교신저자：장태영, 400-711 인천광역시 중구 신흥동 3가 7-206  인하대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서      론

   대부분의 알레르기비염에 관한 연구는 히스타민을 포함한 화학적 매개물질과 접착분자와 염증세포, 그리고 콜린성 및 아드레날린성 신경반응 등에서 대부분 이루어졌지만, 최근 NO가 알레르기 비염의 병태생리에 간여하고, 일정한 매개체로서 역할을 할 것으로 추정되는 연구들이 발표되고 있다. 우선 호기(呼氣)내 일산화질소(이하 NO)가 알레르기비염 환자에서 정상대조군에 비하여 더 높게 측정되고 이 호기NO가 대부분 비강 및 부비동점막에서 생성된다는 것,¹⁾ 비즙내 산화질소(nitric oxide, 이하 NO) 대사물의 농도가 정상군에 비하여 높게 측정된다는 것,²⁾⁹⁾ 비염과 관련하여 조직내 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, 이하 NOS)의 mRNA가 증가된다는 것,⁷⁾ 면역조직화학염색등 형태학적 연구를 통하여 상피, 혈관내피, 분비선상피 및 말초신경 등 여러 곳의 비강조직에서 NOS가 확인되고 증가한다는 것¹⁴⁾등이 알려져 있다. 뿐만 아니라 이러한 지식을 바탕으로 NO가 비점막의 섬모상피의 운동에 미치는 영향,¹⁷⁾ 사이토카인과의 관계,¹¹⁾²²⁾ NO의 억제에 따른 혈장외유출과 분비활동의 변화¹³⁾²³⁾등 다양한 응용연구가 이루어지고 있다. 그러나 복잡한 알레르기비염의 기전 안에서 NO의 정확한 역할은 아직 제대로 알지 못한다.
   병적인 상태에서는 iNOS에 의하여 생성된 NO의 농도가 급격히 증가하여 많은 양의 peroxynitrite를 생성하며,³⁾ 생성된 peroxynitrite는 단백질의 tyrosine기를 nitration 시키거나 sulfhydyl기를 산화시키거나 세포막 지질을 peroxidation 시켜서 세포에 손상을 초래한다고 보고되고 있다.¹⁰⁾
   저자는 알레르기비염에서 증가되는 NO와 그 대사물로 세포독성을 가지고 있는 peroxynitirite가 비즙 내 단백질의 nitration을 유발하여 알레르기반응에 비강점막에 영향을 미칠 것으로 생각하였고, 따라서 실제 알레르기비염 환자에서 유발되는 알레르기 조기 및 후기반응에서 그 생성을 확인하고자 하였다.

실험재료 및 방법

대  상
   1999년 7월부터 2000년 6월까지 인하대병원 이비인후과에서 집먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)에 대한 알레르기비염으로 진단받은 13명의 환자를 대상으로 하였다. 남자 5명, 여자 8명이었고, 연령은 16세에서 47세 사이, 평균 31.5세였다. 환자는 재채기, 수양성콧물, 가려움, 코막힘 등 전형적인 알레르기비염의 증상을 가지고 있었고, 집먼지진드기 특이 Immunoglobulin-E(IgE)에 매개된 알레르기반응 여부는 알레르기 피부반응검사(allergic skin test, Bencard사, Brentford, 영국)와, RAST(radioimmunosorbent test)에 의하여 검증되었다. 그러나 알레르기검사결과 양성인 경우라도 다음의 경우는 대상에서 제외하였다. 1) 비내유발검사후 평균 증상점수가 같거나 감소된 경우, 2) 검사 당시 알레르기비염의 급성증상을 보이고 있는 경우, 3) 비강 또는 부비동 내 급, 만성의 질환이 동반되어 있는 경우, 4) 최근 2주 이내에 항히스타민제나 전신 또는 국소 스테로이드를 포함한 항알레르기약물을 복용하고 있는 경우, 5) 습관된 흡연이나 최근에 휘발성 자극가스에 노출된 과거력이 있는 경우 등. 모든 환자에게서 서면동의를 구하였다.

