교신저자：이남수, 137-701 서울 서초구 반포동 505 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   최근 면역세포화학법의 발달로 각종 척추동물 후구(olfactory bulb)에서 산화질소를 비롯하여 gamma amino butyric acid(GABA), dopamine, acetylcholine, enkephalin, serotonin, somatostatin, glutamate 등과 같은 각종 신경전달물질을 합성 이용하는 신경세포의 형태, 분포 및 작용기전 등이 점차 밝혀지고 있다.
   산화질소는 최근 후각의 전달과 적응에 관여한다고 알려진 전기적 극성을 띄지 않는 유리기로 6~8초의 매우 짧은 반감기를 가지고 있으며, 세포 내에 불안정한 상태로 존재하기 때문에 산화질소를 동정하는데는 이의 합성효소인 산화질소 합성효소(NOS)에 대한 항체를 이용한 면역화학적방법과 in situ hybridization 등의 방법이 널리 이용되고 있다.¹⁾ 이들 NOS는 세포 내에서 L-arginine으로부터 산화질소를 생성하는데 필요한 효소로 두 가지 종류의 아형이 있는데 이들은 구성형 산화질소 합성효소(cNOS)와 유도형 산화질소 합성효소(iNOS)로 구분되며, cNOS는 신경세포에 존재하는 신경성 산화질소 합성효소(nNOS)와 혈관에 분포하는 내피세포성 산화질소 합성효소(eNOS)로 구분된다.²⁾³⁾ 세포내에서 역할로는 혈관에서 혈관확장인자로 작용하고, 백혈구에서는 항암과 항생작용을 하고 중추신경 및 말초신경계에서는 신경전달물질로서 작용하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 
   신경전달조절체로서 산화질소를 함유한 신경세포는 최근 NOS항체를 이용한 면역세포화학법에 의하여 소뇌에서는 glutamine성 과립세포(granule cell)와 GABA성 세포에 그리고 대뇌와 선조체(corpus striatum)에서는 somatostatin, neuropeptide Y 및 GABA성 세포에 존재함이 알려져 있으며,¹⁾ 특히 후구에서는 사구체주위세포(periglomerular cell), 사구체층 (glomerular layer)의 수상돌기, 내망상층(internal plexiform layer)이나 과립세포층(granule cell layer)에 존재하는 것으로 밝혀졌다.⁴⁾
   산화질소작용기전에 대한 연구로는 glutamate가 자극에 의해 후구에서 연접이전 신경세포에서 연접이후 신경종말로 Ca^＋＋이 유입되어 NOS를 활성화함으로써 산화질소를 생성하여 신경전달에 관여하는 모델이 제시되었지만,⁵⁾ 형태학적으로 산화질소가 함유되어 있는 신경세포와 주변신경세포의 연접회로에 대한 자세한 연구는 아직까지 없는 실정이다.
   저자는 흰쥐의 후구에서 NOS에 대한 항체를 이용한 면역세포화학법으로 NOS를 함유한 신경세포의 국소적 분포양상과 이들 신경세포의 연접회로를 밝힘으로써 후각전달에 관여하는 산화질소신경세포의 역할을 연구하고자 한다.

