교신저자：노환중, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(051) 240-7333, 7335 · 전송：(051) 246-8668 · E-mail：rohhj@hyowon.cc.pusan.ac.kr

서     론

   비강 점막은 호흡기의 첫 방어를 담당하는 상부 호흡기로서 알레르기 염증이 일어나는 잠재적인 곳이다. 알레르기 비염은 재채기, 수양성 비루, 비폐색 등의 임상 증상과 혈청내 특이 IgE의 증가, 점막내 호산구의 증가를 특징으로 하는 IgE 매개성 알레르기 질환이다.
   비만세포 표면의 IgE에 항원이 결합되고 화학인자가 유리됨으로써 일어나는 초기 알레르기반응에 비만세포가 주요 세포(key cell)로 작용한다는 사실은 잘 알려져 있지만, 최근 비만세포가 사이토카인(cytokine)을 유리함으로써 알레르기 후기반응의 만성적인 염증에 관여한다는 사실이 밝혀졌다.¹⁾ 따라서 알레르기비염에서 비만세포는 초기와 후기 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
   인체 비만세포를 해부학적 위치에 따라 상피(epithelial) 비만세포와 상피하(subepithelial) 비만세포로 구분할 수 있으며, 각각은 서로 다른 생물학적 특성을 가진다. 상피비만세포는 고전적으로 알레르기 급성반응에 관여하는 세포로서 개체가 항원에 노출시 상피비만세포가 증가되고 이 비만세포로부터 여러 매개물질들이 분비되어 폭발적인 급성 초기반응을 일으킨다고 알려져 있다. Pawanker 등¹⁾의 연구에 의하면 상피하비만세포는 직,간접적으로 여러 사이토카인 생성에 관여하여 알레르기 후기반응과 알레르기성 만성 염증에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. 이처럼 비만세포는 상피 비만세포와 상피하 비만세포를 통해 알레르기 병태 생리에서의 모든 단계에 관여하므로 비만세포에 대한 적절한 조절이 매우 효과적인 알레르기 치료의 향후 연구 방향임을 알 수 있다.
   항히스타민제나 국소 스테로이드제와 같은 약물에 임상적인 효과를 보지 못하는 약물 저항성의 알레르기 비염의 경우 비만세포에 선택적으로 세포고사(apoptosis)를 유도하는 약물을 비강내 국소투여할 수 있다면 보다 진보된 형태의 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 현재까지 보고된 비만세포의 고사를 유도하는 물질이나 방법²⁾³⁾⁴⁾들은 현실적으로 임상에서 치료제로서 이용하기에는 많은 제약이 따른다.
   Cyclosporin A(CsA)는 림프구를 비롯한 여러 염증 혹은 면역세포의 작용을 차단하는 면역억제제로서, 비만세포로부터 IL-3, IL-4, IL-8, TNF-α 등의 사이토카인(cytokine)과 히스타민 등의 매개물질 유리를 억제하는 작용뿐만 아니라,⁵⁾⁶⁾⁷⁾ 항알레르기성,⁸⁾ 항염증 작용,⁹⁾ Stem cell factor(c-kit ligand) 효과의 억제⁶⁾ 등이 알려져 있고, 비만세포의 수도 줄이는 역할을 하는 것으로¹⁰⁾ 알려져 있다. 그러나, 현재까지 CsA가 비만세포에 직접적인 세포고사를 일으키는지에 대한 연구는 보고된 바 없다.
   이에 저자들은 CsA가 직접 비만세포의 고사를 일으키는지 비만세포 세포주인 p815 세포를 이용하여 CsA에 의한 비만세포 고사 여부와 그 적정 농도를 알아 보고자 하였다.

재료 및 방법

비만세포배양
   Mouse mastocytoma cell인 p815 세포(ATCC TIB 64)를 10% fetal bovine serum, 100 unit/ml penicillin(Gibco, Gaithersburg, MD) 및 100 μg/ml streptomycin(Gibco, Gaithersburg, MD)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 부유시켜 37°C, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였다. 세포는 주 2~3회씩 계대 배양하였다.

