교신저자：노영수, 134-701 서울 강동구 길동 445 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   두경부 편평세포암종은 세포의 이질성이 많아 진행양상이 다양하며 예측 이 어렵고 발생부위 별로 다양한 생물학적 특성과 전파경로를 가진다. 또한 국소 침습성이 강하며 주로 조기 림프절로 전이가 흔하고 비록 진행된 병기의 암일지라도 국소성이 높아 조기에 발견하여 치료하면 좋은 예후를 기대할 수 있는 특징을 가지고 있다.¹⁾ 현재까지 알려진 두경부암에 대한 예후 판정인자로는 원발 암종의 위치와 크기, 경부 또는 원격전이의 유무, 병리조직학적 분화도 등이 임상적으로 이용되고 있고 최근 종양의 생물학적 표지자, 종양세포주기분석, 암유전자 및 종양억제 유전자에 대한 연구가 활발히 진행되어 두경부 암의 예후와의 관련성에 대한 결과들이 보고되고 있다.²⁾ 그러나 두경부 편평세포암종에서의 국소 침윤 및 전이에 관한 연구는 아직까지 미흡하여 좀더 객관적인 종양세포의 성장, 주변조직으로의 침윤 또는 전이능을 반영하는 생물학적인 표지자에 대한 연구가 필수적일 것으로 생각된다.
   암의 국소침윤과 전이는 기저막을 파괴한 후 기질에 침윤하여 전이를 유발하게되는데 기질내 종양세포와 주변의 간질세포는 여러종류의 단백분해 효소를 분비함으로써 침윤과 전이를 초래한다.³⁾⁴⁾
   그 중 Matrix metalloproteinases(MMPs)는 Zinc-dependent endopepti-dases family로 MMP gene family는 약 20종류로 구성되어 세포외 기질의 구조성분을 분해하는 성질을 가진 분해효소로 각각의 특이 구조에 따라 collagenase, gelatinase, stromelysin, matrilysin, membrane-type MMP의 subfamily로 나뉘어 진다. MMPs는 인체내 정상 remodeling 과정에 관여하며 태생기 성장, 조직재생, 혈관형성(angiogenesis) 등의 과정 및 병적 상태인 류마티스 관절염, 치주염, 피부의 자가면역성 수포성 질환 등의 경우에도 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   이 중 MMP-13(Collagenase-3)은 유방암 조직에서 새로이 발견된 종류로서 다른 MMPs와 비교할때 예외적으로 기질 특이성이 광범위한 특징이 있다.⁵⁾ 즉 생화학적 작용이 매우 강력하여 모든 fibrillar collagen, 특히 collagen type II를 매우 효과적으로 분해시키는 효소로 알려져 type II collagen이 많은 articular cartilage surface의 대사회전(turnover)에 중대한 역할을 하여 골관절염나 류마티스 관절염 등과의 연관이 보고되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 뿐만 아니라 MMP-13은 large cartilage proteoglycan과 type IV collagen, fibronectin, tenacin을 포함한 세포외 기질 성분과 기저막(basement membrane)을 분해시킨다는 보고도 있다.⁷⁾⁸⁾ 또한 chondrosarcoma의 암세포에서 MMP-13의 발현에 대한 연구에서는 모든 chondrosarcoma 암세포에서 MMP-13의 발현이 관찰되었으며 반면 정상세포에서는 25%에서만 발현되었다고 보고하였다.⁶⁾
   이에 두경부 편평세포암종에서 주변 조직으로의 침윤 및 전이를 반영하는 생물학적 표지자로서 MMP-13에 대한 연구를 시행하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1997년 4월부터 1999년까지 3월까지 한림대학교 의과대학 강동성심병원 이비인후-두경부외과학 교실에서 두경부 편평세포암종으로 진단받고 수술을 시행받은 35예의 환자를 대상으로 하였다. 환자의 의무 기록지 및 병리조직 검사결과지를 토대로 성별, 연령, 미국 암학회(American Joint Commitee on Cancer；AJCC, 1997)의 TNM 체계에 따른 원발성 종양의 크기 혹은 국소 침범정도(size and/or local invasion of the primary tumor；T), 경부 림프절 전이여부(regional lymph node metastasis；N), 조직병리학적 분화도, 재발여부, 무병생존기간(disease free survival time)등을 후향적으로 분석하였다. 성별은 남자가 29예, 여자가 6예, 연령은 34세부터 86세까지로 60세 미만이 19예, 60세 이상이 16예이었고 평균연령은 57.2세이었다. 원발병소로는 후두암이 13예, 구강암 7예, 구인두암 7예, 하인두암이 4예, 상악동암 3예, 피부암 1예였고, 원발 병소 병기로는 T1 3예, T2 12예, T3 9예, T4 11예이었다. 병리조직화학적 분화도는 고분화군 19예, 중분화군 16예였고 저분화군은 없었고 수술 후 병리적 림프절 전이는 14예에서 관찰되었고 21예에서는 전이가 없었다. 평균추적관찰기간은 11.3개월이었다.
   연구재료는 수술시 적출된 종양을 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친후 hematoxylin-eosin(H-E) 염색을 시행하여 광학 현미경하에서 조직학적 유형과 등급을 정한 다음 보관상태가 양호한 조직을 선택하였다.

