교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1 영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   정상 인체 기도는 점액 당단백으로 덮여져 있으며, 호흡 점액 당단백은 기도 분비에 있어서 중요한 구성성분이다. 점액 당단백은 고분자성 당단백으로서 80%가 탄수화물과 그 곁가지로 구성되고, 이는 펩타이드 구조 중 serine과 threonine에 대한 glycosyltransferases의 작용과 연관되어 있다고 알려져 있다.¹⁾ 이러한 점액 당단백은 외부 물질을 섬모운동으로 청소를 하고, 일정한 습도를 유지시키고, 윤활작용을 하는 등 호흡기의 보호기능에 중요한 역할을 한다.²⁾ 상기도 염증은 점액(mucin) 분비를 증가시키는데, 여러 가지 종류의 사이토카인(cytokine)이나 염증성 매개물질(inflammatory mediator)들은 직접 또는 간접적으로 점액의 분비를 촉진하게 된다.³⁾⁴⁾ 이런 물질 중 특히, TNF-α²⁾⁵⁾와 lipopolysaccharide(LPS)⁶⁾와 같은 사이토카인이나 염증성 매개물질이 점액의 분비를 조절하는 점액유전자(mucin gene)를 상향조절(up-regulation)하여 분비를 증가시킨다.^3)4)6)7)
   지금까지 알려진 점액유전자로는 13개가 있는데, 이중 호흡기에 관여하는 유전자로는 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7과 MUC8 등으로 알려져 있다.¹⁾⁸⁾⁹⁾ 이 중 MUC5AC는 하기도에서의 가장 중요한 분비 점액유전자로 밝혀져 있으며 MUC2 점액유전자는 만성 기관지염이나 낭종성섬유증(cystic fibrosis)시 증가한다.¹⁰⁾
   IL-1β는 급·만성 상기도 감염에서 다기능의 염증성 전구 사이토카인 중 중요한 역할을 한다.²⁾¹¹⁾ 또한 천식이나 기관지염과 같은 기도감염의 병인과도 관련이 있다. IL-1β가 상기도 상피세포에서 점액유전자의 발현 또는 점액 생성에 영향을 미치는 것에 대한 것은 아직까지 명확하지 않다.
   본 연구는 호흡기 상피 세포주인 NCI-H292 세포를 배양하여 IL-1β에 의한 MUC2 점액유전자 및 점액단백의 발현 양상에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험대상 및 재료
   사람 호흡기 상피세포인 human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line(NCI-H292, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 실험재료로 하였다.
   실험에 사용된 재료는 MUC2 점액유전자의 발현 자극제로 human recombinant IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하였다. 그 외 사용된 재료는 RPMI 1640(GibcoBRL, Grand Island, NY)배지와 fetal calf serum(FCS：GibcoBRL, Grand Island, NY), actinomycin D(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)와 cycloheximide(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 등을 사용하였다.

세포배양 및 처치
   인체 호흡기상피세포주인 NCI-H292 cells을 6-well plate에 1×10⁶ 세포의 농도로 배양하고, 95%의 O₂와 5%의 CO₂의 가습화된 배양기에서 37°C의 온도로 10% FCS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양세포가 일정하게 자라면 세포를 24시간동안 0.5% FCS만을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, phosphate buffered saline(PBS)에 세척한 후 IL-1β을 각각 농도(0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml)와 시간(2, 4, 8, 12, 24 hr)을 다르게 하여 투여하였다. 또 다른 배양액에는 점액 유전자의 전사와 점액 de novo 단백 합성의 결과를 알아보기 위하여 1 μg/ml actinomycin D와 20 μg/ml cycloheximide를 각각 또는 함께 첨가하여 배양하였다. 대조 세포군은 처치를 하지 않았고 0.1% bovine serum albumin을 첨가한 PBS으로 IL-1β를 용해하여 첨가하였으며 스테로이드는 에탄올에 용해하여 투여하였다. 배양액의 에탄올과 다른 운반 용매는 농도가 0.1% 이하로 유지하였다.

RT-PCR에 의한 MUC2 점액유전자의 분석
   총 mRNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 추출하였다. MUC2 mRNA의 측정은 변형된 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다. 전체 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 인간 MUC2(Genbank accession No. L21998)의 5'primer와 3'primer를 사용하였다. PCR 과정은 초기 가열을 95°C에서 3분간 실시한 후 변성은 95°C/1분, 60°C/1분, 72°C/1분간을 34 cycles을 실시하고 신전(extension)은 72°C에서 20분간 실시하였다. PCR의 산물은 50 ng/ml의 ethidium bromide가 들어 있는 1% Trisboric acid-EDTA(TBE) 완충용매에서 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하였다. 띠(band)의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다.
   MUC2 점액유전자의 primer 염기서열은 다음과 같다.
   5′-TGC CTC GCC CTG TCT TTG
   3′-CAG CTC CAG CAT GAG TGC

유세포 분석법(flow cytometry)을 이용한 MUC2 점액단백의 분석
   배양된 세포에 MUC2 monoclonal antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 처리하여 30분 동안 어두운 곳에서 방치하였다. 1 ml의 PBS를 첨가한 후 900 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 15 μl의 anti-mouse FITC antibody(anti-mouse IgG-FITC 200 μl/0.5 ml)를 첨가하고 어두운 곳에서 30분간 방치하였다. 1 ml의 PBS를 첨가하고 원심분리한 후 상층액을 제거하고 50 ml의 PBS를 첨가하여 희석시켰다. 이어서 간접 면역형광법을 이용하여 FITC-conjugated rabbit anti-mouse immunoglobulin을 분석하였다. 이 세포들을 0.1% para-formaldehyde로 고정하였으며 FACS Caliber(Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 이용하여 MUC2 점액단백 양을 분석하였다.