CsA에 의한 비만세포의 생존율
   2×10⁴ cells/ml의 세포부유액을 96 well plate에 200 μl씩 옮긴 다음 CsA를 2, 5, 10 μM 농도로 처리하여 24, 48, 72시간 배양한 후 MTT 측정법을 실시하였다.
   5 mg의 MTT 용액(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide；Sigma, St.Louis, MO)을 PBS 1 ml에 녹인 후 0.2 μm의 syringer filter로 걸러 DMEM 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 상층의 배지를 제거한 다음 MTT 용액을 100 μl씩 첨가하여 37°C에서 4시간 반응시킨 다음 상층을 제거한 후 DMSO(Dimethyl sulfoxide；Sigma, St.Louis, MO)를 100 μl 넣어 실온에서 10분간 흔들어 ELISA 분석기로 570 nm와 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.¹¹⁾ 측정한 값은 CsA를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 세포의 LD 50을 산출하였다.

유세포 분석을 통한 DNA 함량 측정
   CsA를 2 μM, 5 μM, 10 μM 농도로 48시간 처리한 p815 세포를 완충액으로 세척한 후 약 2.5×10⁶ /ml되게 세포수를 조절하여 trypsin 완충액 250 μl를 더한 다음, 실온 암소에서 10분간 반응시켰다. Trypsin inhibitor와 RNase 완충액 200 μl를 첨가하고 다시 실온 암소에서 10분간 둔 후 propidium iodide 200 μl를 넣어 냉장 온도에서 염색하였다. DNA 함량 분석은 CellFIT program을 이용하여 FAC-Sort flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.¹¹⁾

DNA 분절(fragmentation)의 관찰
   CsA의 농도와 처리시간을 달리하여 배양된 세포를 ice-cold PBS로 세척한 후 300 g에서 10분간 원심분리하여 10 mM Tris-Hcl(pH 8.0), 0.1 M EDTA(pH 8.0), 0.5% SDS, 그리고 5 μg/ml DNase-free RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)가 들어 있는 lysis buffer로 용해시켰다. 그 후 proteinase K를 최종농도가 1 μg/ml이 되도록 첨가한 다음 50°C에서 16~18시간 반응시켰다. Phenol/chloroform을 넣어 5분간 섞은(vortexing) 다음 4°C, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 DNA가 포함되어 있는 수층을 새 tube로 옮겨 이 수층의 0.1 volume에 해당하는 sodium acetate(3 M)와 2 volume에 해당하는 에탄올로 침전시킨 다음 TE buffer(10 mM Tris-Cl과 1 mM EDTA)에 재현탁시켰다. 2% agarose gel에서 80 V, 2시간 전기영동하여 자외선 투과조영기(UV transilluminator)로 대(band)의 양상을 확인하였다.¹¹⁾

TUNEL 정량법
   CsA에 의한 세포의 apoptosis를 검출하고 정량하기 위하여 in situ cell death detection kit(Boehringer Mannheim, Germany)에 형광물질(fluorescein)을 이용하여 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling) 염색을 실시하였다. CsA의 농도와 처리시간을 달리하여 배양한 세포를 poly-_L-lysine이 처리된 슬라이드에 1000 rpm에서 2분간 cytospin을 실시하여 공기중에 건조시켰다. Paraformaldehyde 용액(4% in PBS, pH 7.4)으로 실온에서 30분간 고정한 후 PBS로 3회 세척한 다음 permeabilization 용액(0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate)으로 4°C에서 2분간 처리하고 세척한 다음, TUNEL 반응 용액(terminal deoxynucleotidyl transferase, fluorescin-dUTP 혼합용액)으로 37°C에서 60분간 습도가 유지되는 chamber에서 표지한 다음 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다. TUNEL 용액에 염색된 6개의 조직절편 각각에서 무작위로 3시야를 선택하여 세포핵이 불규칙하거나 크기가 작은, 세포고사가 일어난 세포핵의 수를 세어 평균을 구하였다.¹¹⁾ 

Hoechst 염색법
   5 및 10 μM 농도의 CsA를 24 및 48시간 처리한 다음 세포부유액을 1000 rpm에서 2분간 cytospin을 실시하여 공기 중에 건조시켰다. 그 후에 4% paraformaldehyde로 고정한 다음 PBS로 3회 세척하고 Hoechst 33258(Molecular Probes, Eugene, OR)로 37°C에서 1시간 반응시켜 염색한 후 형광현미경으로 세포핵의 변화양상을 관찰하고 TUNEL 정량법과 같은 방법으로 세포고사가 일어난 세포핵의 수를 세어 정량화하였다.¹¹⁾