방  법

면역조직화학적 염색
   Labelled streptavidin-biotin kit(DAKO LSAB Kit, Peroxidase System40, K680, DAKO Corp., Copenhagen, Denmark)를 사용하여 면역조직화학적 염색을 하였다. 파라핀 블록을 4 μm두께로 박절하여 슬라이드에 부착시킨후 xylene에 5분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하고, 계열별 ethanol에 처리한 후 증류수로 함수시켰다. 내인성 과산화 효소의 활동을 억제하기 위하여 3% H2O2가 포함된 methanol 용액에 20분간 처리하고 일차 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 정상 염소혈청에 30분간 처리한 후 일차 항체인 MMP-13(purified mouse monoclonal antibody 181-15A12, Oncogene, Cambridge, USA)을 5% 소혈청 알부민을 함유한 희석액을 이용하여 1：20으로 희석하여 4에서 16시간 동안 반응시켰다. tris 완충액으로 세척한 후 biotin이 부착된 anti-mouse 항체(2차 항체, K0534, DAKO, Carpinteria, USA)를 30분간 반응시키고 tris 완충액으로 세척한 후 streptavidin-peroxidase를 실온에서 약 10분간 반응시켰다. 발색제인 DAB(DAKO, Carpinteria, USA)로 약 5분간 반응시키고, Hematoxyline으로 약 3분간 대조염색을 시행한 후, Semisynthetic crystal mount(DAKO, Carpinteria, USA)로 mounting한 후, cover glass로 덮어서 광학현미경으로 관찰하였다. 구강 편도적출시 채취한 정상 점막조직 10예를 상기 방법으로 염색하여 비교 분석하였으며, 음성대조군으로는 일차항체대신 tris 완충액을, 양성대조군으로는 유방암조직을 사용하였다.

판정 및 통계분석
   판정은 종양의 비교적 세포의 밀도가 높은 부위를 임의로 3~5곳을 선정하여 400배 시야에서 1000개의 종양세포당 세포질내에 중증도 이상의 적갈색의 과립이 관찰되는 세포의 수를 세어 백분율을 구하여 5%이상 염색된 것을 양성으로 판정하였다.⁹⁾ 통계처리는 윈도우형 SPSS 통계 프로그램을 사용하였으며 이들의 발현 양상과 임상병리학적 인자들과의 관계는 Chi-square와 Fisher's extract 검정으로 분석하였고 Kaplan-Meier 법을 이용하여 무병기간 곡선을 그리고 각 집단간의 차이는 log-rank법을 이용하여 비교 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05를 의의있는 것으로 하였다.

결     과

   전체 35예 중 23예(67%)에서 MMP-13에대한 면역조직화학적 염색에서 양성을 보였고, 종양세포의 세포질에서 적갈색으로 염색이 되었다. 정상점막조직(Fig. 1) 10예 모두에서는 염색이 되지 않았다.

면역조직화학적 발현양상
   면역조직화학적 염색상 양성을 보인 23예 중 17예(74%)에서 종양의 중심부(center)보다는 가장자리(periphery)에서 뚜렷하게 염색이 되었다. 원발 병소별로는 면역조직화학적 염색상 양성을 보인 후두암 9예 중 6예, 구강암 및 구인두암(Fig. 2)으로 각 각 4예 중 3예, 하인두암 경우 3예 모두에서, 상악동암 2예 중 1예, 그리고 피부암 1예에서 가장자리에서 강한 염색을 보였다. 원발 병소에 따른 발현율의 차이는 없었다(Table 1).

