교신저자：이정구, 330-714 충남 천안시 안서동 산 29  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   유소아에서 발병한 세균성뇌막염은 심한 감각신경성난청을 유발할 수 있다.¹⁾ 이의 기전으로 세균이 Corti기에 직접 침범하여 유모세포, 지지세포, 혈관조(stria vascularis)의 세포와 신경말단을 파괴한다는 보고와,²⁾ pneumolysin과 같은 내독소에 의해 유모세포와 지지세포가 파괴된다는 보고가 있었으나,³⁾ 아직까지 이에 대한 정확한 기전은 밝혀지지 않고 있다.
   세균성 뇌막염이 있는 소아의 뇌척수액 내에서 TNF-α와 IL-1β 같은 cytokine이 고농도로 존재한다는 보고가 있었으며⁴⁾ 이는 세균성뇌막염을 유발한 실험에서도 증명된 바 있다.⁵⁾ 이와 같은 cytokine들은 세균성뇌막염 시 중추신경계 내의 조직에서 형성되어 숙주 염증 반응에 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 왔으며, inducible nitric oxide synthase(iNOS)를 유발시켜 nitric oxide(NO)를 생성하며 이때 생성된 NO가 뇌혈류량, 뇌압, 뇌실질 내 수분량을 증가시키며 이것은 NOS 억제제인 NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME)에 의해 억제된다는 보고가 있었다.⁶⁾ 그러나 세균성뇌막염의 합병증으로 발생된 감각신경성난청에서 TNF-α와 IL-1β에 의한 이독성과 이때 NO의 역할에 대하여는 많이 알려지지 않았다.
   이에 저자들은 TNF-α와 IL-1β 등의 cytokine이 뇌척수액으로부터 와우 내로 전달되어 청력감소를 유발할 수 있으며, 그것이 NO를 통해 이루어짐을 보여 cytokine에 의한 내이의 손상에서 NO가 최종 매개체임을 밝히고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험동물은 체중 300~350 g의 외견상 건강하고 수술현미경 소견상 중이 내에 염증 소견이 없는 기니픽 26마리(52귀)를 사용하였다. 대조군으로는 phosphate buffered saline(PBS)를 투여한 군 3마리와 L-NAME만을 복강내로 주입한 군 3마리로 하였으며 실험군으로는 각각 5마리씩 TNF-α군, IL-1β군, L-NAME를 전처치한 TNF-α군과 IL-1β군으로 하였다. 실험 전에 측정한 청성뇌간유발반응(ABR)은 모두 정상이었다.

방  법

PBS, TNF-α, IL-1β의 주입
   기니픽의 체중 kg당 30 mg의 ketamine hydrochloride과 2 mg의 xylazine을 혼합한 후 근육주사하여 자기호흡을 유지한 상태로 전신마취을 하여 기니픽을 움직이지 못하도록 고정하였다.
   실험자의 검지로 경추부 중간부위를 확인한 후, 29-gauge 1 cc 주사기를 척수강 내로 찔러서 대액조(cisterna magna)에 도달하였다. 뇌척수강에 올바로 도달한 것을 확인하기 위해 주사기에 음압을 가한 뒤 뇌척수액 0.1 cc를 역류시켰다. 대조군에는 PBS 10 μl을 뇌척수강 내로 주입하였고 실험군에는 PBS로 희석하여 만든 TNF-α(Zymed, South San Francisco, USA), IL-1β(Zymed, South San Francisco, USA) 10 μg/ml 용액을 각 실험군에 10 μl씩 뇌척수강 내로 주입하였다.

L-NAME의 투여
   L-NAME(Sigma, Stenheim, Germany) PBS에 녹여 40 mg/ml의 농도로 맞춘후, 실험 전까지 -20°C에 보관하였다가 cytokine을 뇌척수강에 주사하기 30분 전에 복강 주사(10 mg/kg)하였다.

청성뇌간유발반응
   대조군과 실험군은 PBS, L-NAME, IL-1β, TNF-α를 뇌척수강 내로 주입하기 전과 주입 6, 24시간 후에 청성뇌간유발반응으로 청력검사를 시행하였다. 청성뇌간유발반응으로 증폭 및 150~3000 Hz의 Band pass filter로 여과되었으며, 검사당 500회 이상의 자극을 평균하였다(Nicolet Viking IV^®, Madison, USA). 자극음은 100 μsec 펄스의 교대극성에 의해 생성된 광역밴드의 클릭음을 31.1 Hz의 비율로 Ear Tone 3A insert earphone을 통해 귀에 삽입하여 주었다. 클릭강도는 90 dB SPL에서 시작하여 청성뇌간유발반응이 나타나지 않을 때까지 5 dB씩 감소시켰으며, 청력역치는 측정가능한 파형의 wave V를 보이는 최저 자극역치로 결정하였다.