Cytospin을 이용한 광학현미경적 관찰
   p815 세포를 10 μM CsA로 24시간 처리후 이 세포액 100 μl를 2분간 500 rpm으로 cytospin한 후 공기중에 건조시키고 알코올로 고정한 다음 H & E(hematoxylin-eosin) 용액으로 염색을 시행하고 광학현미경적 소견을 관찰하였다.

통계처리방법
   MTT 측정법에 의한 농도별, 시간별 세포의 생존율과 유세포분석에 의한 DNA 함량측정, TUNEL 정량법, Hoechst 염색법의 결과에 대해 SPSS 프로그램(version 10.0 ；SPSS, Inc., Chicago, IL)을 이용하여 Kruskal-Wallis test로 95%(p<0.05) 유의성의 범위에서 통계적 검증을 실시하였다.

결     과

CsA에 의한 세포의 생존율
   세포 생존율에 대한 정보를 얻기 위하여 CsA를 농도별, 시간별로 처리하여 MTT 측정법을 실시한 결과 각 시간대별로 약물처리농도가 증가함에 따라 세포생존율이 유의하게 감소하였다(p<0.05). CsA의 농도가 2 μM인 경우는 24, 48 및 72시간의 세포 생존율이 92% 이상으로 세포에 크게 영향을 주지 않았고(p>0.05), 5, 10 μM의 농도에서는 약물 노출시간에 따라 유의하게 감소하였다(p<0.05). 20 μM농도로 처리시 첫 24시간의 세포생존율이 이미 5%미만으로 처리시간 증가에 따른 통계적 유의성은 없었다(p>0.05). CsA를 24시간 노출시 세포의 LD₅₀은 9.87 μM, 48시간 노출시는 6.11 μM, 72시간 노출시는 6.21 μM이였다(Table 1, Fig. 1).

유세포 분석에 의한 DNA 함량 측정
   세포고사에 들어간 세포들은 DNA 함량이 DNA 세포주기의 G0/G1기의 세포들보다 적으므로 propidium iodide로 염색하여 유세포분석기(flow cytometer)로 분석하였을 때 G0/G1기의 세포들보다 더 왼쪽에 나타난다. 이 분획을 M1으로 구분하여 이 분획의 세포 백분율을 구하였다. CsA를 처리하지 않은 대조군에서는 M1 분획이 전체 세포주기 중 3.9%, CsA를 2 μM, 5 μM, 그리고 10 μM씩 48시간 동안 처리하였을 때 M1 세포군이 각각 7.3%, 20.7%와 45.2%로서 CsA의 농도에 따라 증가하였다(p<0.05)(Fig. 2).

전기영동법을 이용한 DNA 분절(fragmentation)의 분석
   CsA를 1 μM, 2 μM, 5 μM 및 10 μM 농도로 24시간 처리한 군과 10 μM로 48시간 처리한 군에서 genomic DNA를 추출하여 전기영동을 실시하여 DNA band 양상을 관찰하였다. Genomic DNA의 사다리 모양(laddering pattern), 즉 DNA 분절상은 10 μM CsA를 24시간 처리한 뒤에 나타나기 시작하였으며 48시간에 전형적인 양상을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).

TUNEL 정량법
   TUNEL 염색상 대조군의 세포는 거의 염색되지 않았고 세포의 형태도 일정한 크기와 모양을 유지하였다. 5 μM CsA를 24시간 처리한 세포에서는 약 4.2%, 48시간 처리한 세포에서는 약 5.9%로 일부의 세포만이 TUNEL-양성으로 염색되었으며 세포의 모양과 크기도 거의 일정하게 유지되어 있었다. 그러나 10 μM CsA를 24시간 처리한 세포에서는 약 17.9%, 48시간 처리한 세포에서는 약 62.9%가 TUNEL-양성으로 나타났으며 세포의 형태도 불규칙한 모양과 크기의 세포가 많이 관찰되었다. CsA의 농도와 노출시간에 세포고사가 일어난 p815 세포가 의존적으로 증가하였으나(p<0.05) 5 μM 농도에서는 24, 48시간 처리시 시간에 따른 차이는 없었다(p>0.05)(Figs. 4 and 5).