성별 및 연령과 MMP-13의 발현
   총 35예 중 남자가 29예(82.9%), 여자가 6예(17.1%)이었다. 29예의 남자 중 MMP-13은 19예(65.5%)에서 양성을 보였고, 6예의 여자에서는 4예(66.7%)에서 양성을 보였다. 연령별 분포에 있어 60세 이상이 16예(45.7%), 60세 미만이 19예(54.3%)이었다. 60세 이상인 군에서 MMP-13의 양성은 10예(62.5%)이었고, 60세 미만인 군에서는 13예(68.4%)에서 양성을 보였다. 성별 및 연령별 각각의 두 군과 MMP-13의 발현사이의 통계적 유의성은 없었다(Table 2).

원발병소 및 림프절 전이와 MMP-13의 발현
   원발병소의 병기에 따른 분류는 T1이 3예(8.6%), T2가 12예(34.3%), T3는 9예(25.7%), T4는 11예(31.4%)이었다. T1에서는 MMP-13의 양성은 한 예도 없었고(0%), T2에서는 7예(58.3%), T3에서는 7예(77.8%), T4에서는 9예(81.8%)에서 양성으로 병기가 진행할수록 발현정도가 의미있게 증가되었다(p<0.05).
   수술 후 림프절 전이가 있었던 경우는 14예(40%)이였고, 없었던 경우는 21예(60%)이였다. 림프절 전이가 있었던 14예 중 원발병소에서 MMP-13 양성을 보인 경우는 9예(64.3%)였고, 전이가 없었던 경우에서는 14예(66.7%)에서 양성을 보여 두 군사이의 통계적 유의성은 없었다(Table 3).

병리학적 병기(Stage)와 MMP-13의 발현
   총 35예 중 stage 1는 2예(5.7%), stage 2는 6예(17.1%), stage 3는 7예(20%), stage 4는 20예(57.1%)이었다. 각 병기별로 MMP-13의 양성은 stage 1은 0예(0%), stage 2는 3예(50%), stage 3는 5예(71.4%), stage 4는 15예(75%)이었다. 병리학적 병기가 높아질수록 MMP-13의 발현율이 높아졌지만 통계적 유의성은 없었다(Table 4).

조직학적 분화도와 MMP-13의 발현
   총 35예 중 고도분화군은 19예(54.3%), 중등도분화군은 16예(45.7%)이었다. 저분화도의 조직이 한 례도 없어서 분화도에 의한 발현율에 대한 통계를 구할 수 없었다. 고도분화군에서는 11예(57.9%), 중등도분화군에서는 12예(75%)에서 양성을 보였고, 두 군 사이의 통계적 유의성은 없었다(Table 5).

재발에 따른 MMP-13의 발현
   전체 35예 중 모든 치료 종료 후 7예에서 재발을 보였으며 이중 원발부위 재발이 4예로 가장 많았고, 경부재발이 2예, 원발 및 경부재발이 1예이었으며, 원격 전이는 없었다. 재발한 군의 일차 수술시 원발 병소에서의 MMP-13의 양성은 6예(85.7%), 재발하지 않은 군에서는 17예(60.7%)에서 양성을 보였고 두 군 사이의 통계적 유의성은 관찰할 수 없었다(Table 6).

MMP-13발현과 무병생존율과의 관계
   환자의 추적 관찰 기간이 최장 30개월 최소 6개월이었고 평균 추적 관찰 기간이 11.3개월로 비교적 짧았기 때문에 의미 있는 평균 생존 기간(mean survival time)을 구할 수 없었다. 평균 무병 생존기간(mean disease-free survival time)은 10.5개월이었고 MMP-13의 발현이 된 군에서의 평균 무병기간은 9.96개월, 발현이 되지 않은 군에서의 평균무병기간은 11.5개월이었고 log rank 법을 이용한 두 군 사이의 통계적 유의성은 없었다(Fig. 3).

