교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640번지 충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   오존은 자극적 산화기체로 광화학 스모그의 주 구성 성분이며¹⁾ 최근 산업화로 인한 대기오염의 증가로 오존발생경보의 빈도가 늘어나는 등 사회 문제화되고 있다.
   실험동물이 오존에 노출되었을 때 평활근의 수축, 점액분비, 혈장의 유출, 중성구의 침윤 등 기관지 천식에서 보이는 기도 염증반응과 과민반응을 초래하는 것으로 알려져 있으나,²⁾³⁾ 그 기전에 대해서는 아직 의견이 분분하다.⁴⁾⁵⁾
   Keneko 등⁶⁾은 guinea pig을 capsaicin으로 전처치하여 지각신경 말단에서 펩타이드계 신경전달물질을 고갈시킨 후 오존에 노출하였을 때 기관지점막에서의 혈관투과성이 전처치하지 않은 군에 비해 감소함을 보고하여, 오존에 의한 기관지 과민반응과 염증반응의 형성에 지각신경의 종말에서 분비되는 substance P(SP)와 같은 펩타이드계 신경전달물질이 관여함을 시사하였다.
   정상적인 상태에서는 분비된 SP가 기관지점막에 존재하는 neutral endopeptidase(NEP)나 angiotensin converting enzyme(ACE) 등의 효소에 의해 분해된다.⁷⁾ 그러나 여러 가지 원인에 의해 기도점막에 손상이 일어나면 NEP의 활성이 저하되고 이로 인해 SP 등에 의한 염증반응이 증가할 수 있다.⁸⁾⁹⁾ Murlas 등¹⁰⁾은 guinea pig에서 오존노출 후 SP의 농도를 증가시켜가며 기도저항을 측정하여 SP에 대한 기관지반응성을 평가한 다음 NEP 억제제인 phosphoramidon을 투여하고 다시 평가하였을 때 SP에 대한 기관지반응성의 증가 정도에 차이가 없었다고 하여 오존에 의한 기관지반응성 증가에 NEP의 활성도 저하가 관련되어 있음을 시사하였다.
   그러나, 오존이 비점막에서는 어떤 영향을 주는지 아직 잘 알려져 있지 않다. 저자들은 오존노출이 비점막의 염증반응을 일으키는지, 만일 일어난다면 neutral endopeptidase의 활성도 감소가 이에 관여하는지를 알아보고자 본 연구를 계획하였다.

재료 및 방법

실험동물
   무균상태로 사육된 체중이 200~250 g, 생후 7주령인 Wistar계 수컷 백서(Japan SLC, Inc.) 20마리를 사용하였다. 실험 일주일 전부터 온도 20~23도, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하여 실험실 환경에 적응하도록 하였고, 이 기간 내에 상기도 감염의 증상과 다른 질환이 관찰되는 백서는 실험에서 제외하였다.

실험군의 분류(Fig. 1)
   총 20마리의 백서를 capsaicin 투여군(1군), phosphoramidon 전처치 후 capsaicin 투여군(2군), 오존노출 후 capsaicin을 투여한 군(3군), 오존노출 후 phosphoramidon 전처치한 다음 capsaicin을 투여한 군(4군)으로 나누었다.

제 1 군
   Capsaicin 수용액 100 μg/kg을 2분 동안 서서히 투여하였다.

제 2 군
   Phosphoramidon 용액 2.5 mg/kg을 주입하고 10분 후 capsaicin을 투여하였다.

제 3 군
   3 ppm의 오존에 30분간 폭로 후 1시간 경과 후 capsaicin을 투여하였다.

제 4 군
   3 ppm의 오존에 30분간 폭로 후 1시간 경과 후 capsaicin을 투여하였으며, capsaicin 주입하기 10분전에 Phosphoramidon을 투여하였다.

약제의 제작과 투여
   Capsaicin(Sigma, St. Louis, MO)은 1% ethanol, 0.5% Tween 80(Sigma, St. Louis, MO), 0.9% NaCl을 포함한 수용액에, phosphoramidon(Sigma, St. Louis, MO)은 0.9% NaCl 용액에, Evans blue(Sigma, St. Louis, MO)는 phosphate buffer saline에 용해하였다.
   약제 투여를 위해 케타민을 복강 내에 주입하여 마취한 다음 대퇴정맥을 찾아 도관을 삽입한 다음 이를 통해 주입하였다.

오존폭로
   오존폭로를 위해 30×20×17 cm의 크기의 전신흡입상자(whole-body inhalation chamber)를 제작하여 사용하였다. 오존발생기로는 SMO-200(삼성 매직 오존, Korea)을 사용하였다. 발생된 오존은 10 L/min의 의료용 공기와 섞여 상자 내로 유입되도록 하였고 오존이 상자 내에서 고른 농도를 보일 수 있도록 상자 내에 소형선풍기를 설치하여 순환시켰다. Portasens model B16-14(Analytical Technology, Oaks, PA)를 이용하여 상자내의 오존농도를 측정해가며 오존의 유입량을 조절하여 폭로시간 내내 일정한 농도가 유지되도록 하였다. 오존은 3 ppm의 농도에 30분간 폭로하였으며, 배출구로 나오는 오존은 활성탄을 통하도록 하여 정화시킨 다음 배출되도록 하였다.