Hoechst 염색법
   CsA를 처리하지 않은 대조군의 핵은 편평하고 타원형의 모양이었으며 일정한 농도로 동일한 형태로 염색되었다. 반면에 CsA를 처리하여 고사가 일어난 세포의 핵의 일부는 훨씬 더 작고 더 둥근 모양을 하고 있으며 염색체의 응축과 핵의 분절로 인하여 핵이 불규칙하게 염색되었다(Hoechst-양성)(Fig. 6). 5 μM CsA를 24 및 48시간 처리한 경우는 핵의 고사를 보이는 세포의 비율이 10% 이하로 시간에 따른 차이가 없었지만(p>0.05) 10 μM CsA를 24시간 처리한 경우는 17.5%, 48시간 처리한 경우는 55.0%로 유의하게 높게 나타났다(p<0.05)(Fig. 7).

광학현미경적 관찰
   10 μM CsA로 24시간 처리한 세포를 cytospin후 toluidine blue 염색한 결과 고사가 일어난 p815 세포들을 관찰할 수 있었다. 고사가 일어난 세포는 핵의 분절과 핵막 근처의 분리되고 농축된 염색질 등이 관찰되었다(Fig. 8).

고     찰

   스테로이드 의존성 혹은 저항성 천식에 CsA를 치료제로 사용하여 시도한 연구는 이미 보고되어 있다. 아직 약물효과 기전은 정확히 알려지지 않았으나 CsA가 IL-5나 TNF-α 같은 비만세포의 사이토카인 분비를 억제한다든지, 침윤된 염증세포 수의 감소를 일으켜 천식의 증상 및 폐기능검사의 호전을 관찰할 수 있다고 보고하고 있다.^7)12)13) 따라서 저용량의 CsA를 사용하여 스테로이드 의존성 천식환자에게 스테로이드의 사용량을 줄임으로써 장기간의 고용량 스테로이드로 인한 부작용을 최소화하고, 스테로이드 저항성 천식 환자에 있어서는 치료 개선을 이룰 수 있음을 암시하고 있다.^13)14)15) Wasserman¹⁶⁾은 천식환자의 새로운 치료방법으로서 장기간 비만세포를 억제시키는 모델을 제시하였는데, CsA 등 면역억제제는 비만세포의 사이토카인 유전자 발현을 억제시켜 결국 비만세포의 성장 및 증식을 억제시킬 수 있고, 이 과정에 세포고사가 관여할 것이라고 추정하였다.
   비만세포 분화·성숙의 초기단계에 관여하는 IL-3의 제거시 비만세포의 고사가 유도된다는 것은 널리 알려져 있고,²⁾ 산화질소(nitric oxide；NO),³⁾ 재조합 human IL-4⁴⁾를 통해서도 비만세포의 고사를 관찰할 수 있었다고 보고되었다. 반면 세포고사를 억제하는 방향에 대한 연구도 활발한데, 비만세포의 후기 성숙에 작용하는 것으로 알려진 c-kit ligand(stem cell factor)나²⁾ 마우스 Fas계통인 Fas β¹⁷⁾를 투여하면 비만세포의 고사를 억제할 수 있다는 연구도 있다.
   CsA 투여시 마우스 비만세포에서 IL-3의 발현이 억제된다는 보고와⁵⁾⁹⁾ IL-3 의존성 마우스 비만세포 배양시 IL-3을 제거하면 세포고사가 일어난다는 연구결과를²⁾ 고려할 때 CsA가 비만세포 고사를 유도할 것이라고 추측할 수 있다. 그러나 서론에서 밝힌 바와 같이 CsA가 직접 비만세포 고사를 일으킨다는 보고는 현재까지 없었는데 먼저 비만세포 세포주인 p815 세포를 배양후 CsA 처리를 하여 생체외 실험(in vitro)상 직접적인 비만세포 고사가 유발되는지 알아보고자 하였다.