고     찰

   악성 종양의 국소 침윤과 전이에 있어서 가장 중요한 것은 기저막(basement membrane)과 종양세포의 상호 작용이다.¹⁾ 정상적으로는 기저막으로 종양세포의 이동은 일어나지 않는다. 기저막을 통한 종양세포의 침윤은 세단계 과정을 통해 일어난다고 생각되어지는데 첫 번째는 종양세포가 기저막에 부착하고, 두 번째 단계로는 종양세포에 의해 분비된 단백 분해효소에 의해 기저막에 파손을 야기하는 것이고, 세 번째 단계로는 기저막의 결손 부위를 통해 종양세포가 이동하여 주위의 결합조직으로 전파되는 과정이다. 또한 혈관세포의 기저막을 종양세포가 침범하여 혈류를 통해 원격장기로 이동한 후 장기의 기저막을 분해해 원격전이가 일어난다. 이러한 일련의 과정이 종양의 성장과 전이과정을 통해 반복되어진다.¹⁰⁾ 따라서 종양의 침윤에 있어서 기저막의 침범이 가장 중요한 단계임은 의심할 여지가 없다. 체내에 존재하는 단백분해효소는 serine-, aspartic-, cysteine-, threonine-, matrix metalloproteinase 등 5가지가 존재하며, 특히 serine-, cysteine-, matrix metalloproteinases 등은 종양세포에서 분비되어 이러한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
   그 중 MMP-13은 유방암조직에서 최근에 발견된 새로운 MMP로서 다른 MMPs와 비교할 때 예외적으로 기질 특이성이 광범위한 특징이 있다. 즉 fibrillar typeI, II, III collagen 뿐만 아니라 type IV, IX, X collagen, gelatin, tenascin, fibronectin 그리고 proteoglycan 등을 분해한다고 알려져 있다.⁷⁾¹¹⁾ 비활성 MMP-13은 두경부 편평세포암종에서 증가되어 나타나는 stromelysin-1(MMP-3), 72-kDa gelatinase(MMP-2), MT1-MMP(MMP-14), 그리고 plasmin 등에 의해 생체외(in vitro)에서 활성화되고, tissue inhibitors of metalloproteinase(TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3)등에 의해 억제되어지는 것이 관찰되었다.⁸⁾¹²⁾
   한편 MMPs 종류에 따라 기원하는 세포가 다르다고 알려져 있는데 MMP-1, MMP-10 그리고 MMP-11의 발현은 두경부 편평세포암종의 종양세포 뿐만 아니라 간질세포에서도 관찰되었고 MMP-13을 활성화시키는 MMP-2와 MT1-MMP(MMP-14)은 간질세포에 국한되어 발견되었고 MMP-3은 정상 편평세포에서 발현되었다.¹³⁾ 이러한 점으로 미루어 볼 때 두경부 편평세포암종의 국소 침범에 의한 주위 간질조직의 파괴는 간질세포에서 유도된 단백분해효소에 의해 MMP-13과 같은 종양세포 기원의 비활성 단백 분해효소가 활성화되고, 이를 포함한 종양세포와 주위 간질 세포와의 상호작용에 의한 것으로 추정된다. 본 연구에서 종양의 중심부보다는 가장자리에서 MMP-13의 발현이 증가되어 나타난 이유도 여기에서 찾을 수 있을 것으로 생각된다.
   또한 Johansson 등¹⁴⁾의 연구에 의하면 편평 세포암종에서 MMP-13 mRNA의 발현은 tumor necrosis factor(TNF)-α, transforming growth factor(TGF)-β, keratinocyte growth factor(KGF) 그리고 basic -fibroblast growth factor(FGF) 등에 의해 상향 조절되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 관찰은 염증세포기원의 TNF-α, TGF-β가 편평세포암의 MMP-13의 발현의 증가에 기여한다는 것을 의미한다. 그리고 편평세포암에서 MMP-13의 발현은 여러 cytokine과 성장인자에 감수성을 가진다는 것을 나타낸다. 이 결과 또한 MMP-13의 발현은 세포-세포주위 간질사이의 상호작용에 의한 것임을 나타내는 것이고 단백분해효소(종양세포 및 간질세포)-성장인자(염증세포)-세포주위기질의 상호작용에 의한 복잡한 과정의 산물임을 알 수 있다. 최근의 연구에서는 인간의 정상 피부의 섬유아세포(fibroblast)가 프리스틱에 배양되었을 때는 MMP-13의 표현이 없었으나, 3차원적 collagen과 배양했을 때는 MMP-13의 발현이 상당히 유도된 것을 밝혀냈고, 이것 또한 편평 세포암종의 기질세포의 MMP-13의 발현에 있어 세포와 기질사이에 상호작용이 있다는 것을 보여 주었다.
