교신저자：이상학, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
                  전화：(02) 920-5486 · 전송：(02) 925-5233 · E-mail：Sanghag@ns.kumc.or.kr 

서     론

   비용은 염증세포가 침윤되어 있으며 상피세포와 고유층에 구조적인 변형이 있는 비·부비동 점막의 흔한 만성질환이다. 비용의 임상적, 형태학적 특성은 잘 알려져 있으나, 아직까지 발생 기전은 명확하지 않다. 동물조직을 이용한 실험모델과 비용조직을 이용한 연구결과들은 비용의 형성과 성장에 세포외 기질(extracellular matrix)의 축적이 필요한 것으로 알려져 있다.^1)2)3)4)5)
   기질(matrix)이라 불리는 세포외 조직(extracellular tissue)은 2가지 거대분자(macromolecules)를 포함한다. 콜라젠과 일라스틴(elastin) 등과 같은 고유층의 섬유조직을 구성하는 분자들과 섬유조직의 주위를 채우는 분자들로 이루어져 있다. 이 중 후자는 proteoglycans(PGs)과 structural glycoproteins의 2가지 거대분자 그룹(macromolecular group)으로 이루어져 있다. PGs은 단백질 core와 다양한 기능을 하는 glycosaminoglycans side chain으로 구성된다.⁶⁾
   Lumican은 상대적으로 작은 leucinerich repeat-PGs 족에 속하는 keratan sulfate-PGs이다. 이 계통에 속하는 다른 PGs 군은 biglycan과 decorin이 있으며, 이들 PGs는 단백질 core로 구성되고 chondroitin sulfate나 dermatan sulfate side chain을 가진다. 이러한 PGs 군들의 구성원은 콜라젠 섬유와 반응함으로써 콜라젠 섬유가 다른 세포외 기질의 성분과 반응함으로써 세포외 기질을 유지하여 삼차원적 조직구조를 유지한다. 인체의 여러 장기에서 이런 PGs 군의 발현이 알려져 있으며 다양한 병적상태에서 그 발현정도의 변화와 동반되어 삼차원적 구조가 변화한다고 알려져 있다.^6)7)8)9) 이런 측면에서 보았을 때 이들 small PGs 군이 비용의 형성에 관련된다고 제시된다.
   따라서 본 연구에서는 비용형성에 이들 PGs 군의 역할을 관찰하고자 비용과 정상 비점막의 조직에서 dot blot hybridization을 이용하여 lumican, decorin, biglycan mRNA의 발현양상을 관찰하였다.

재료 및 방법

조직 준비
   융비교정술을 시행받은 10명의 환자(남자 5, 여자 5, 24세부터 40세)로부터 정상 하비갑개 조직을 채취하였다. 이 환자들은 적어도 수술 수개월 전부터 비질환 증상이 없었으며 전비경 검사상 해부학적인 이상이나 점막손상은 관찰되지 않았다. 수술시 채취한 모든 하비갑개 조직은 RNA분리를 위해 즉시 액화질소로 얼린 후 -70°C에 보관하였다.
   비용을 동반한 만성 부비동염으로 내시경 부비동수술을 받은 10명의 환자(남자 8, 여자 2, 20세부터 50세)로부터 비용조직을 채취하였다. 이 환자들은 모두 알레르기, 천식, 또는 아스피린 특이체질의 과거력이 없었다. 모든 환자에서 사골동수술 시작시에 중비도의 비용 조직을 채취하였고, 각각의 비용조직은 100~150 mg 정도의 무게로 작게 잘라 RNA 분리를 위해 즉시 액화질소로 얼린 후 -70°C에 보관하였다.
   Lumican, decorin, biglycan의 양성대조군으로서 귀 수술시 얻은 후이개 부위의 정상 피부 조직을 사용하였다.