면역분석법을 이용한 MUC2 점액단백의 분석
   점액단백의 함량을 측정하기 위하여 시료를 처리한 NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl , 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well에 첨가하여 40°C에서 4시간 이상 방치하여 plate에 단백을 점적하였다. 2% bovine serum albumin으로 1시간동안 실온에서 blocking한 후, PBS용액으로 세 번 씻어낸다. MUC2 일차항체(1：100)를 첨가하여 1시간동안 배양시킨 후, 이차항체인 horeseradish peroxidase-goat anti-mouse IgG conjugate(1：10,000)를 첨가시켜 1시간 동안 배양시켰다. PBS로 세 번 씻은 후 3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색반응을 시켜서 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다.

결     과

IL-1β에 의한 MUC2 점액유전자 및 단백의 발현
   호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에 IL-1β을 37°C에서 각각 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml 범위에서 8시간동안 첨가하여 배양하였다. 그 결과 IL-1β의 양이 0.02 ng/ml에서 20 ng/ml까지 증가될 때 MUC2 mRNA 양도 IL-1β의 농도에 비례하여 증가되었으며, β2M mRNA 양은 변화가 없었다. IL-1β의 농도가 20 ng/ml일 경우 MUC2 점액유전자의 발현이 대조 세포군보다 3배정도 높게 발현되었다(Fig. 1).
   IL-1β 투여 시간에 따른 MUC2 mRNA의 발현양상은 IL-1β 투여 후 2시간 후부터 MUC2 mRNA의 발현이 증가하기 시작하여 24시간까지 증가가 지속되었으며 최고치는 8시간 후에 도달하였다(Fig. 2A). 한편, MUC2 점액단백은 IL-1β 투여 6시간부터 증가하여 12시간째 최고치에 도달하였다(Fig. 2B).
   MUC2 단일클론성 항체(monoclonal antibody)를 이용하여 유세포 분석을 실시한 결과 IL-1β를 첨가한 경우 점액단백 면역형광반응이 IL-1β를 첨가하지 않은 경우보다 높게 나타났다(Fig. 3A). 한편 같은 MUC2 단일클론성 항체를 이용한 면역분석법을 실시한 결과에서도 IL-1β의 양이 0.02 ng/ml에서 20 ng/ml까지 증가될 때 점액단백의 양도 평행하게 증가되고, IL-1β 20 ng/ml를 처리하였을 때 MUC2 점액단백의 발현이 최대가 되어(Fig. 3B) 유세포 분석법과 면역분석법으로 분석한 결과가 서로 일치되는 양상이었다.

MUC2 점액유전자 및 단백의 발현에 있어서 전사단계의 관련여부
   IL-1β에 의해 조절된 MUC2 점액유전자와 단백 발현이 전사단계에서 조절되는지 아니면 de novo 단백이 필요한 전사후단계에서 조절되는지를 알아보기 위해 배양 NCI-H292 세포에 IL-1β를 첨가하기 전에 1시간동안 actinomycin D(1 μg/ml)와 cycloheximide(20 μg/ml)를 각각 전처리한 후 IL-1β(20 ng/ml)를 처리하였다. RNA 합성 억제제인 Actinomycin D를 첨가한 경우 IL-1β에 의한 MUC2 mRNA 발현이 억제되었으나, cycloheximide를 첨가한 경우에는 MUC2 mRNA 발현을 억제하지 못하였다(Fig. 4).