   한편 Cazorla 등¹⁵⁾은 northern blot을 이용한 MMP-13 mRNA 발현에 대한 연구를 사람의 정상 후두 점막과 후두 편평세포암종에서 시행하였다. 연구결과 정상 후두점막에서는 일관성있게 MMP-13의 발현을 관찰할 수 없었고 악성변환된 세포에서 관찰할 수 있었다. 그리고 MMP-13 mRNA의 발현율은 국소침범정도가 심할수록 통계적으로 유의하게 증가되었고, 또한 조직학적 분화도에서도 저분화도보다 고도 및 중도 분화도에서 통계적으로 유의있게 증가하였다. 이전의 연구에서 다른 종류의 MMP의 과표현(overexpression)이 두경부 편평세포암종의 분화도와 관계가 있는 것이 밝혀져 있고,¹⁶⁾ 이것은 종양의 분화도가 이러한 효소의 과표현에 역할을 미친다는 것을 추측할 수 있다. 본 연구에서도 편도의 정상 점막 10예 모두에서 MMP-13의 발현을 관찰할 수 없었으나, 악성종양 조직에서는 66.7%(23예)에서 발현되어 여러 논문들과 유사한 결과를 얻을 수 있었다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 또한 원발병소의 병기가 진행할수록 발현율은 통계적으로 유의 있게 증가하였다(p<0.05). 그러나 종양 침범의 진행된 상태인 림프절 전이 및 병리적 병기와 발현율 사이에는 의미있는 결과를 얻을 수 없었는데 그 이유는 앞에서 언급한 원발 병소 주위의 간질세포에서 분비되는 cytokine 및 여러 성장인자 등과의 상관 관계가 영향을 미칠 것으로 생각되어 지고 또 다른 이유는 비활성 MMP-13을 활성화시키는 인자와의 연관성 때문이 아닐까 생각되어 진다. 그러나 림프절 전이를 포함한 병리학적 병기에 따른 MMP-13의 발현에 있어서 통계적 유의성은 없었지만 병기가 진행될수록 발현은 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(p＝0.056). 좀 더 많은 증례를 포함시켜 작은 표본에 의한 신뢰도(reliability) 감소를 보완한다면 병리학적 병기에서도 의미 있는 결과를 기대할 수 있고, 예후적 지표로서의 역할도 기대할 수 있을 것으로 기대된다. 그 외 림프절 전이여부, 성별, 나이와 MMP-13사이의 상관성은 밝힐 수 없었다.
   Vaalamo 등¹³⁾도 그의 연구에서 원발병소는 작지만 침습도가 강한 종양에서는 MMP-13이 발현되는 반면 상피내암(carcinoma in sinu)에서는 발현이 되지 않는 점으로 보아 MMP-13은 편평세포암의 침습도(invasiveness)를 나타내는 지표라 하였다. 이러한 점으로 미루어 볼 때 MMP-13은 종양세포에서 특별히 유도된 단백분해효소의 하나임을 강력히 추정할 수 있고, 이 결과를 기초로 볼 때 이 효소가 편평 상피세포암종의 진행에 역할을 한다고 추측할 수 있다. 이러한 가정은 MMP-13이 폭넓은 기질 특이성을 가진 강력한 단백 분해효소라는 생화학적 특성을 고려 할 때 쉽게 동의 할 수 있다. 그러나 본 연구에서는 저분화도의 표본조직이 없어 분화도에 따른 상관관계에 대해서는 알 수가 없어 아쉬웠다. 하지만 이 부분도 앞으로 더 많은 증례에 대해 연구를 한다면 분화도가 MMP-13의 발현에 미치는 영향, 더 나아가 침습도 및 예후와 분화의 상관관계에 대해서도 귀중한 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대한다. MMP-13이 비교적 최근에 발견되었고 특히 두경부 편평세포암종에 대한 적용이 최근이라 현재까지 생존율과 MMP-13의 발현과의 상관관계에 대한 보고한 연구는 없는 실정이며 본 연구에서도 환자의 추적기간이 짧아(11.3개월) 평균생존기간(mean survival time)에 대한 의미 있는 통계는 구할 수 없었다. 평균 무병생존기간(mean disease-free survival time)에서는 통계적 유의성은 없었으나, MMP-13 발현 군이 9.96개월로서 비발현군의 11.5개월에 비해 짧은 것이 관찰되었다. 그러나 이것 또한 앞으로 장기 추적관찰을 한다면 평균 생존율 및 무병생존율에 미치는 영향을 연구할 수 있고 나아가 예후 인자로서의 가능성을 시사한다고 생각되어진다.

결     론

   두경부 편평세포암종에서 MMP-13의 발현은 종양의 중심부보다는 가장자리에서 증가되어 나타났으며, 원발 병소의 병기가 진행할수록 발현율이 증가하였다(p<0.05). 병리적 병기(pathologic stage)와의 상관성은 통계적 유의성은 없었지만 병기가 증가할수록 발현율이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 본 연구에서 밝혀진 것처럼 MMP-13은 악성화로 변환된 편평세포암종에서 발현되는 것을 관찰할 수 있었고 이를 토대로 MMP-13의 발현을 선택적으로 억제함으로써 편평세포암종의 국소 침윤 및 전이에서의 역할을 관찰할 수 있고 이의 조절기전을 통해 이러한 악성종양의 침습을 감소시킬 수 있는 새로운 치료법의 개발에 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.

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