RNA 분리, 역전사중합효소연쇄반응과 소식자 제조
   냉동된 조직(50~100 mg)을 1 ml의 TRIzol^® 시약(GI-BCOBRL, Grand Island, NY)을 첨가하여 균질화 시킨 후 Chomszynski 방법¹⁰⁾에 따라 총 RNA를 분리하였다. 각각의 비갑개 조직과 비용조직으로부터 추출한 총 RNA 4 μg을 2.5 U의 M-MLV 역전사효소(GIBCOBRL, Grand Island, NY)를 포함한 반응혼합물 20 μl에서 42°C에서 60분간 역전사시켰다. 그리고 cDNA 1 μl를 0.125 U의 Taq DNA polymerase와 각각의 시발체 12.5 pmol을 함유한 25 μl의 중합효소연쇄반응 혼합물과 증폭시켰다. 이 연구에 사용된 PGs family member의 시발체와 GAPDH 염기배열은 Table 1에 나열하였다. 소식자 제작을 위하여 얻어진 cDNA 조각을 pCR^® II Topo vector(Invitrogen Cor., Carlsbad, CA)에 접종한 후, EcoRI로 절단한 후 random priming technique을 이용해 digoxigenin-dUTP(Boehringer Mannheim, Germany)를 포함하는 deoxyribonucleosides 혼합물로 표식하였다.

반정량적 Dot blot hybridization
   총 RNA는 상기 기술한 방법으로 분리하여 역전사시켰다. 각각의 cDNA 표본은 개개의 시발체로 중합효소연쇄반응을 진행하면서 20, 25, 30, 35, 40 사이클에서 채취하였다. 적절한 증폭횟수를 보기위해 time kinetic 검사를 실시하였다. 이러한 분석을 근거로 logarithmic amplification range에서 GAPDH는 30회, 각각의 small-PGs family member는 35회가 적절하다고 결정되었다.
   중합효소연쇄반응의 각각의 산물은 Bio-Rad dot blotting 기구를 이용하여 Hybond-N 나일론 막(Amersham, U.K.)에 부착시켰다. 각각의 소식자와 hybridization 처리될 blot은 sealable bag에서 hybridization용액(6×SCC, 1% SDS, 5×Denhardt's solution, 10 μg denatured salmon sperm DNA) 25 ml와 68°C에서 16시간 동안 prehybridization하였다. Sealable bag에서 hybridization 용액에 소식자를 첨가하여 68°C에서 24시간 동안 hybridization시키고 항digoxigenin-AP로 면역 염색 후 NBT/X-phosphate로 발색반응을 일으켜 발현시켰다.
   결과는 염색된 막을 image scanner로 scanning한 다음, dot의 강도는 NIH image 1.57 soft ware(Division of Computer Research and Technology, NIH, Bethesda. USA)를 이용하여 정량화하였다. GAPDH는 각각 중합효소연쇄반응에 사용된 cDNA의 실질적 양에 대한 지시자로 사용하여 목표로 하는 cDNA의 양을 GAPDH 발현정도와 비교하여 정량하였다. 모든 자료는 평균의 표준편차로 나타내었고 통계적 유의성은 t-test를 이용해 검증하였다. 평균들간의 차이는 p값이 0.05 이하일때 의미있는 것으로 하였다.

결     과

   융비교정술과 내시경하 부비동수술시 채취한 모든 비점막 조직과 비용조직에서 lumican, decorin과 biglycan mRNA의 발현이 확인되었다(Fig. 1). 이때 각각의 조직에서 분리한 총 RNA에서 GAPDH 발현을 확인함으로써 RNA 통합성과 RT-PCR의 적합성 여부를 확인하였고, 모든 표본에서 예견했던 502 bp 크기의 산물을 관찰할 수 있었다.
   양성대조군으로 이용한 후이개 피부에서 채취한 RNA로부터 역전사반응후 각 유전자의 시발체를 이용한 중합효소연쇄반응 실험에서 예상되는 크기의 cDNA 분절이 각각 증폭되었다(Fig. 1). 반면 역전사효소를 사용하지 않은 대조군의 중합효소연쇄반응에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않았다.
   Dot blot hybridization을 이용한 반정량적 분석에서 비용조직과 정상 하비갑개 점막에서 decorin, lumican과 biglycan의 발현이 확인되었다. Lumican, biglycan mRNA 양은 비용조직보다 하비갑개 점막에서 발현양이 많았으며, decorin mRNA는 비슷하게 검출되었다(Figs. 2 and 3).

