 함유)로 세척하고 1% NGS, 3% NGS를 함유한 PBS로 각각 30분간 처리한 후 2차 항체로 streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate(20배 희석)를 20분간 반응시킨후 ABC 용액(Vectastatin from Vector Laboratories, Inc., USA)을 1시간 동안 처리하였다. PBS로 세척한 후 peroxide substrate solution(DAB)(Vector Laboratories, Inc., USA)을 첨가하여 5~10분간 반응시켰다. 증류수로 세척 후 Xylene에 담그고 마운트 용액을 이용하여 표본을 완전고정 시켰다. 대조군도 같은 방법의 염색을 동시에 시행하였다.

관     찰

   광학현미경(Zeiss, Germany)을 사용하여 뇌의 여러 비교 부위 조직을 관찰하였으며 면역 양성 반응 조직을 확인한 후 사진을 촬영하였다. 관찰 비교 대상부위는 문헌 고찰에 따라 이명 발생과 연관성이 있다고 언급된 청각 중추 신경계와 비청각 중추 신경계로 구분하여 관찰하였으며, 상행성 청각 경로의 신경핵 중 와우핵(Cochlear Nucleus, 이하 CN으로 약함), 상올리브복합체(Sup. Olivary Complex, 이하 SOC로 약함), 외측 게제핵(Lat. lemniscus, 이하 LL로 약함), 하구(Inf. Colliculus, 이하 IC로 약함), 내측 슬상체(Med. Geniculate Body, 이하 MGB로 약함), 청각피질(Auditory Cortex, 이하 AC로 약함)등을 관찰하였다.^8)9)10) 비청각 중추 신경계에서는 타 문헌 고찰을 통해 다른 연구에서 사용되었던 부위중 연수에 위치한 부상완신경핵(ParaBrachial Nucleus, 이하 PBN으로 약함), 뇌교 부위에서 관찰가능한 청반(Locus Ceruleus, 이하 LC로 약함), LC에 인접한 부위인 거대세포중뇌 삼차신경핵(magnocellular mesencephalic trigeminal nucleus, 이하 MMTN 으로 약함), 중뇌의 도수관(aqueduct) 주위의 수조주위 회백질(PeriAqueductal Gray, 이하 PAG로 약함), 대뇌 변연계에 속하는 편도핵(Amygdala nucleus, 이하 AN으로 약함)등을 관찰하였다.⁹⁾

결     과

   일반적으로 뇌와 뇌간 전체를 거쳐 나타나는 c-fos의 면역학적 반응은 매우 낮았다. 살리실산을 투여한 실험군에서 c-fos에 대한 면역조직화학반응 양성세포의 발현이 LC에서 나타났고, 생리식염수를 주입한 대조군에서는 동일한 영역에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 관찰되지 않았다. c-fos 면역조직화학반응 양성세포의 발현은 뇌 반구별로 차이를 나타내지 않았다. 다른 청각 뇌간 신경핵들은 처치 효과에 따른 c-fos 면역조직화학반응 양성세포에 있어서 차이를 보이지 않았다. 소뇌에서는 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 실험군과 대조군 모두에서 나타났다. 실험결과는 각각의 실험에서 모두 일치했다.

청각 중추 신경핵
   청각 중추 신경핵에서는 실험군과 대조군 사이의 처치에 따른 변화가 거의 없었다. 하부 청각 중추 신경핵부터 상부 청각 신경핵까지 따라 올라 가면서 살리실산을 처치한 실험군과 생리식염수를 처치한 대조군의 c-fos 면역조직화학반응 양성세포 발현양상을 비교하였다. 실험군과 대조군 모두에서 CN는 항상 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 발견되며, 복측 핵보다는 배측 핵에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 더 밀집된 양상으로 나타난다(Fig. 1). IC는 실험군과 대조군에서 모두 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 관찰되지 않았다. 그외 상행성 청각 중추 신경경로인 SOC, LL, MGB, AC에서도 실험군과 대조군에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 발현되지 않았다.

비청각 중추 신경핵
   흰쥐에서 LC는 뇌교 부위에서 PeriVenricular Grey 외측벽의 세포들이 길어져서 구성되어 있는 중간크기의 신경핵으로 LC에서 살리실산 처치 세시간 경과 후 관찰한 결과, c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 많이 밀집되어 있었다. 실험군에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들은 LC의 배측부로부터 복측부까지 발현된 반면에 생리식염수를 사용한 대조군에서는 LC에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 전혀 나타나지 않았다(Fig. 2). LC에 인접한 부위인 MMTN에서도 확연히 구분되어 지는 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 관찰되며, 이곳에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들의 발현은 실험군과 대조군에서 차이를 보이지 않았다.
   그외 과거 여러 다른 연구자들에 의해 언급된 비청각 중추 신경계를 따라 관찰하였으나 실험군과 대조군에서 유의한 차이를 발견할 수 없었다.