코알레르기유발 및 비즙의 채취
   비내유발 검사는 Dermatophagoides pteronyssinus(5,000 SEB/ml, Allergopharma, Reinbek, Germany) 항원용액을 분무기를 이용하여 환자의 양측 비강내 각각 한차례씩(1회 평균 분무량＝48.7±2.3 μl/squirt) 분무하였다. 비즙의 채취는 각 환자의 동일한 일측비강에서 3회씩 시행하였다. 각각 기준치를 반영하는 비내유발 검사 전, 알레르기 조기반응을 반영하는 검사 30분 후, 및 후기반응을 반영하는 검사 8시간 후에 시행하였다. 모든 비즙의 채취시간은 일내변동(diurnal variation)을 최소화하기 위하여 기준치 및 조기반응을 위한 비즙은 오전 8~9시 사이에, 후기반응은 오후 4~5시 사이에 채취하였다. 설문지를 이용하여 코막힘, 콧물, 재채기, 및 가려움 등의 주관적 증상 변화를 0에서 10까지 visual analog scale을 이용하여 기록하였다.

비즙의 채취방법
   비즙의 채취는 종이흡착법을 이용하여 13명의 환자에서 시행하였다. 25×8 mm 크기의 여과지(Whatman No.44, Maidston, England)를 일측 비강내 하비갑개의 전상부에 위치시키고 10분 후에 비즙에 젖은 종이를 채취하였다. 이것을 Eppendorf관에 넣고 200 μl의 생리식염수로 다시 적신 후, 종이의 상부를 Eppendorf관의 뚜껑을 이용하여 고정시킨 상태에서 1500 rpm으로 20분간 원심분리를 하고, 종이에서 분리되어 나온 용액을 채취하였다. 이 용액은 양을 측정한 후 다시 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 채취하여 -20°C에 보관하였다.

비즙내 nitrite(NO₂^-)와 nitrate(NO₃^-)의 농도 측정
   Griess반응을 이용하여 nitrate(NO₃^-)를 nitrite(NO₂^-)로 환원시킨 후 nitrite의 총농도를 측정하였다. Nitrate reductase(10 U/ml in 100 μM Tris buffer, pH 7.6, Sigma Chemical Co., MO, USA), NADPH, 조효소로 FAD를 시료와 함께 섭씨 37도에서 빛을 차단한 채로 한시간 동안 반응시킨 후, sodium pyruvate 및 LDH를 넣고 다시 30분간 반응시켰다. 그리고 1% sulfonic acid, 0.1% N-naphtylene-diamine-H-Chloride 및 증류수와 함께 반응시킨 10분 후, spectrophotometer로 546 nm에서 OD치를 측정하여 농도를 구하였다.

웨스턴 블롯을 이용한 비즙내 Nitrotyrosine의 분석
   같은 조건을 가진 별도의 3명의 알레르기비염 환자에서 위와 같은 방법으로 비내유발 후 종이흡착법으로 채취한 비즙을 사용하여 측정하였다. Lowry의 방법을 이용하여 각 비즙내 단백질의 농도를 측정하여 정량화 한 후 항nitrotyrosine 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행, 단백질을 분석하였다. 우선 Lowry방법으로 각각의 비즙의 총 단백질을 정량화 한 후 각각 20 μg씩 SDS-PAGE(Sodium Dodocyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, Novex)에 125 Volt에서 2시간 동안 전기영동하였다. 그 후 젤 내의 단백질을 nitrocellulose membrane(PVDF, Bio-Rad, CA)에 25 V에서 3시간 동안 transfer 하였다. Tris-HCL(pH 7.5) 10 mMn(2 M stock 5 ml)과 NaCl 100 mM(5 M stock 20 ml), 0.1% Tween 20 1 ml, 및 증류수 976 ml로 구성된 세척용액(washing buffer)를 만들고, 이 membrane을 2.5 mg의 무지방분유(nonfat milk)를 세척용액 50 ml에 녹여 제조한 5% 차단용액(blocking buffer)에 넣고 4°C에서 밤새 반응시켰다. 이 후 membrane은 각 nitrotyrosine에 대한 항체(polyclonal antibody, 1차항체)를 1：2,000으로 희석시켜 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 세척용액으로 세척 후 membrane을 peroxidase로 표지 된 polyclonal goat anti-rabbit IgG(2차항체)와 1시간동안 반응시킨 후 다시 세척용액으로 씻어내었다. ECL Kit(enhanced chemiluminescence kit, Amersham)를 이용하여 발광반응을 시킨 후 X-레이 필림에 현상하였다.