비세정액에서 Albumin 농도의 측정
   Capsaicin 투여 직후 기관절개를 하고 관을 삽입하여 관의 끝이 후비공에 위치하도록 하였다. 관을 통해 PBS용액 3 ml를 주입하여 전비공으로 흘러나오는 세정액을 받아 측정 전까지 냉동하였다. 세정액을 녹여 원심분리한 다음 상층액을 얻어 Turbidimetry(502X, A & T, Japan)를 이용하여 albumin의 농도를 측정하였다.

Evans blue를 이용한 비점막의 혈관 투과성의 측정
   비세정 직후 대퇴정맥을 통해 Evans blue 30 mg/kg을 5초 이상에 걸쳐 천천히 주입하였다. 5분 후에 좌심실을 경유하여 대동맥에 도관을 삽입한 후 생리식염수 100 ml로 관류하였다. 관류 후 비강을 개방하여 비중격과 비갑개의 점막을 얻어 수분을 거즈로 흡수한 다음 조직의 무게를 측정한 후 2 ml formamide(Sigma, St. Louis, MO) 용액에 넣어 37°C 온도에서 18시간 동안 배양하여 조직내의 Evans blue를 추출하였다. Spectrophotometer(DU-65, Beckman, Fullerton, CA)를 이용하여 620 nm에서 OD(optical density)를 측정한 다음 Evans blue 표준용해곡선(0.01~10 μg/ml in foramide)을 이용하여 추출된 Evans blue의 농도를 계산하였고, 이를 미리 측정한 조직의 무게로 나누어 단위조직당 Evans blue의 양을 구하였다.

자료분석 및 통계처리
   각 군 사이에 유의한 차이가 있는지를 알아보기 위해 분산분석(one way-ANOVA)을 이용하였고 유의 수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

혈관투과성(Fig. 2)
   단위조직당 유출된 Evans blue의 양은 1군 15.79±1.27, 2군 25.72±3.71, 3군 23.62±2.41, 4군이 29.93±2.57 ng/mg of wet tissue 이었다. 1군에 비해 2군, 3군, 4군에서, 그리고 3군에 비해 4군의 투과성 또한 유의한 증가를 보였다(p<0.05). 그러나 2군과 3군, 2군과 4군 사이에는 유의한 차가 없었다.

비세정액의 Albumin 농도(Fig. 3)
   비세정액의 알부민의 농도는 1군 0.54±0.48, 2군 1.68 ±0.62, 3군 2.14±1.73, 4군 2.86±1.87 mg/dl으로 각 군간에 통계학적으로 유의한 차이가 없었다.

