교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후과학교실 
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서     론

   정상세포반응 혹은 염증과 같은 병태생리학적 반응에 관여하는 prostaglandin의 생합성과정에는 cyclooxygenase(COX)가 중요한 역할을 담당한다.¹⁾ COX는 arachidonic acid를 prostaglandin H₂로 변환하며 prostaglandin, prostacyclin 및 thromboxane A₂등의 생성을 유도하는 단백효소이다. COX는 두 종류의 동위효소가 있는데 이 중 COX-1은 대부분의 세포에서 발현되어 세포의 항상성 유지에 필수적으로 작용하며,²⁾ COX-2는 특정 세포에서 사이토카인³⁾이나 lipopolysaccharide,²⁾⁴⁾ 성장인자⁵⁾ 등에 의해 발현되어 세포성장이나 염증반응을 진행시키는데 중요한 역할을 하는 효소이다.
   사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현은 염증성 전구 사이토카인에 의해서 이루어지며¹⁾ COX-2에 의해 생성된 prostaglandin E₂(PGE₂)는 사람의 호흡기 염증반응에 관여한다. 이러한 염증성 전구 사이토카인에 의한 COX-2의 발현과 PGE₂의 생성에 대한 연구는 인체의 호흡기 염증반응 진행의 억제와 조절기능의 이해에 도움이 될 것이다.
   이에 저자들은 사람의 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의한 COX-2와 PGE₂ 발현양상을 관찰하고 COX-2의 발현의 조절단계를 알고자 하였다.

재료 및 방법

실험대상 및 재료
   사람의 호흡기 상피세포인 human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line(NCI-H292 cells, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 대상으로 하였다.
   COX-2 발현의 자극제로 human recombinant IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하였으며, 양성대조군으로 heat shock protein(HSP) 70을 사용하였다. 또한 IL-1β에 의한 COX-2의 발현이 전사단계에서 관여하는지 여부를 관찰하기 위하여 actinomycin D(Sigma Chemical Co., St. Louis, MN)와 cycloheximide(Sigma Chemical Co., St. Louis, MN)를 사용하였다.

세포배양 및 처리
   사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포를 6개의 실험판에 1×10⁶/ml 세포를 RPMI 1640 배양액(10% fetal calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 추가)에 37°C, 5% CO₂에서 7일간 배양하였다. 배양이 이루어지면, 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배양액에서 배양하고 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 human recombinant IL-1β를 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml 의 농도로 투여하고 37°C에서 8시간 동안 배양하여 COX-2 단백의 발현과 PGE₂의 생성양을 분석하였다.
   IL-1β에 의한 COX-2 mRNA의 발현이 전사(transcription)단계에서 조절받는지 아니면 de novo 단백이 필요한 전사후(post-transcription)단계에서 조절 받는지 규명하기 위해 전사단계 억제제인 actinomycin D(1 μg/ml)와 전사후단계 억제제인 cycloheximide(20 μg/ml)를 전처리한 후 IL-1β를 투여한 세포와 투여하지 않은 세포에서 COX-2 유전자 및 단백의 발현여부를 분석하였다.
   COX-2 단백과 PGE₂를 측정하기 위해서 시료를 처리한 NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl , 1 mM EGTA, 1% Triton X-100 and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백질을 추출하여 정량하였으며 추출한 단백을 4°C에서 보관하였다.
   모든 실험과정은 같은 결과가 5회이상 나오도록 반복하였다.

RT-PCR에 의한 COX-2 유전자의 분석
   총 mRNA의 추출은 배양한 NCI-H292 세포에서 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하였다. COX-2 유전자의 측정은 변형된 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다.⁶⁾ 총 mRNA는 무작위 hexanucleotide primer와 Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. PCR과정은 94°C에서 12분간 전처리하고 denaturation은 95°C에서 1분, annealing은 54°C에서 1분, extension은 72°C에서 1분간 22번을 반복 실시하였으며 마지막으로 72°C에서 20분간 반응하였다. PCR의 산물은 1% Tris-boric acid-EDTA(TBE) 완충용매와 2% agarose gel에서 전기영동을 이용하였다. mRNA 발현정도는 densitometry를 이용하여 정량분석하였다.
   COX-2 유전자의 primer의 염기서열은 다음과 같다.
   5'：TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT
   3'：AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT

Western blot에 의한 COX-2 단백 측정
   NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl , 1 mM EGTA, 1% Triton X-100 and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백질을 추출하여 정량을 하였다. 정량한 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 80 μg을 주입하여 2시간 동안 20 mA에서 전기영동을 하였다. 분리된 단백질을 300 mA로 3시간 동안 방치하여 니트로셀룰로오스막에 이동시킨 후, 5% non-fat milk로 비특이적 단백질 결합을 방지하였다. 일차항체인 COX-2 polyclonal antibody(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI)를 1：2,000으로 희석하여 4시간 동안 반응시킨 후, 이차항체인 goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugate(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)를 1：2,000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 세 번 세척 후 enhanced chemiluminescence(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) 시약으로 X-ray 필름에 감광시켜 COX-2 단백을 확인하였다.

EIA에 의한 PGE₂ 측정
   PGE₂의 측정은 항체(lyophilized prostaglandin E₂ conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 prostglandin E₂ enzymeimmunoassay system(EIA, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하였다. Goat anti-mouse IgG로 coating된 96 well plate에 assay buffer 50 μl와 표본을 50 μl씩 점적한 후 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 모든 well을 wash buffer(0.01 M phosphate buffer pH 7.5 containing 0.05%(ν/v) Tween ^TM20)로 4번 세척한 후 enzyme substrate 150 μl를 점적하였다. 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 1 M H₂SO₄ 100 μl를 점적하여 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다. EIA는 Amersham Pharmacia Biotech사의 protocol 2에 따라서 시행하였으며 sensitivity는 0.8 pg/well(16 pg/ml)이다.

결     과

IL-1β에 의한 COX-2 단백질의 발현
   COX-2 단백의 발현은 IL-1β의 농도가 0.02 ng/ml 부터 증가하기 시작하여 20 ng/ml 일 때 최고치에 도달하였다(Fig. 1). IL-1β투여 시간에 따른 변화는 반응 4시간부터 COX-2 단백 발현이 증가하였으며, 8시간 이후부터 최고치를 나타내고 12시간 째까지 지속되었다(Fig. 2). 양성대조군으로 사용한 HSP 70의 발현은 IL-1β의 농도와 투여시간에 관계없이 일정하였다.

IL-1β에 의한 PGE₂의 생성
   PGE₂의 생성은 IL-1β의 농도가 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml로 증가함에따라 1.4, 3, 5.6, 7.9 ng/ml로 증가하였다(Fig. 3). 반응시간에 따른 PGE₂의 생성결과는 COX-2 단백의 발현과 동일한 양상으로 반응 4시간부터 PGE₂ 생성이 증가하였으며, 8시간 이후부터 최고치를 나타내고 12시간 째까지 지속되었다(data not shown).

COX-2 유전자와 단백의 발현 및 전사단계의 관련여부
   IL-1β(20 ng/ml)를 투여했을 때 COX-2 유전자의 발현이 증가하였다. 전사단계 억제제인 actinomycin D를 전처리한 세포에서는 COX-2 유전자와 단백의 발현이 억제되었으나, 전사후단계 억제제인 cycloheximide를 전처리한 세포와 전처리하지 않은 세포사이에 COX-2 유전자의 발현은 차이가 없었다(Fig. 4).