주사전자현미경
   24시간 후 청성뇌간유발반응으로 청력검사를 시행하고 각 군에서 2마리씩 주사전자현미경 검사를 위해 2% paraformaldehyde와 25% glutaldehyde의 혼합액을 사용하여 심장 내 관류를 시행한 후 실험동물을 단두하여 와우를 채취하였다. 생체 외 관류는 고실계에 낸 구멍을 통하여 난원창으로 시행하였으며, 관류 후 정원창을 제거한 와우를 4°C에 하루동안 액침시켰다. Glutaldehyde로 하루동안 고정시킨 후 와우를 0.1 M phosphate 완충액으로 고실계에 낸 구멍을 통하여 씻어내는 과정을 3회 반복하고 1.5% OsO₄로 후고정시켰다. 이어서 광학현미경하에서 와우의 골피막을 제거하고, 체취된 조직은 에탄올액 50%, 70%, 85%, 95%, 100%로 탈수하여 critical point dryer(Hitachi HCP-2^®, Tokyo, Japan)로 건조한 후 13 nm 플라티늄으로 도포된 stub(Hitachi, Tokyo, Japan)위에 위치시켰다. 위의 과정을 거친 조직을 주사전자현미경(Hitachi S-2500^®, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고 Polaroid type 55 landfilm으로 촬영하였다. 주사전자현미경을 통한 유모세포 손상의 평가는 Corti 기관의 0.5 KHz, 1 KHz, 2 KHz 부위를 얻어 유모세포의 1부터 4열 사이의 입체섬모(streocilia)의 정렬, 융합, 벌어진 정도(splaying), 섬모의 손실 및 분열을 고려하였다.

통계처리방법
   PBS를 사용한 대조군과 TNF-α군 및 IL-1β군 사이의 청력변화와, TNF-α군과 TNF-α^＋ L-NAME군, IL-1β군과 IL-1β^＋ L-NAME군 사이의 청력변화를 oneway ANOVA법을 이용하여 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

대조군에서의 청력변화
   청성뇌간유발반응상 PBS를 뇌척수강 내 주입한 군에서는 주입 후 6시간, 24시간 후에 각각 1.7±1.2 dB, 1.8±1.6 dB의 청력역치 변화를 보였으며, L-NAME만 복강내 주입한 군에서는 각각 1.8±1.3 dB, 2.7±1.9 dB의 청력역치 변화를 보였다(Table 1).

뇌척수강 내에 투여된 TNF-α에 의한 청력변화에 대한 L-NAME의 효과
   청성뇌간유발반응상 TNF-α 10 μg/ml를 주입한 군에서는 주입 후 6시간, 24시간 후에 각각 19.2±10.2 dB, 18.3±10.3 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). L-NAME를 전처치한 군에서는 각각 3.3±2.6 dB, 8.3±4.1 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 TNF-α군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05)(Fig. 1)(Table 1).

뇌척수강 내에 투여된 IL-1β에 의한 청력변화에 대한 L-NAME의 효과
   청성뇌간유발반응상 IL-1β 10 μg/ml을 주입한 군에서는 주입 후 6시간, 24시간 후에 각각 6.9±4.6 dB, 11.25±8.3 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). L-NAME를 전처치한 군에서는 각각 1.7±2.7 dB, 1.3±2.5 dB의 청력역치 변화를 보였으며 이는 IL-1β군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05)(Fig. 2)(Table 1).

전자현미경 소견
   와우의 중간회전부에서 촬영한 전자현미경 소견에서 TNF-α, IL-1β 10 μg/ml를 주입한 군에서는 외유모세포의 가장 외측 열의 손상이 심하여 와우 전장에 걸쳐 입체섬모의 파괴, 휘어짐, 손실 등이 관찰되었다(Figs. 3, and 5). L-NAME와 함께 TNF-α, IL-1β 10 μg/ml를 주입한 군에서는 이러한 손상이 없이 내유모세포와 외유모세포가 모두 잘 유지된 것을 관찰할 수 있었다(Figs. 4 and 6).