재료 및 방법

   본 실험에 사용한 동물은 건강한 체중 250 g 내외의 수컷 Wista계의 흰쥐 10마리로서 5마리는 광학현미경관찰용 표본 작성에, 그리고 5마리는 전자현미경관찰용 표본 작성을 위하여 사용하였다. 흰쥐를 4% chloral hydrate(10 ml/kg body weight)를 복강 내에 주사하여 마취시킨 다음 0.1 M 인산완충액(pH 7.4)으로 완충시킨 4% paraformaldehyde로 심장을 통하여 관류 고정한 후 두개골을 제거하고, 후구를 절취하여 같은 고정액에 4시간동안 재고정하였다. 이후 vibratome(PELCO 101, Tedpella, Redding, CA, U.S.A.)으로 50 μm 두께의 연속 관상 절편을 작성하고 부유법(free floating method)으로 간접면역과산화효소(indirect immunoperoxidase)법을 이용하여 면역염색을 시행하였다. 면역염색은 조직내 비특이 면역반응을 제거하기 위하여 10% 정상 염소혈청을 적용한 다음 실시하였다.
   면역염색에 사용한 1차 항체는 다크론 항NOS 혈청(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.)으로서 1：5,000으로 희석하여 사용하였고, 2차 항체로는 peroxidase가 표지된 donkey anti-rabbit IgG(희석비율, 1：50；Jackson Immuno Research Lab., West Grove, PA, U.S.A.)를 사용하였다. 각 과정이 끝난 후에는 0.01M 인산완충식염수로 세척한 후 다음 과정을 실시하였고, 항체처리가 끝난 절편들은 0.05% 3,3＇-diaminobenzidine-tetrahydrochloride와 0.01% H₂O₂의 혼합액으로 발색하였다. 이 염색된 표본을 광학현미경하에서 NOS 면역반응 신경세포의 종류와 이들 세포돌기의 분포양상을 관찰하였다. 또한 일부 면역 염색한 절편을 난알부민으로 처리한 대물유리에 붙인 다음 탈수과정을 거쳐 0.3% cresyl echt violet으로 Nissl 이중염색을 실시한 후 후구에 존재하는 신경세포 수와 NOS 면역반응 신경세포의 수(평균±표준편차)를 영상분석기(Image Analysis System, Carl Zeiss Co., Germany)를 이용하여 절편표본의 단위면적(mm²)당 표시하였다.
   NOS 면역반응 신경세포의 미세구조와 이들 세포의 연접회로를 전자현미경으로 관찰하기 위해 위에서 염색한 일부 절편을 1% glutaraldehyde용액 및 1% OsO₄ 용액으로 추가 고정하고 세척액으로 씻은 다음 1% uranyl acetate로 전자 염색한 후 탈수 과정을 거쳐 Epon 812로 포매하였다. 이와 같이 면역 염색된 조직 편에서 광학현미경 관찰결과를 토대로 NOS 면역반응 신경세포와 그 세포돌기가 주로 분포하는 후구부위를 해부현미경하에서 도려내어 Epon mould에 접착시킨 다음 ultratome(Reichert-Jung, Wien, Austria)으로 80 nm 두께의 초박절편을 만들어 전자현미경(JEOL 1200 EX, Jeol, Japan)으로 관찰하였다.