   대부분의 포유동물은 세포의 자가 파괴 능력을 가져서 세포가 더 이상 필요하지 않거나 손상을 받았을 때 세포의 내인성 자가소멸 프로그램이 활성화된다. 이런 경우 특징적인 형태학적, 생화학적 변화를 동반하게 되는데, 이 생리적 세포사멸의 형태를 세포고사(apoptosis)라고 한다. 세포고사는 세포괴사(necrosis)와 달리 보다 선택적이고 계획적으로 세포를 제거하는 과정으로, 괴사와는 다른 형태학적 특징을 보인다.¹⁸⁾ 세포괴사는 순간적이고 심한 손상에 대하여 염증반응이 동반된 과정으로, 염색질의 불규칙적 응괴와 함께 세포내 기관들의 팽창 및 파괴, 세포막의 부분적 파열이 일어나서 결국 세포 전체가 붕괴되며 DNA는 무작위로 조각나서 전기영동상 번진(smearing) 형태를 나타낸다. 세포고사는 염증반응을 수반하지 않으며 초기에 염색질이 선명하게 응축되어 핵막 내면에 나열되며, 핵의 외형이 만곡된다. 이 과정중에 DNA는 endogenous endonuclease에 의하여 nucleosome 사이의 결합부위가 잘려 180 또는 200 염기쌍인 oligonucleosome으로 절편화되어 전기영동상 전형적인 DNA 사다리 모양(laddering pattern；internucleosomal fragmentation)을 나타낸다. 세포표면이 돌출되고 세포질도 응축되지만, 소기관들은 별다른 변화를 보이지 않는다. 과정이 진행됨에 따라 핵은 조각나고 돌출된 세포표면이 결국 떨어져 나와 다양한 크기의 세포고사체(apoptotic body)를 형성한다. 세포고사체들은 세포막이 손상되지 않은 상태로 수분내 주변의 세포 혹은 조직내 대식세포에 의하여 탐식되어, 면역반응의 자극과 세포내 물질에 의한 주변조직의 상해 등이 없이 결국 소멸되는 과정을 거치게 된다.¹⁹⁾²⁰⁾
   CsA에 의해 p815 세포가 이러한 고사를 일으키는지 확인하기 위하여 단계적이고 다중적인 실험 검정을 필요로 하였다. 본 실험에서는 세포 생존율의 측정, 유세포 분석에 의한 세포주기 검색, DNA 분절(fragmentation)의 전기영동, TUNEL 분석법, Hoechst 염색 그리고 고사가 일어난 p815 세포의 형태학적 관찰 등을 시도하였으며, 고사에 대한 여러 가지 검증방법을 거침으로써 한·두가지 실험 방법으로 세포고사가 일어 났다고 추론하는 오류를 피하였다.
   p815 세포를 CsA로 처리시 세포 생존율의 감소를 보였는데 이는 세포막의 손상을 의미한다. 세포막의 손상은 세포괴사 초기에 나타나기도 하지만, 생체외 세포배양의 고사 말기에 이차적으로도 발생한다. 따라서 세포괴사와 세포고사를 감별하기 위한 추가적인 검정이 필요하였다.
   유세포 분석법은 세포고사가 일어나고 있을 때의 light-scattering property의 변화를 쉽게 보여준다. 세포고사시 세포는 오그라들고 보다 압축되어 forward scatter(FSC)의 감소와 side scatter(SSC)의 증가를 보이는데 이는 각각 세포 크기의 감소와 세포 과립성(granularity)의 증가를 나타낸다.¹¹⁾ Mekori등²⁾은 PI를 이용한 유세포 분석법을 이용하였는데, PI 섭취의 증가, 세포크기의 감소를 나타내었고 이를 통해 고사가 일어난 세포의 생존능을 측정하였다. 저자들이 사용한 Ho33342는 살아있는 세포의 손상되지 않은 세포막을 통해 확산되고, 염색의 정도는 염색질 구조의 강도와 관련이 있는데 세포고사가 진행될수록 염색이 약하게 되는 것을 관찰할 수 있다. 또한 세포주기 검색을 통한 DNA 함량의 측정에서 막대그래프(histogram)상 M₁ 주기가 CsA의 처리시간과 농도에 비례하여 증가하는 것을 볼 수 있었는데, M1 주기는 고사가 일어난 세포의 특징적인 양상인 DNA 함량의 감소를 보여주는 것이다.¹¹⁾ 그리고 고사가 일어난 세포핵은 막대그래프상 subdiploid region에서 나타나는데, 이는 아마도 세포고사동안 발생한 저분자량의 DNA 조각들의 유출로 인한 DNA 염기의 일부 소실로 추정된다.¹¹⁾