고     찰

   본 연구에서 lumican, decorin 그리고 biglycan mRNA를 정상 비점막과 비용조직에서 역전사중합효소연쇄반응 후 dot blot hybridization을 이용하여 관찰하였다. 모든 정상 비점막과 비용 조직에서 lumican, decorin 그리고 biglycan mRNA가 발현되었다. 이는 여러가지 다양한 PGs들이 인체 비점막에 존재하고, 다른 조직에서 증명된 바와 마찬가지로 중요한 생물학적 역할을 담당하고 있는 것으로 추측된다. 반정량적 dot blot hybridization 분석에서는 비용조직에서 정상 비점막에 비하여 lumican과 biglycan mRNA의 발현이 유의하게 낮게 검출되었다. 반면 decorin mRNA의 양은 정상 비점막조직과 비용조직 사이에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 정상 비점막을 구성하고 있는 세포외 기질의 구성이 비용에서는 균형이 이루어지지 않고 있음을 의미한다.
   콜라젠 섬유는 세포외 기질이 풍부한 폐, 피부, 인대, 근육결합조직, 눈의 각막같은 여러가지 조직에서 생리적기능이 원활하게 이행되도록 하면서 삼차원적구조를 유지하는데 중요한 기능을 하고 있다.⁶⁾ 한편 정상 비점막의 골막, 연골막에는 일정하게 배열된 콜라젠 섬유를 가지고 있고, 상피세포와 분비선도 풍부한 콜라젠 결합조직에 싸여있다.¹¹⁾ 이와는 대조적으로 대부분의 비용조직의 기질은 부종성의 조직소견을 가지고 있으며, 간질성 공간은 전자밀도가 낮은 비정형의 물질(amorphous substance)을 포함하고, 콜라젠 섬유는 대개 작고 느슨한 조직학적 형태를 가지고 있다.¹²⁾ 또한 위축성비염의 하비갑개 점막은 과도한 콜라젠 섬유가 침착되어 있는 것이 특징이다.¹³⁾ 이러한 형태학적인 측면에서 볼 때 다양한 세포외 기질의 구성성분들은 조직 자체의 손실 또는 비점막의 삼차원적 구조의 변형과 연관이 있는 것으로 생각된다. 그러나 세포외 기질에 대한 연구는 현재까지 비점막과 비용의 다른 구성요소들에 대한 연구만큼 이루어지지 않고 있고, 비점막의 PGs 군들의 발현과 분포상태도 알려져 있지 않다. 저자들은 이 연구에서 PGs 군의 유전자들의 발현에 초점을 맞추었고, 처음으로 lumican, decorin 그리고 biglycan mRNA가 비점막과 비용에서 발현되는 것을 보여주었다. 앞으로의 연구는 PGs 군의 정확한 양적 분석과 함께 여러가지 다양한 비질환에 있어서 비점막에 존재하는 PGs들의 종류와 그 분포의 변화를 보여주는 것이 필요하겠다.
   Fibronectin과 같은 다른 기질 단백질이 비용 조직에서 증가되었음이 밝혀졌지만,¹⁾ 비점막 조직에 있는 PGs의 발현의 변화와 관련된 기능적 역할은 확실하지 않다. Nakagawa 등¹⁾³⁾은 fibronectin의 면역반응이 결합조직형성세포의 활성과 잘 일치한다고 보고하였으며, 부종성 조직변화를 가진 고유층에서 결합조직 형성세포가 많이 발견된다고 하였다. 부종성 조직변화, 호산구 침착 그리고 fibronectin의 침착정도 사이에는 서로 연관성이 있다고 하고 있다. Wang 등⁴⁾은 세포외 기질의 축적에 관여하는 myofibroblast가 비점막에서보다 비용에서 더 풍부하다고 보고하였다. 마찬가지로 결합조직형성세포의 화학주성과 myofibroblast의 형성을 유도하는 TGF-β가 비용에서는 발견되었지만 정상 비점막에서는 발견되지 않았다. Ohno 등¹⁴⁾은 정상적인 비점막에서 발현되지 않은 TGFβ-1 mRNA를 비용조직에서 발견하였다. TGF-β는 강력한 결체조직 유도물질로 알려져 있으며 이것의 발현정도는 간경화증, 폐섬유화, 사구체경화증을 포함한 섬유성 질환에서 증가한다.