고     찰

   전체 뇌 조직에서 c-fos 면역조직화학염색은 전반적으로 매우 낮게 발현되는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾¹²⁾ 문헌 고찰에 따르면 IC의 복측 신경핵들에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포가 발견될 수 있는데 이것은 살리실산 처치 후 청력 입력을 받은 핵들일 가능성이 많다고 하였으나 본 연구에서는 이러한 현상이 관찰되지는 않았다.¹³⁾¹⁴⁾ 방음환경에서 실험을 실시하였으며 최대한 소리에 노출되지 않도록 했던 것과 상관있었던 것으로 사료되나 이에 관한 연구는 더 필요할 것으로 사료된다. 실험군이나 대조군 모두에서 청각 중추 신경핵인 IC의 신경핵에서는 거의 면역반응이 나타나지 않았다. 반면에 청각 중추 신경계가 아닌 부위에서 면역조직화학염색반응이 일어나는 것이 관찰되었다. 살리실산을 주사한 실험동물에서 비청각 중추 신경계인 뇌간의 LC 부위에 경계가 잘 지어진 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 관찰되는 반면, 생리식염수 처치 후에는 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 관찰되지 않았다. 흰쥐에서 LC는 뇌교 부위에서 PeriVentricular Grey 외측벽의 세포들이 길어져서 구성되어 있는 중간크기의 신경핵으로 배측 부위에 밀집된 많은 신경핵들과 복측 부위의 적고 성긴 신경핵들로 구성되어 있으며 Norepinephrine을 합성, 분비하는 곳으로 알려져 있고 다른 신경핵과의 Norepinephrine 연결 경로는 LC에서 시작하여 뇌피에서 뇌척수까지 다양하다고 밝혀져 있다(Fig. 3).¹⁵⁾¹⁶⁾ 흥미롭게도 이 부위는 각성과 불안, 통증 및 스트레스 상태에 지배받는 영역이다. 과거의 다양한 연구에서 알려진 스트레스 혹은 유해한 자극에 의한 LC에서의 c-fos 발현과 일치하는 것을 보여주고 있다. LC는 상행성 망상 중추 신경계(ascending reticular system)에 속하며 Norepinephrine을 합성, 분비하는 신경핵으로 심혈관계 및 다양한 심부 장기에서 유입된 자극뿐만 아니라 여러가지 스트레스나 불안상태에서 LC에서 신경핵의 면역염색발현이 증가하는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ LC와 청각 중추 사이에는 다양한 연결로가 있는데 특히 LC는 CN, IC, MGB, AC와 관련되어 있고, 뿐만 아니라 대뇌 변연계인 AN로도 연결되어 진다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 과거 연구에서 PBN나 PAG는 여러 영역의 대뇌 피질 및 AN과도 연관성이 있는 것으로 알려져 있으며, 심혈관계와 혈압 및 호흡과 관련된 중추 신경핵으로 확인되었다. 따라서 심하게 흥분한 실험동물에서 약물의 영향에 관계없이 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들이 관찰될 수 있으나, 본 연구에서는 PBN나 PAG에서 c-fos 면역조직화학반응 양성세포들을 관찰할 수 없었다.^17)18)19)
   LC에서의 발현의 증가는 살리실산에 의한 직접적인 약물의 중추 신경계 작용 효과 또는 말초 수용체에 영향을 미치는 살리실산의 간접적인 효과에 의한 것이거나, 이명에 의해서 실험 동물에게 부여되는 스트레스의 결과로 나타나는 현상일 것이다. 살리실산에 의한 직접적인 영향은 청각 중추 신경계보다는 비청각 중추 신경계인 LC에서 나타났다. 살리실산이 이명을 일으킨다는 것은 동물의 행동반응을 이용한 과거 연구들에서 관찰할 수 있었으며, 이러한 이명의 자극적인 소음은 실험 동물에게 심각한 스트레스의 원인이 될 것이다. 게다가 이와 같은 스트레스에 민감한 영역과 청각 중추 신경계의 되먹이 작용(feedback mechanism)은 LC와 다른 중추 신경계와의 상호 연계 작용에 있어서 자극을 강화시켜 주는 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.^1)2)12) 중추 신경계의 청각 및 비청각 영역들 중 특정 영역들에서 상호 연계 작용의 효과는 이명 유발의 가능성을 더욱 증가 시키게 할 것이다. 이러한 연계성은 모든 청각 및 비청각핵들이 이명에 의한 되먹이 작용에 영향을 줄 수 있다는 것을 암시한다고 할 수 있겠다. 살리실산 처치 후의 청각 뇌간 신경핵에서의 발현도는 매우 낮은 반면, 상대적으로 비청각 뇌간 신경핵인 LC에서 높은 발현도를 가지는 것을 비추어 본다면 이명을 유발시키는데 있어서 하나의 원인으로 추정해 볼 수 있겠다.