통계적 방법
   검사전 및 조기, 후기반응의 변화양상 분석은 Friedman test를 이용하였다. 통계적 계산은 IBM호환기종 컴퓨터에서 SAS프로그램(v6.12, SAS institute Inc. USA)을 이용하여 수행하였고, 통계적 검정은 95%(p<0.05) 유의성의 범위에서 판정하였다.

결     과

알레르기 유발반응 전후의 주관적 증상의 변화
   설문지를 통한 코막힘, 콧물, 재채기, 코가려움 및 눈의 가려움을 포함한 평균증상점수는 비내유발검사 전(2.48±1.34) 및 8시간(3.0±2.33)에 비하여 조기반응에서(5.24±1.55) 유의하게 증가하였다(p<0.05, Friedman test)(Fig. 1).

알레르기 유발반응 전후의 비즙내 산화질소 농도의 변화
   비즙내 산화질소의 농도는 검사전, 조기 및 후기반응에서 각각 101.83±58.58, 120.32±58.98, 및 130.61±64.52 μM로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05, Friedman test)(Fig. 2).

웨스턴블롯을 이용한 Nitrotyrosine 특이적 단백질의 발현
   항 nitrotyrosine 항체를 이용한 웨스턴블롯에서 약 180 Kda 및 그 이상의 크기에서 검사 전과 조기반응 비즙에 비하여 후기반응 비즙에서 nitrotyrosine기를 가지고 있는 단백질이 증가하였다(Fig. 3).