¹⁵⁾ 이러한 결과를 종합하면 비용조직에서도 결합조직 형성세포와 TGF-β가 많이 증가한다는 사실로 미루어 볼 때 비용조직도 콜라젠 섬유의 과도한 축적을 동반한 섬유화 변화를 보여주어야 한다는 가설이 성립된다. 그러나 대부분의 비용조직에서는 부종성 조직변화가 관찰되고 있다. 그러므로 섬유성 조직변화를 유도하는 물질의 비용형성에 관여하는 기전에 관한 연구가 더 필요하다고 생각된다. 본 연구에서는 정상적인 비점막과 비교했을때 비용조직에서 lumican과 biglycan mRNA의 발현이 감소된 것이 검증되었고 decorin mRNA의 발현은 변화가 없었다. 비용의 형성에 있어서 세포외 기질의 remodeling과 결합조직 형성세포의 분포 그리고 TGF-β 활성도와 PGs 발현사이에 관련성이 밝혀져야만 하겠다.
   다른 장기의 여러가지 질환들에 있어서 병리학적 검사결과 PGs의 발현량의 변화가 발견되었다고 하였다.^{16)17)18)19)20)} Lumican은 콜라젠 섬유의 직경과 섬유사이의 공간을 조절함으로써 각막의 투명성을 확보하는 각막실질의 중요한 구성요소이다.⁷⁾ 부종성각막에서 keratan sulphate proteoglycan인 lumican의 발현량이 감소되었다는 것이 면역조직화학적 연구결과 밝혀졌다.¹⁶⁾ 또한 동물모델을 이용한 폐부종의 병리학적 검사결과 폐부종의 발생에는 여러가지 PGs의 소실이 관련되었다고 하고 있다.¹⁷⁾ 면역조직화학적 기술을 이용한 Pawlak's의 연구는 후두에서는 decorin이 고유층의 표층에서 더 많이 발견된다는 것을 보여주었다. 그들은 이것의 존재 때문에 표층에서 심부보다 콜라젠 섬유가 적게 존재하는 이유라고 주장했다.⁹⁾¹⁸⁾ 후두 폴립, Reinke's edema의 병리학적 소견에서는 콜라젠이나 일라스틴(elastin)과 같은 구조단백질이 적거나 성대에서 fibronectin이 적거나 없는 상태임을 보인다. 임상적으로 이러한 구조 단백질의 결핍은 성대의 과도한 변형을 가져올 가능성이 있다고 추측되고 있다. Gray 등¹⁸⁾은 이런 형태의 병리학적 반응은 분명히 조직 치유과정에 발생하는 결체조직합성(fibroblastic) 반응으로 이루어져 있지 않다고 제시했다. 이러한 제시를 뒷받침하는 실험적 연구결과들은 적절한 삼차원적 조직구성을 위해서는 콜라젠과 decorin의 비율의 중요성을 강조하였는데, 세포외 기질에서 정상량 이상의 decorin의 발현은 조직의 scarring을 적게 하고 TGF-β 활성도를 중화시킨다고 하고 있다. 이와는 대조적으로 biglycan 유전자 발현의 결핍이 결체조직 합성반응의 저하와 관련이 있다고 알려져 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 즉 정상 또는 높은 농도의 decorin 및 낮은 농도의 biglycan 수치가 콜라젠 합성을 억제하고 조직의 삼차원적구조를 변화시킨다는 중요한 원칙이 성립한다고 하고 있다. 이러한 측면에서 볼 때, 정상적인 수치의 decorin과 낮은 수치의 biglycan과 lumican이 비용조직의 낮은 섬유화 정도와 또 이로 인한 부종성 조직변화가 유발되는데 어떠한 연관이 있을 수 있다고 생각된다. 또한 비용이 주로 사골동 점막에서 기원하는 것을 생각할 때 비용에서 PGs 발현량의 변화가 발생부위와 관련된 발현형태에 기인할 수도 있을 것이다.