고     찰

   소아의 세균성뇌막염으로 인한 영구적 감각신경성난청은 개발도상국에선 아직까지 생존자의 10%에서 발생되는 심각한 합병증이다.⁷⁾ 그러나 뇌막염 후 영구적 난청이 발생하지 않아도 일시적으로 난청을 호소하는 경우는 흔히 있으며 이들은 모두 뇌막염 발병 후 수일 내에 발생한다.⁸⁾ 이러한 난청이 생기는 기전으로 지금까지 세균이나 염증세포가 와우도수관을 통해 전파된다는 설이 유력하였다.⁹⁾ 와우도수관은 고실계과 지주막하 공간을 연결하는 관으로 특히 뇌막염후 난청이 잘 나타나는 소아 연령에서는 성인보다 관 내부의 개통성이 더 클 수 있다.¹⁰⁾ 동물 실험을 통하여 알려진 세균성 뇌막염 후 와우의 형태적인 변화는 외유모세포의 손상이 주된 것으로, 초기에는 와우의 내측 제 1 열 외유모세포의 부분적인 퇴행성 변화와 혈관조 변연세포의 공포화, 고실계, 전정계의 염증세포의 침윤이 관찰되었고, 진행된 손상에서는 다른 열의 외유모세포의 손상 및 내유모세포와 지지세포를 포함한 와우 전반의 염증세포 침윤이 있는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 또한 세균성뇌막염에서 TEOAE의 반응은 없으나 정상 고실도(tympanogram) 소견을 보이는 가역적 난청이 나타날 수 있으며, 이의 기전으로 세균의 독소나 염증매개체가 Corti기관의 유모세포에 작용하는 것이 제시되었다.¹²⁾
   TNF-α와 IL-1β는 proinflammatory action을 가지는 중요한 면역 매개 물질로 외상이나 감염에 대한 반응으로 방출된다. TNF는 두가지 분자형태로 분비되는데 cachectin이라고 불리우는 TNF-α는 활성화된 대식세포에서 생성되며, lymphotoxin이라 불리는 TNF-β는 자극받은 T-cell에서 형성된다. TNF-α와 IL-1β는 병원소에 대한 방어기전과 염증반응의 병태생리에 관여하는 등 많은 생물학적 기능을 가지고 있다.¹³⁾ TNF-α가 세균성뇌막염에서 중요한 역할을 한다는 증거로 뇌막염 환자의 뇌척수액에서 이것이 높게 검출되며,⁴⁾ 뇌막염을 유발시킨 동물실험에서도 TNF-α가 상승한다는 보고가 있었다.⁵⁾ 중추신경계 염증질환에서 TNF-α를 분비하는 명확한 세포 근원은 밝혀지지 않았지만 뇌의 성상세포(astrocyte)나 소교세포(microglial cell)에서 Streptococcus pneumoniae의 세포벽과 지다당류(lipopolysaccharide) 그리고 cytokines에 의해 TNF-α가 분비된다는 연구가 있었다.¹⁴⁾
   NO는 NOS에 의하여 L-arginine이 L-citrulline으로 변하는 과정에서 생성되는 반감기가 짧고 용해성이 큰 유리기로써 다양한 기능을 갖고 있는 물질이다. NO는 혈관을 확장시키고 대식세포의 살균효과와 항암효과를 매개하며 중추 및 말초신경계에서 비아드레날린성, 비콜린성 신경전달물질의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NOS는 사람세포에서 3가지 다른 isotype이 밝혀져 있는데 Type I인 neuronal NOS(nNOS)와 Type II인 iNOS, 그리고 Type III인 endothelial NOS(eNOS)이 그것이다. Type I과 Type III는 구성성 형태로 acetylcholine, bradykinin, adenosine diphosphate, histamine, glutamine, calcium 유입에 의해 자극되며 Type II는 calcium 유입과 관계없이 cytokines나 lipopolysaccharides에 의해 유전적 발현이 되어 증가되며 염증질환시 숙주방어 기전에서 중요한 역할을 한다.¹⁵⁾ L-NAME는 이러한 NO의 합성효소인 NOS의 억제제로서 NO가 연관된 여러 병태생리에서 이의 역할을 연구하는데 있어서 널리 사용되고 있으며 본 연구에서도 와우내 NOS에 의한 NO의 이독성을 알아보기 위해 이를 사용하였다.