   DNA 전기영동 검사는 세포고사를 비교적 빨리 저비용으로 관찰하면서도 정량적인 분석까지 가능한 검사이다. CsA 10 μM의 농도로 48시간 처리한 비만세포 DNA를 agarose gel에서 전기 영동시 180~200 bp로 구성된 전형적인 DNA의 사다리 모양을 관찰할 수 있었는데, 이것은 번진(smearing) 양상으로 나타나는 괴사와는 잘 구별된다. 이는 고사가 일어난 세포의 특징적인 양상으로 핵내의 endogenous endonuclease의 작용 결과로 genomic DNA가 oligonucleosomal fragments로 분할되는 것을 보여주는 것으로 사료된다.²⁾³⁾
   Hoechst 염색법을 통해서도 p815 세포의 고사를 나타내는 염색질 농축이나 분절을 확인할 수 있었다. CsA를 처리하지 않은 대조군의 핵은 편평하고 타원형의 모양이었으며 일정한 농도로 동일한 형태로 염색된 반면 CsA를 처리한 세포의 핵의 일부는 훨씬 더 작고 더 둥근 모양을 하고 있으며 염색체의 응축과 핵의 분절로 인하여 핵이 불규칙하게 염색되었다(Hoechst-양성). 그리고, CsA의 농도가 클수록 처리시간이 길수록 이러한 Hoechst 양성인 세포의 비율이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 p815 세포에 대한 CsA의 대사가 고사에 의한 세포 사망의 특징적인 형태인 염색질의 농축과 파괴를 일으킨다는 것을 제시한다. 비록 이 검사법이 세포고사를 빨리 추정할 수 있다는 장점이 있기는 하나 확진적이지 못하다는 단점이 있어 TUNEL 정량법을 시행하여 이의 결과를 뒷받침하였다.
   TUNEL 분석은 정량화가 가능하고 초기 고사를 검색할 수도 있을 뿐 아니라 형태 분석까지 시행하면 고사를 확진할 수 있는 장점이 있어 기존의 여러 연구에서 이 방법을 통해 세포고사를 확인하였다.¹¹⁾ TUNEL 분석의 결과는 유세포 분석과 Hoechst 염색에서 나타난 결과와 유사하였으며, CsA의 농도와 처리시간에 비례하는 양상을 보였다.
   비만세포 고사시 핵과 세포질의 여러 구조적인 변화가 동반된다. H & E 염색후 나타나는 핵의 변화로서는 핵이 분절되고 핵막 근처에 분리되고 압축된 염색질을 확인할 수 있으며, toluidine blue로 염색시 보라색으로 염색되는 비만세포만을 보다 특이적으로 관찰할 수 있는 것으로 되어 있다. 세포고사시 나타나는 변화와 함께 중요한 것은 고사가 일어난 세포는 세포가 전체적으로 오그라들어 주위 세포와 분리된다고 하지만 광학현미경하 이를 뚜렷이 관찰하기에는 힘든 점이 있다. Hoechst 33342 염색후 형광현미경으로 관찰시에도 고사가 일어난 세포에서는 고사가 일어나지 않은 세포에 비해 핵이 불규칙하게 염색된 것을 확인할 수 있는데 염색체의 응축과 핵의 분절로 인하여 나타난 현상이다.
   이상의 실험 결과로서 CsA에 의한 직접적인 비만세포 고사를 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 생체외 실험만으로 실제 생체내 실험(in vivo)상에서도 동일한 결과를 초래할 것이라고 할 수는 없다. 따라서 향후 알레르기비염 유발 동물모델을 통하여 생체내 실험이 요구되며, 이를 통한 다양한 검증이 필요하다고 사료된다.