고     찰

   알레르기를 포함한 염증반응에 있어서 NO가 역할을 한다는 것에는 대부분 긍정하지만 어떤 식으로 관여하는지는 아직도 모르는 부분이 많다. Kharitonov 등¹⁵⁾에 의해 호기내 NO가 존재한다는 것이 밝혀지고, 그 후 비NO(nasal NO)가 주로 비강과, 특히 부비동에서 생성된다는 것이 알려지면서¹⁸⁾ NO가 비 생리에 중요한 역할을 할 것으로 추정한 이래 계속되는 연구로 알레르기비염에서 비NO의 증가는 일정한 현상으로 확인되고 있다.¹⁷⁾ 비NO의 기원에 대해서 Lundberg 등¹⁸⁾은 부비동점막의 induced nitric oxide synthase(iNOS)와 관련이 있다고 하였으나, 면역조직화학법을 이용한 Furukawa 등⁸⁾의 보고에서 비염에서는 iNOS가 비강점막상피에서 발현된다고 하여 부비동 뿐만 아니라 비강점막의 NO 생성에 대하여 보고한 바 있다. Chemiluminescence를 이용한 비NO의 측정에서 알레르기의 급성기에 비내 NO가스가 감소하는 것은 심한 점막부종으로 인하여 부비동 자연공이 폐색되어 일어나는 것으로 설명되듯, 만일 그 비율을 정확히는 알 수 없는 비NO의 많은 부분이 부비동점막에서 생성되더라도, 이와 같은 면역조직화학법을 이용한 NO 합성효소의 발현과, 흡인성 항원에 대한 알레르기비염에서 일차적으로 반응하는 곳이 부비동점막 보다는 비점막이라는 것으로부터 알레르기비염 환자에서 증가되는 비NO가 비점막 자체의 알레르기반응과 관계가 있음을 추정할 수 있다. 또한 본 연구는 호흡가스에서 NO를 측정한 것이 아니고 하비갑개에서 종이흡착법으로 채취한 비즙을 이용하였기 때문에 비즙내 NO는 부비동에서 유출된 NO보다는 하비갑개, 즉 비강점막에서 생성된 NO의 효과라고 말할 수 있다.
   알레르기 후기반응은 조기반응시 활성화된 비만세포, 그리고 대식세포, 단핵구, 또는 Langerhans세포와 같은 항원제시세포의 항원제시에 의해 활성화된 Th2세포에서 분비된 사이토카인에 의하여 유입된 백혈구가 활성화되어 일어나는 염증성 반응이며, NO가 이와 같은 알레르기반응에서 일정한 역할을 한다면, 본 연구와 같이 알레르기의 조기 및 후기반응과의 연관성에 대한 연구는 중요한 의의를 갖을 것으로 생각된다. Lane 등¹⁶⁾은 쥐를 이용한 실험에서 반대측 비강에 히스타민을 이용하여 유발반응을 일으킨 후 발생한 조기반응에서 NO가 naso-nasal reflex의 매개체 역할을 한다고 하였다. 또한 Dear 등⁵⁾도 NO 억제제가 알레르기 조기반응시에 혈장외유출의 억제에 기여함을 들어 조기반응과의 연관성이 있음을 보고하였다. Morita등은 마우스의 접촉성과민반응 모델을 이용한 실험에서 NO의 억제가 알레르기의 조기 및 후기반응 모두를 억제한다고 보고하였으나,²⁰⁾ Uchida등은 기니픽을 이용한 천식모델에서 iNOS는 후기반응시 증가한다고 보고하였다.²⁵⁾ 알레르기비염의 경우 Garrelds 등은 비강세척을 이용한 비즙에서 NO 대사물을 측정하여 NO가 조기반응시에 다량으로 분비되지 않고 이 후 후기반응시까지 점차 증가된다고 하였고,⁹⁾ Durland 등⁶⁾은 동물 알레르기비염 모델에서 NO가 조기반응 뿐만 아니라 후기반응의 매개물이라고 보고하였다. Raulf-Heimsoth 등은 라텍스에 대한 알레르기비염에서 비강세척법으로 비즙을 채취하여 검사한 결과 조기반응시는 오히려 비즙내 NO의 농도가 감소했다가 6시간 후의 비즙에서 NO가 증가됨을 보고하였다.²²⁾
   NO는 반응성이 매우 강한 분자로서 생성 후 산소 등과 결합하여 수 초 내에 대사가 되므로 비즙 내에서 NO 자체를 측정하는 것은 매우 어려우나 그 대사물인 nitrite, nitrate는 비교적 안정적인 물질이므로 NO농도를 측정하는데 있어 유용하게 이용된다. 그러나 대사과정 속에서 이 두 물질의 상대적 비율이 일정하지 않아 총 NO의 양은 nitrite와 nitrate의 양의 합으로 측정하는 것이 적당하다.⁹⁾ 따라서 본 연구에서도 nitrate reductase(NADPH, 10 U/ml in 100 μM Tris buffer, pH 7.6, Sigma Chemical Co., MO, USA)을 이용하여 nitrate(NO₃^-)를 nitrite(NO₂^-)로 환원시킨 후 nitrite의 총량을 측정하였다.
   산소는 NO의 가장 중요한 반응성분자이며, 특히 비강을 비롯한 호흡기에서는 산소를 포함한 기체상과 액체상이 동시에 존재하므로 NO는 매우 복잡한 대사단계를 거쳐 다양한 대사물(NO, ONOO^-, NO₂,(NO)₂, N₂O₃, NO₂^-, NO₃^-)을 형성한다. 