   NO에 의한 이독성에 대한 연구에서 Amaeer(1995)는 pneumolysin을 기니픽의 고실계에 주입 후 청력이 감소함과 이것이 L-NAME에 의하여 억제됨을 보고하였고,¹⁶⁾ 1997년에는 NO 공여자인 sodium nitroprusside(SNP)와 S-netroso-N-acetylpenicilamine(SNAP) 그리고 N-methyl-D-aspartate(NMDA)를 고실계에 주입하여 복합활동전위(compound action potential)과 와우음전기반응(cochlea microphonic)이 감소함과 Corti기의 섬모세포와 지지세포의 손상이 나타남을 보고하였다.¹⁷⁾ 그리고 2001년 Takumida 등¹⁸⁾은 고실내로 bacterial lipopolysaccharides(LPS)나 gentamicin을 주입한 후 와우내 내유모세포와 외유모세포에서 iNOS의 발현과 실제적으로 NO가 생성됨을 관찰하였고 이것이 L-NAME에 의하여 억제됨을 보고하였다. 이번 연구에서는 TNF-α와 IL-1β에 의한 각각의 청력손실군을 L-NAME를 미리 주사한 군과 주사하지 않은 군으로 나누어 청력손실과 조직학적 변화의 차이를 관찰하였다. TNF-α와 IL-1β를 투여 후 청성뇌간유발전위 검사 결과 각각에서 청력역치의 감소가 일어났다. 이러한 변화는 L-NAME를 미리 투여한 군의 경우에는 6시간, 24시간 후에도 거의 관찰할 수 없었다.
   즉, L-NAME 비투여군에 비하여 투여군은 6시간, 24시간 후에도 각각 cytokine에 의한 청력손실에 예방효과를 나타내었다. 단지 TNF-α를 10 μg/ml 주입한 군에서 24시간 후에 조금 증가된 청력역치의 변화를 관찰할 수 있었다. 그러나 이때의 전자현미경 소견은 와우의 첨부, 중간부, 기저부 회전에서 모두 정상 소견을 나타내었다. 본 연구에서는 뇌척수강 내에 주입한 TNF-α와 IL-1β의 농도로 10 μg/ml를 사용하였는데 이는 세균성뇌막염시 뇌척수액 내의 측정한 TNF-α와 IL-1β의 농도가 각각 최고 0.01 μg/ml, 0.005 μg/ml이었다는 보고에⁴⁾ 비하여 고용량이라고 생각할 수 있다. 하지만 실험에서 1 μg/ml로 주입시 유의한 청력감소가 나타나지 않았으며, 실제 기니픽 뇌척수강 내로 주입한 양은 0.1 μg으로, 기니픽의 뇌척수액 양은 수 ml이나 소아의 뇌척수액은 50~100 ml인 점을 감안하면 뇌척수액 내의 절대양에 있어서 차이가 없어 적절한 용량이라고 할 수 있다. 또한 실제적으로 기니픽의 뇌척수강 내에 일정한 농도의 cytokine을 유지하면서 청력검사를 지속한다는 것은 어려우므로 고농도의 cytokine을 주입하여 단시간 내에 이에 따른 청력감소를 발생시켰다. 이러한 고용량의 cytokine 주입에서도 L-NAME의 청력감소 억제 효과는 유의하게 관찰되었으므로 cytokine에 의한 청력감소의 기전을 NO가 매개한다는 결론을 유추할 수 있다. 향후 뇌척수액 내에 TNF-α와 IL-1β의 주입 후 와우 내에 NO synthase mRNA의 발현과 이로 인해 증가된 NO를 증명해야 하며, 본 실험으로는 중이염이나 뇌막염에 의한 합병증으로 나타날 수 있는 감각신경성난청이 최종 효과기인 NO의 작용을 차단함으로써 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

결     론

   기니픽 뇌척수강 내에 투여한 TNF-α와 IL-1β에 의하여 와우의 외 유모세포가 파괴되었으며 대조군에 비해 유의한 청력감소가 유발되었다. 이러한 청력감소는 L-NAME 전처치 후에는 발생하지 않은 것으로 TNF-α와 IL-1β의 이독성에 NO가 최종 매개체로서의 역할을 함을 알 수 있었다.

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