결     론

   PG gene은 정상 비점막 조직과 비용조직 모두에서 발현하며 또한 비용조직에서 정상 비점막에 비하여 lumican과 biglycam mRNA는 낮게 검출되었고 decorin mRNA의 양은 변화가 없었다. 이러한 PGs 발현량의 변화가 정상 비점막 조직의 삼차원적 구조변화와 연관되어 비용의 형성과정에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

1. Nakagawa T, Yamane H, Shigeta T, Takashima T, Nakai Y. Interaction between fibronectin and eosinophils in the growth of nasal polyps. Laryngoscope 1999;109:557-61.

2. Norlander T, Westrin KM, Fukami M, Stierna P, Carlsoo B. Experimentally induced polyps in the sinus mucosa: a structural analysis of the initial stages. Laryngoscope 1996;106:196-203.

3. Nakagawa T, Yamane H, Nakai Y, Shigeta T, Takashima T, Takeda Z. Comprarative assessment of cell proliferation and accumulation of extracellular matrix in nasal polyps. Acta Otolaryngol (Stockh) 1998;Suppl 538:205-8.

4. Wang QP, Escudier E, Roudot-Thoraval F, Abd-Alsamad I, Peynegre R, Coste A. Myofibroblast accumulation induced by transforming growth factor-beta is involved in the pathogenesis of nasal polyps. Laryngoscope 1997;107:926-31.

5. Larsen PL, Tos M, Kuijpers W, Van der Veek JM. The early stages of polyp formation. Laryngoscope 1992;102:670-7.

6. Labat-Robert J, Bihari-Varga M, Robert L. Extracellular matrix. FEBS Lett 1990;268:386-93.

7. Grover J, Chen XN, Korenberg JR, Roughley PJ. The human lumican gene. J Biol Chem 1995;270:2194-9.

8. Dolhnikoff M, Morin J, Roughley PJ, Ludwig MS. Expression of lumican in human lungs. Am J Respir Cell Mol Biol 1998;19:582-7.

9. Pawlak AS, Hammond T, Hammond E, Gray SD. Immunohistochemical study of proteoglycans in vocal folds. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996;105:6-11.

10. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.

11. Sorokin SP. The respiratory mucosa. In: Weiss T, ed Histology: cell and tissue biology. Part 23. The respiratory system. 5th ed. New York: Elsevier Science Publishing Co;1983. p.789-90.

12. Cauna N, Manzetti GW, Hinderer KH, Swanson EW. Fine structure of nasal polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1972;81:41-58.

13. Elwany S. Ultrastructural observation on primary atrophic rhinitis: effect of partial closure of the nostril. J Otolaryngol 1988;50:389-96.

14. Ohno I, Lea RG, Flanders KC, Clark DA, Banwatt D, Dolovich J, et al. Eosinophils in chronically inflamed human upper airway tissues express transforming growth factor beta 1 gene (TGF beta 1). J Clin Invest 1992 ;89:1662-8.

15. Iozzo RV. The family of the small leucinerich proteoglycans: key regulators of matrix assembly and cellular growth. Crit Rev Biochem Mol Biol 1997;32:141-74.

16. Quantock AJ, Meek KM, Brittain P, Ridgway AE, Thonar EJ. Alteration of the stromal architecture and depletion of keratan sulphate proteoglycans in oedematous human corneas: histological, immunochemical and X-ray diffraction evidence. Tissue Cell 1991;23:593-606.

17. Negrini D, Passi A, De Luca G, Miserochi G. Proteoglycan involvement during development of lesional pulmonary edema. Am J Physiol 1998;274:L203-11.

18. Gray SD, Titze IR, Chan R, Hammond TH. Vocal fold proteoglycans and their influence on biomechanics. Laryngoscope 1999;109:845-54.

19. Jeanette FM, Van Straaten JF, Coers W, Noordhoek JA, Huitema S, Flipsen JT, et al. Proteoglycan changes in the extracellular matrix lung tissue from patients with pulmonary emphysema. Mod Pathol 1999;12:697-705.

20. Westergren-Thorsson G, Hernnas J, Sarnstrand B, Oldberg A, Heinegard D, Malmstrom A. Altered expression of small proteoglycans, collagen, and transforming growth factor-beta 1 in developing bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. J Clin Invest 1993;92:632-7.