이 중 peroxynitrite(ONOO^-)는 NO가 superoxide와 결합하여 생성되며 강력한 산화제로서 세포독성을 가지고 있다. Cytokine이나 LPS등에 의한 자극에 의하여 iNOS를 발현한 세포는 NO를 합성하기 전에 superoxide(O₂^-)와 같은 reactive oxygen radical을 생산하게 된다. NO와 superoxide는 매우 빠른 속도(k＝6.7×10⁹ M^-1S^-1)로 반응하며, 생체내에서 NO는 superoxide에 대해 superoxide dismutase(SOD)와 경쟁하여 더 빠르게 반응할 수 있는 물질로서 superoxide의 SOD와의 반응속도는 2×10⁹M^-1S^-1로써 NO와의 반응속도가 3배정도 빠르지만 정상상태에서 SOD의 농도가 NO의 농도에 비해여 월등히 높기 때문에 SOD와 superoxide의 반응이 NO와의 반응보다 활발하지만, 병적인 상태에서는 iNOS에 의하여 생성된 NO의 농도가 급격히 증가하고, 이것이 superoxide와 반응하여 많은 양의 peroxynitrite를 생성하게 된다.³⁾ 생성된 peroxynitrite는 단백질의 tyrosine기를 nitration 시키거나 sulfhydyl기를 산화시키거나 세포막 지질을 peroxidation 시켜서 세포에 손상을 초래한다.¹⁰⁾ 따라서 peroxynitrite는 여러 염증반응에 의한 질환에 관여할 것으로 추정된다. Peroxynitrite는 유리기(free radical)는 아니지만 강력한 산화제로 thiol이나 zinc fingers 등과 반응하여 세포의 기능을 강력히 억제한다.⁴⁾
   생성된 peroxynitrite와 같은 반응성 nitrogen species의 ‘표시자(footprint)’로 단백질의 tyrosine기가 nitration된 nitrotyrosine을 이용한다.³⁾ 본 실험에서도 nitrotyrosine항체를 이용하여 비즙 내 단백질의 nitration된 tyrosine기를 측정하므로써 알레르기비염에서 NO에 의한 세포독성을 입증하고자 하였다. Nitrotyrosine은 tyrosine의 phenol고리가 nitration된 것으로, 이 tyrosine을 이용하는 이유는 생체 내 세포에 가장 많이, 특히 단백질의 residue 형태로, 존재하는 phenol 구조이기 때문이다. Nitrotyrosine은 peroxynitrite의 효과를 나타내는 ‘특별한 표시자’ 뿐만 아니라 병태생리작용을 일으키는 일차적인 물질로 판명되고 있다. 우선 이러한 nitration은 tyrosine의 phosphrylation을 억제하고,¹⁹⁾ tyrosine의 OH기를 O^-로 만들어 음전하를 띠게 하여 단백질의 삼차원적 구조 및 기능을 변화시키고,²⁴⁾ 단백질 분해를 촉진시키는 ‘tag’로 작용하거나, 또는 강한 항원성을 갖는 dinitrophenol과 비슷한 nitrotyrosine의 구조는 자가면역반응을 유발할 수 있고, 또 neurofilament와 같은 세포골격계를 이루는 단백질을 nitration시켜 기능을 변화시킨다.²¹⁾ 따라서 peroxynitrite와 이에 의한 nitrotyrosine은 위와 같은 다양한 기전으로 생체 내에서 병태생리에 영향을 미치게 되는 것이다.
   본 실험에서 웨스턴블롯으로 분석한 비즙 단백질의 nitrotyrosine은 알레르기 조기반응 보다 후기 반응시 증가되었으며, 이는 peroxynitrite의 효과가 조기보다 후기반응시에 더 증가되어 있음을 의미한다. Peroxynitrite의 형태로 대사가 되는 NO의 정확한 분율은 알 수 없지만 이 양은 NO의 양보다 적은 것은 분명하며, 따라서 NO의 농도는 언제나 peroxynitrite 농도에 비하여 많다.¹²⁾ 따라서 본 실험에서 웨스턴블롯을 통한 비즙 단백질 분석에서 peroxynitrite의 효과가 후기반응시 높은 것은, 비록 nitrate/nitrite의 농도를 통하여 간접적으로 추정한 NO의 농도가 후기반응에서 증가하지 않은 결과에도 불구하고, 전체적인 NO의 효과가 후기반응시 증가되어 있음을 의미한다. 반대로 후기반응시에 nitrite/nitrate 농도가 증가되지 않은 이유를 superoxide가 NO scavenger로 작용했으며 그 결과 nitrite/nitrate 보다 peroxynitrite가 증가했기 때문으로 설명할 수 있다.
   따라서 NO는 이 후기 반응시에 위에 언급한 다양한 기전으로 비점막 생리에 영향을 미칠 것으로 생각이 된다. 실험의 대상이 된 환자는 모두 집먼지진드기 특이 면역글로불린-E 항체를 가지고 있는 알레르기비염으로, 집먼지진드기는 연 중 어느 때나 일상생활에서 접하게 되는 대표적인 통년성 항원이다. 이러한 통년성 알레르기비염의 경우 계속 반복되는 항원의 노출은 지속적인 후기반응을 일으키고, 따라서 peroxynitrite 및 nitrotyrosine에 반복적인 노출은 염증이나 비과민반응 등과 같이 알레르기 비점막 생리의 변화에 장기적인 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   저자는 이와 같은 결과로부터 알레르기비염에서 항원유발검사 후 비즙내 NO 및 peroxynitrite의 생성은 조기반응보다 후기반응에서 증가됨을 확인할 수 있었고, 따라서 알레르기비염에서 비내 알레르기 반응에 미치는 산화질소의 역할은 조기 보다는 후기반응시에 더 큰 역할을 할 것으로 사료된다.

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