고     찰

   Cyclooxygenase는 세포 혹은 조직내에서 다양한 생리 활성 작용을 나타내어 혈관확장이나 부종, 발열, 염증반응 등을 유발하는 prostaglandin의 생합성과정에 중요한 역할을 담당한다.¹⁾ 사람의 호흡기에서 COX-2의 발현에 의해 생합성된 prostaglandin에 의해서 염증반응이 일어난다.⁷⁾⁸⁾ 그래서 많은 연구자들이 사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현과 prostaglandin 생성 조절에 연구초점을 맞추고 있다.¹⁾⁸⁾ 또한 IL-1β는 급, 만성 상기도 감염에서 중요한 역할을 하는 염증성 전구 사이토카인 중 하나이며 천식이나 기관지염, 기관지 확장증과 부비동염 등과 같은 염증성질환의 병인에 직, 간접적으로 관여한다.⁹⁾¹⁰⁾
   본 연구는 전구성 사이토카인인 IL-1β가 호흡기 염증반응에 큰 역할을 하는 COX-2와 prostaglandin의 발현에 어떻게 관여하는지를 알아보고자 하였다. 먼저 사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 COX-2 단백의 발현은 IL-1β의 용량에 비례하여 상향 조절되는 것을 관찰할 수 있었고, IL-1β투여 4시간 째부터 COX-2 단백이 생성되며 12시간까지 생성이 지속되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 인체 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현에 의한 PGE₂의 생성도 IL-1β의 용량에 비례하여 상향 조절되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 NCI-H292 세포주에서 TNF-α에 의한 COX-2의 발현과 PGE₂의 생성이 TNF-α의 용량과 시간에 비례한다는 Chen 등¹⁾의 보고와 자극제로 사용된 사이토카인의 종류는 다르지만 일치하는 소견이었다. 본 연구의 결과는 A549 세포주에서 PGE₂의 생성이 IL-1β투여 1시간 째부터 일어나며 6시간 째에 최고치에 이르고 12시간까지 지속된다는 Lin 등¹¹⁾의 보고와 발현시간의 차이는 있었으나 비슷한 경향이었다. 이외에 IL-1β와 COX-2의 관계에 관한 연구결과는 사람의 치주조직¹²⁾과 기도평활근,^12)13)14) 원숭이의 기질내 섬유아세포¹⁵⁾ 등에서 IL-1β에 의해 COX-2의 발현이 증가된다는 보고가 있다. 특히 사람의 기도평활근의 경우 IL-1β와 oncostatin을 같이 처치했을 경우 COX-2의 발현증가에 상승작용이 있다고 보고되었다.¹⁶⁾ 또한 IL-1β뿐만 아니라 TGF-β1같은 염증매개물질의 경우 사람의 기도평활근에서 transforming growth factor-β1(TGF-β1)이 COX-2의 발현을 증가시켰다는 보고¹⁷⁾가 있으며, Moore 등¹⁸⁾은 TNF-α 단독으로는 COX-2의 발현이 증가되지 않았지만 IL-1β와 TNF-α를 같이 처치했을 경우에는 COX-2발현이 증가한다고 보고하였다.
   COX-2 발현의 조절단계를 알아보고자 전사단계 억제제인 actinomycin D와 전사후단계 억제제인 cycloheximide를 전처리하고 COX-2의 발현여부를 관찰하였다. Actinomycin D를 전처리한 경우에는 COX-2 유전자 및 단백의 발현이 억제되었으나, cycloheximide를 전처리한 경우에는 COX-2 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다. 이는 COX-2의 발현이 전사단계에서 조절됨을 나타낸다. 그러나 이러한 결과는 A549 세포주에서 전사단계 억제제인 actinomycin D(1 μM)와 전사후단계 억제제인 cyclohex-imide(10 μM)을 사용했을 때 두 가지 모두에서 IL-1β에 의한 COX-2의 발현이 억제된다는 보고¹¹⁾¹⁹⁾와 상반된 결과이다. 이는 사용된 세포주의 차이나 혹은 자극제로 사용된 사이토카인의 농도차이일 가능성이 높을 것으로 생각된다.
   이상을 종합해보면 사람의 호흡기 염증반응에 관여하는 COX-2 발현과 PGE₂의 생성은 배양 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 IL-1β의 용량과 시간에 비례하며 전사단계에서 조절됨을 알 수 있었다. 그러나 보다 구체적인 호흡기 염증에 대한 이해와 치료가 시행되기 위해서는 IL-1β에 의해서 COX-2가 발현된다는 사실도 중요하지만 이 과정에 관계된 신호전달체계에 대한 추가적인 연구가 시행되어야 할 것이다.

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