고     찰

   오존, 담배연기, capsaicin, TDI, NO2 등에 노출되었을 때 기도점막에서는 혈관투과성 증가, 점액분비 증가, 평활근 수축 등의 염증반응이 일어나며 이러한 염증반응의 형성에는 SP와 같은 sensory neuropeptide가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.^7)11)12)
   SP는 혈관투과성 증가, 점액분비 증가, 평활근 수축, 염증세포의 침윤 등을 일으킬 수 있으나 정상 상태에서는 주로 기도 상피세포에 존재하고, 비 점막의 분비선, 혈관, 기관지 평활근세포 등에도 존재하는 것으로 밝혀진 NEP와 같은 효소들에 의해 바로 분해되기 때문에 이러한 SP의 작용이 미미하다.¹³⁾ 그러나 NEP의 활성도가 감소하면 SP에 의한 혈관투과성 증가, 기관지수축 등 염증반응을 초래하게 된다.
   Murlas 등¹⁰⁾은 guinea pig을 3 ppm의 오존에 2시간 노출 후 30분 후에 SP에 대한 기도반응성과 기관지 점막에서 NEP의 활성을 측정하였는데, 대조군에 비해 오존노출군에서 기도반응성은 증가하였고, NEP의 활성은 감소하였음을 보고하여 오존노출 시 보이는 기도반응성의 증가는 오존에 의한 NEP 활성의 저하와 관계가 있을 것이라고 하였다.
   오존이 비점막에서 혈장유출과 점액분비를 증가시키고 상피세포의 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 그러나 비점막에서도 오존에 의한 염증반응이 NEP의 활성도 감소와 관련이 있는지는 아직 잘 알려져 있지 않다.
   본 연구에서는 비점막에서 NEP의 활성도에 따른 비점막 혈관투과성의 차이를 비교하기 위하여 NEP 억제제로 알려진 phosphoramidon 전처치 후 capsaicin을 투여하고(2군) Evans blue 유출과 비세정액에서의 albumin 농도를 측정하여 전처치하지 않은 군(1군)과 비교하였다. 그리고 오존이 혈관투과성을 증가시키는지를 확인하기 위하여 3 ppm의 오존에 30분간 노출 후 capsaicin을 투여하고 혈관투과성을 측정하였으며(3군), 오존노출 후 capsaicin 투여 전에 phosphoramidon을 전처치하였을 때(4군) 혈관투과성이 어떻게 차이가 나는지 알아보고자 하였다.
   그 결과 1군에 비해 2군에서 비세정액의 albumin 농도는 통계학적 유의성은 없었으나 증가하는 경향을 보였고 Evans blue 유출은 유의한 증가를 보여 NEP의 활성도가 감소하면 비점막의 혈관투과성이 현저히 증가함을 보여주었다.
   Jeon 등¹⁴⁾은 Sprague-Dawley rat을 3일 동안 0.3 ppm의 오존에 6시간 노출한 후 비점막 상피의 손상이 발견되고, Evans blue 유출과 염증세포의 침윤이 증가한다고 하였고, Keneko 등⁶⁾도 3 ppm의 오존에 30분간 노출 후 1시간 후에 기관지점막에서 Evans blue의 유출이 유의하게 증가한다고 하였다. 본 연구에서도 대조군에 비해 3군에서 비세정액의 albumin 농도는 통계적으로 유의성은 없었으나 현저히 증가하였고 Evans blue 유출은 유의한 증가를 보여 3 ppm 농도의 오존에 30분간 노출하였을 때에도 혈관투과성이 증가함을 확인하였다.
   오존에 의해 일어나는 기도점막의 손상이 어떠한 생화학적 기전에 의한 것인지는 아직 잘 모른다. 단지 이러한 현상이 oxygenderived free radical이나 hydrogen peroxide, hydrochlorous acid(HOCl)등과 같은 oxidizing agents의 생성에 의할 것으로 생각되고 있다.¹⁵⁾ 특히 HOCl은 세포막에 존재하는 NEP에 직접 영향을 주어 활성도를 감소시키는 것으로 알려져 있다.¹⁶⁾
   Murlas 등¹⁰⁾은 guinea pig에서 NEP 억제제인 phosphoramidon을 투여하고 SP의 농도를 증가시켜가며 기도저항을 측정하였을 때 SP에 대한 기관지반응성이 증가함을 확인하였다. 그러나 3 ppm의 오존에 2시간 노출 후 SP에 대한 기관지반응성을 평가한 다음 phosphoramidon을 전처치하고 다시 평가하였을 때에는 SP에 대한 기관지반응성의 증가 정도에 차이가 없었다고 하였다. 또 오존 노출 후 aerosolized NEP를 흡입한 다음 기관지반응성을 평가하였을 때 오존에 노출되지 않았던 상태와 같은 기관지반응성을 보여 오존에 의한 기관지반응성 증가는 NEP의 활성도 저하에 의해 나타나는 것이라 생각하였다.
   본 연구에서는 오존노출 후 phosphoramidon을 전처치하였을 때 albumin 농도는 전처치하지 않은 군과 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, Evans blue의 유출은 유의한 차이를 보였다. 그러나 그 차이는 phosphoramidon의 투여 효과를 보여주는 1군과 2군 사이의 차이만큼 크지는 않았다. 이것은 3 ppm의 오존에 30분간 노출하였을 때 어느 정도 NEP 활성도가 감소하였으나 phosphoramidon을 주입하였을 때처럼 NEP의 활성이 완전히 차단되지는 않았음을 의미하는 결과로 생각한다.
   오존노출 시 나타나는 혈관투과성 증가가 전적으로 오존에 의한 NEP 활성도 감소에 의한 것으로는 생각되지 않는다. 본 연구에서 2군과 4군 사이의 혈관투과성은 통계학적으로 유의한 차이를 보이지는 않았으나 4군에서 약간 더 증가하는 경향을 보였다. Leukotriens, histamine, brady-kinin, serotonin과 platelet-activating factor(PAF)와 같은 많은 매개체들이 기도의 혈관투과성 증가에 관여하고 있는 것으로 알려져 있고,¹⁷⁾¹⁸⁾ 이들 중 PAF는 오존노출 후 기도상피와 대식세포양 세포에서 생성되는 것이 확인되었다.¹⁹⁾ 따라서 오존에 의한 비점막의 혈관투과성 증가에 이들 매개체가 부분적으로 관여할 것으로 생각된다.

결     론

   저자들은 백서 비점막에서 오존노출에 의한 혈관투과성 증가가 비점막에 존재하는 NEP의 활성도가 감소하여 일어나는지 알아보기 위하여 본 연구를 계획하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
   오존노출은 백서 비점막에서 혈관투과성을 증가시키며, 이러한 혈관투과성 증가는 부분적으로 비점막상피에 존재하는 NEP 활성도 감소에 의할 것으로 추정된다.

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