고     찰

   본 연구에서는 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의한 MUC2 점액유전자와 점액단백 발현이 IL-1β의 농도에 비례하여 증가될 뿐만 아니라 시간적으로 연관되어 있으며 전사 단계에서 조절되어 생성된다는 사실을 알 수 있었다. NCI-H292 세포에 8시간동안 IL-1β를 0.02 ng/ml에서 20 ng/ml까지 첨가한 결과 MUC2 mRNA가 3배정도 높게 발현되었으며, 2시간 후부터 증가하기 시작하여 8시간 후에 최고 치로 증가되고 24시간까지 유지되었다. MUC2 점액단백은 IL-1β 투여 6시간부터 증가하여 12시간째 최고치에 도달하였다. MUC2 점액단백 발현정도는 면역분석법과 FACS를 이용한 유세포 분석법으로 점액단백 발현을 양적으로 측정한 결과 서로 일치하는 양상이었으며, 이러한 결과는 MUC2 mRNA 발현을 관찰한 RT-PCR 결과와 일치함을 알 수 있었다.
   사이토카인과 염증성 매개체들이 점액 유전자와 점액의 발현을 조절한다는 연구는 미미하며 제한적으로 진행되고 있다. 사이토카인 중 TNF-α가 MCU2 점액 유전자와 점액의 분비를 증가한다고 Levine 등⁵⁾이 처음 보고한 이래 사이토카인과 점액과의 관계가 연구되기 시작하였다. TNF-α와 점액과의 관계에 대한 연구에 의하면 HT29-MTX 배세포를 이용한 실험에서 MUC5AC 점액 유전자의 발현은 증가하고 MUC5B 점액 유전자의 발현은 증가시키지 못한다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 사이토카인 중 몇 가지 interleukin과 점액과의 연관성에 관한 연구 중에서 IL-4¹²⁾와 IL-9¹⁸⁾은 각각 NCI-H292 세포와 transgenic mice의 기도 상피를 이용한 실험에서 두 사이토카인 모두 MUC2와 MUC5AC 점액 유전자의 발현을 증가시켰으며, IL-13¹⁹⁾²⁰⁾은 정상 인체 기도 상피세포에서 점액의 분비를 증가시키고, 쥐의 기도 세포에서는 MUC5AC 점액 유전자와 점액의 분비를 증가시킨다. 한편, Yoon 등²⁾은 정상 코점막 상피세포에서 TNF-α와 IL-1β를 동시에 투여한 경우 MUC8 점액 유전자는 발현이 증가되었으나, MUC5AC와 MUC5B는 변화가 없었다고 하였다. 또한, 상기와 같은 사이토카인 이외에 LPS,⁴⁾⁶⁾⁷⁾ meutrophil elastase¹³⁾와 acrolein¹⁴⁾¹⁵⁾ 등과 같은 염증성 매개 물질이 점액과 점액 유전자의 발현에 관여한다고 보고되고 있다.
   그러나 가장 중요한 전구성 사이토카인 중 하나인 IL-1β에 대한 점액 유전자와 점액 단백의 변화에 대한 보고는 미미하다. 이에 본 연구에서는 배양된 기도상피세포내 IL-1β에 의한 MUC2 점액유전자와 단백 발현을 조사한 결과, 여러 가지 사이토카인과 염증 매개체에 의해 점액 유전자 발현이 증가한다는 여러 다른 연구자들의 결과와 같이 IL-1β이 MUC2 점액유전자와 단백 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 또한, IL-1β 투여에 따른 MUC2 점액 유전자와 점액의 발현은 시간적으로 점액 유전자가 먼저 발현되고, 이어 점액 단백이 생성되는 것을 관찰할 수 있었다.
   NCI-H292 세포에 IL-1β를 첨가하기 전에 1시간동안 actinomycin D(1 μg/ml)과 cycloheximide(20 μg/ml)를 각각 첨가하여 실험한 결과 RNA 합성 억제제인 actinomycin D를 첨가한 경우 IL-1β에 의한 MUC2 mRNA 발현이 억제되었으나, cycloheximide를 첨가한 경우에 IL-1β에 의한 MUC2 mRNA 발현을 억제하지 못하였다. 따라서 IL-1β에 의한 MUC2 mRNA와 점액 단백 발현은 전사단계에서 조절되며 de novo 단백 합성을 하지 못한다는 것을 알 수 있었다.
   한편, 지금까지 점액단백에 대한 연구는 주로 면역분석법(immunoassay)이 이용되고 있다. 그러나 분자량이 크고 복잡한 펩타이드 분자 구조를 가진 점액단백의 발현은 일반적인 생화학적 또는 분자생물학적 방법으로는 측정하기 어렵고 시간이 많이 걸리며 상용되는 항체를 이용할 경우 반복적인 결과의 유도에 문제점이 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 MUC2 점액단백의 분석에 있어서 면역분석법보다 간편하고 재현성이 높은 유세포 분석법을 이용하여 IL-1β에 의한 MUC2 점액단백이 발현하였으며 두 분석법간에 유사한 결과를 얻었다.
   한편, 호흡기에서 발현되는 점액유전자중 MUC2 이외에 MUC4, 5AC, MUC5B, 7과 8 등도 중요한 점액유전자이므로 향후 IL-1β와 같은 전구성 사이토카인에 의해 이들 유전자들이 어떻게 조절되는지 등을 연구할 필요가 있을 것으로 생각된다.
   결론적으로, 본 연구에서는 NCI-H292 세포에서 MUC2 점액유전자와 단백 발현이 IL-1β의 양적 증가와 시간적 증가에 따라 전사단계에 의해 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 정상 기도 상피를 포함한 다양한 상피세포에서 IL-1β에 의한 다양한 점액 유전자 발현과 그 자세한 세포내 기전에 대해 보다 많은 연구가 필요할 것이라고 사료된다.

결     론

   전구성 사이토카인인 IL-1β는 호흡기 상피 세포에서 MUC2 점액 유전자와 점액의 발현을 증가시키며, 이것은 IL-1β의 농도 및 투여시간에 따라 조절되고, 전사 단계에서 조절된다.

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