결     론

   CsA에 의해 비만세포의 apoptosis가 유발된다는 것을 생체외 실험에서 생화학적 및 형태학적으로 확인하였다.

1. Pawankar R, Ra C. Heterogeneity of mast cells and T cells in the nasal mucosa. J Allergy Clin Immunol 1996;98:S248-62.

2. Mekori YA, Oh CK, Metcalfe DD. IL-3-dependent murine mast cells undergo apoptosis on removal of IL-3: Prevention of apoptosis by c-kit ligand. J Immunol 1993;151:3775-84.

3. Jeong MH, Lee SH, Seo SY, Song JM, Kim HS, Park MS, et al. Apoptotic effect induced by SNP in murine macropharge. Korean J Immunol 1996;18:297-307.

4. Oskeritzian CA, Wang Z, Kochan JP, Grimes M, Du Z, Chang HW, et al. Recombinent human IL-4-mediated apoptosis and recombinent human IL-6-mediated protection of recombinent human stem cell factor-dependent human mast cells derived from cord blood mononuclear cell progenitors. J Immunol 1999;163:5105-15.

5. Warbrick EV, Thomas AL, Williams CM. The effects of cyclosporin A, dexamethasone and other immunomodulatory drugs on induced expression of IL-3, IL-4 and IL-8 m RNA in a human mast cell line. Toxicology 1997;116:211-8.

6. Sperr WR, Agis H, Czerwenka K, Virgolini I, Banki HC, Muller MR, et al. Effects of cyclosporin A and FK-506 on stem cell factor-induced histamine secretion and growth of human mast cells. J Allergy Clin Immunol 1996;98:389-99.

7. Williams CM, Smith L, Flanagan BF, Clegg LS, Coleman JW. Tumor necrosis factor-alpha expression and cell recruitment in Sephadex particle-induced lung inflammation: Effects of dexamethasone and cyclosporin A. Br J Pharmacol 1997;122:1127-34.

8. Ezeamuzie CI. Anti-allergic effect of cyclosporin-A metabolites and their interaction with the parent compound and FK 506. Int J Immunopharmac 1996;18:263-70.

9. Wershil BK, Furuta GT, Lavigne JA, Choudhury AR, Wang ZS, Galli SJ. Dexamethasone or cyclosporin A suppress mast cell-leukocyte cytokine cascades: Multiple mechanism of inhibition of IgE- and mast cell-dependent cutaneous inflammation in the mouse. J Immunol 1995;154:1391-8.

10. Oran A, Marshall JS, Kondo S, Paglia D, Mckenzie RC. Cyclosporin inhibits intercellular adhesion molecule-1 expression and reduces mast cell numbers in the asebia mouse model of chronic skin inflammation. Br J Dermatol 1997;136:519-26.

11. Doyle A, Griffiths JB, Newell DG, editors. Apoptosis assay. In: Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures. UK: Wiley publishers:15.1-15.19.

12. Sihra BS, Kon OM, Durham SR, Walker S, Barnes NC, Kay AB. Effect of cyclosporin A on the allergen induced late asthmatic reaction. Thorax 1997;52:447-52.

13. Ceyhan BB, Sunger M, Celikel T. Effect of inhaled cyclosporin on the rat airway: Histologic and bronchoalveolar lavage assessment. Respiration 1998;65:71-8.

14. Lock SH, Kay AB, Barnes NC. Double-blind, placebo- controlled study of cyclosporin A as a corticosteroid-sparing agent in corticosteroid-dependent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1996;153:509-14.

15. Mungan D, Misirligil Z, Sin B, Kaya A, Demirel Y, Gurbuz L. Cyclosporin in steroid dependent asthma. Allergol Immunopathol Madr 1995;23:202-6.

16. Wasserman SI. Mast cells and airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med 1994;150:539-41.

17. Hughes DP, Crispe IN. A naturally occuring soluble isoform of murine Fas generated by alternative splicing. J Exp Med 1995;182:1395-401.

18. Steller H. Mechanism and genes of cellular suicide. Science 1995;267:1445-9.

19. Kerr FR, Gobe GC, Winterford CM, Harmon BV. Anatomical methods in cell death. In: Lawrence MS, Osborne BA. Cell death methods in cell biology. 46th ed. USA: Academic press;1995. p.1-27.

20. Williams GT. Programmed cell death: Apoptosis and oncogenesis. Cell 1991;65:1097-8.