결     론

   실험적으로 살리실산에 의해 이명이 유발된 흰쥐에서 청각 중추 신경계와 비청각 중추 신경계를 c-fos 면역조직화학염색 방법을 통해 비교해본 결과 비청각 중추 신경계에 속하는 LC에서 실험군과 대조군사이에 유의한 차이를 관찰할 수 있었다. 이는 스트레스에 민감한 신경핵인 LC의 발현도 증가가 이명에 관여할 것으로 추정되며 추후 신경생리적 검사를 통한 검증이 이루어져야 할것이다.

1. Jastreboff PJ, Sasaki CT. An animal model of tinnitus: A decade of development. Am J Otolayngol 1994;15:19-27.

2. Bauer CA, Brozoski TJ, Rojas R, Boley J, Wyder M. Behavioral model of chronic tinnitus in rats. Otolaryngol Head Neck Surg 1999;121:457-62.

3. Boettcher FA, Salvi RJ. Salicylate ototoxicity: Review and synthesis. Am J Otolaryngol 1991;12:33-47.

4. Jung TT, Rhee CK, Lee CS, Park YS, Choi DC. Ototoxicity of salicylate, nonsteroidal antiinflammatory drugs, and quinine. Otolaryngol Clin North Am 1993;26:791-810.

5. Morgan JI, Curran T. Stimulus-transcription coupling in the nervous system: Involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun. Annu Rev Neurosci 1991;14:421-51.

6. Senba E, Matsunaga K, Tohyama M, Noguchi K. Stress-induced c-fos expression in the rat brain: Activation mechanism of sympathetic pathway. Brain Res Bull 1993;31:329-44.

7. Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, fourth edition;1997. p.1-40.

8. Ehret G, Fischer R. Neuronal activity and tonotopy in the auditory system visualized by c-fos gene expression. Brain Res 1991;567:350-4.

9. Sandner G, Oberling P, Silveira MC, Di Scala G, Rocha B, Bargri A, et al. What brain structures are active during emotions? Effects of brain stimulation elicited aversion on c-fos immunoreactivity and behavior. Behav Brain Res 1993;58:9-18.

10. Keilmann A, Herdegen T. The c-Fos transcription factor in the auditory pathway of the juvenile rat: Effects of acoustic deprivation and repetitive stimulation. Brain Res 1997;753:291-8.

11. Wallhausser-Franke E, Braun S, Langner G. Salicylate alters 2-DG uptake in the auditory system: A model for tinnitus? Neuroreport 1996;7:1585-8.

12. Wallhausser-Franke E. Salicylate evokes c-fos expression in the brain stem: Implications for tinnitus. Neuroreport 1997;8:725-8.

13. Martin RL, Webster WR, Serviere J. The frequency organizaion of the inferior colliculus of the guinea pig: A [14C]-2-deoxyglucose study. Hear Res 1988;33:245-55.

14. Klepper A, Herbert H. Distribution and origin of noradrenergic and serotonergic fibers in the cochlear nucleus and inferior colliculus of the rat. Brain Res 1991;557:190-201.

15. Swanson LW. The locus Ceruleus: A cytoarchitectonic, Golgi and immu-nohistochemical study in the albino rat. Brain Res 1976;110:39-56.

16. Foote SL, Bloom FE, Aston-Jones G. Nucleus locus ceruleus: New evidence of anatomical and physiological specificity. Physiol Rev 1983;63:844-914.

17. Chan RK, Sauchenko PE. Spatially and temporally differentiated patterns of c-fos expression in brainstem catecholaminergic cell groups induced by cardiovascular challenges in the rat. J Comp Neurol 1994;348:433-60.

18. Singewald N, Zhou GY, Schneider C. Release of excitatory and inhibitory amino acids from the locus Ceruleus of conscious rats by cardiovascular stimuli and various forms of acute stress. Brain Res 1995;704:42-50.

19. Krukoff TL, Morton TL, Harris KH, Jhamandas JH. Expression of c-fos protein in rat brain elicited by electrical stimulation of the pontine parabrachial nucleus. J Neurosci 1992;12:3582-90.