결     과

   흰쥐 후구의 조직학적 구조는 광학현미경하에서 후각신경섬유(olfactory nerve fiber)가 들어오는 쪽부터 후각신경섬유층(olfactory nerve fiber layer), 사구체층, 외망상층(external plexiform layer), 승모세포층(mitral cell layer), 과립세포층으로 뚜렷이 구분되었으며, 승모세포층과 과립세포층 사이에 있는 내망상층은 뚜렷하지 않았다(Fig. 1).
   NOS 면역반응 세포의 세포체는 주로 사구체층과 과립세포층에 분포하였다(Fig. 1). 사구체층에 위치한 NOS 면역반응 세포의 세포체는 구형 또는 난원형으로 그 크기는 직경이 8.4±0.7 μm였고, 주로 사구체주위 부위에 위치하였으나 가끔 사구체내에 위치한 것도 있었다(Fig. 1). 이들 세포체에서 기시한 신경섬유는 주로 사구체내로 뻗어 있었다. 사구체층에서 단위면적(mm²)당 출현하는 NOS 면역반응세포는 1266.7±208.2개로서, Nissl 염색으로 확인한 이 층에 위치한 총 신경세포(5066.7±814.5/mm²)의 25.0%를 차지하였다. 이들 NOS 면역반응 세포는 그 미세구조 및 세포의 크기와 위치로 미루어 단축삭세포의 일종인 사구체주위세포였다.⁶⁾⁷⁾ 이 세포에서 세포체의 대부분을 차지하고 있는 핵은 평할한 핵막에 의하여 싸여져 있었고, 이질염색질은 핵막을 따라 또는 핵질내에 모여 있었다. 세포질에는 과립형질내세망, 사립체등과 같은 소기관들의 발달이 미약하였다. 이들 세포의 미세구조는 이웃하고 있는 비면역반응 사구체주위세포의 것과 유사하였다(Fig. 2). 이들 NOS 면역반응 사구체주위세포에서 면역반응은 핵막, 사립체, 형질내세망의 표면과 무형기질에 두루 분포하였으나 핵질이나 사립체기질에서는 관찰되지 않았다. 사구체에서 후각신경의 축삭종말(axon terminal), 사구체주위세포의 돌기, 승모세포와 속모세포(tufted cell)의 수상돌기 등이 복잡한 연접을 이루는 것을 확인할 수 있었다. 사구체층에서 NOS 면역반응 세포돌기를 전자현미경으로 관찰한 결과 면역반응성 돌기는 모두 무수초섬유였으며, 면역반응은 연접소포(synaptic vesicle), 신경소관(neurotubule), 사립체의 표면, 연접치밀질(synaptic density) 등에서 관찰되었다(Fig. 2).
   NOS 면역반응 사구체주위세포가 이루는 연접은 모두 통상화학연접 (conventional chemical synapse)으로 연접을 이루는 연접이전돌기 (presynaptic process)는 비면역반응성 사구체주위세포 돌기(Fig. 2), 비면역반응성 후각신경의 축삭종말 및 원심성 섬유의 축삭 종말 등이었다(Fig. 3). NOS 면역반응 사구체주위세포 돌기의 연접이후돌기(postsynaptic process)는 비면역반응 사구체주위세포의 돌기이거나 비면역반응 후각신경종말 등이었으며, 이들 연접은 형태학적 분류상 대칭성 수상돌기- 수상돌기(dendro-dendritic) 연접 또는 수상돌기- 축삭(dendro-axonal synapse) 연접이었다(Fig. 3).
   과립세포층에서 NOS 면역반응 세포들은 단위면적 당 1400.0±173.2 개로서 이 층에 위치한 총 과립세포(7400.0±1212.4/mm2)의 18.9%를 차지하였다. 이 세포들은 비교적 고르게 분포하고 있는데, 이들 세포의 크기는 직경 7.94±0.89 μm이며 대체로 모양은 구형 또는 난원형이었다(Fig. 1). NOS 면역반응 과립세포의 미세구조를 관찰한 결과 핵은 여러 정도의 핵막함입을 보였고, 이질염색질은 핵막을 따라 또는 핵질내에 모여 있었으며, 세포질에는 사립체, 과립형질내세망, 리보소체와 같은 소기관들이 비교적 잘 발달되어 있었다. 이와 같은 구조는 NOS 면역반응 음성 과립세포의 것과 같았다. 이들 NOS 면역반응 과립세포에서 면역반응산물은 핵막, 사립체, 형질내세망의 표면과 무형기질에 두루 분포하였으나 핵질이나 사립체기질에서는 관찰되지 않았다(Fig. 4).
   NOS 면역반응 과립세포의 세포의 연접양상을 관찰한 결과 면역반응 과립세포가 이루는 연접은 모두 화학연접이었다. 면역반응성 과립세포에 연접을 이루는 연접이전 돌기는 비면역반응 과립세포돌기, 승모세포의 축삭 종말 등 이었으며, 형태학적으로 비대칭성 수상돌기- 세포체연접 (dendro-somatic synapse), 수상돌기- 수상돌기(dendro-dendritic) 연접이거나 축삭-수상돌기(axo-dendritic) 연접이었다. 한편, 이들 NOS 면역반응 과립세포의 연접이후 돌기는 미세구조상 승모세포의 수상돌기⁸⁾로 판단되었다(Figs. 4 and 5).

고     찰

   후각정보의 처리과정에는 GABA, dopamine, glutamate 등과 같은 신경활성물질과⁹⁾ cyclic guanosine 5-monophosphate(cGMP)와 inositol 1,4,5-triphosphate(IP3) 등의 이차 전달체 등⁴⁾이 관여하고 있음이 최근의 연구로 점차 밝혀지고 있다. 이들 물질 중 NOS와 보조인자인 NADPH 등에 의해 L-arginine에서 합성되는 산화질소가 soluble guanylyl cyclase를 활성화시키고 이는 cGMP를 증가시킴으로써 후구에서 후각전달과 후각적응(olfactory adaptation)에 관여하는 것으로 보고되고 있다.⁴⁾⁵⁾ 산화질소는 기체로서 확산성이 있는 세포간 전달물질로 중추신경 및 말초신경에 존재하며,⁴⁾ 척추동물 신경계통에서 NOS 면역반응 신경세포에 대한 면역세포화학적 연구는 후구를 비롯하여 뇌편도(amygdala), 후열(rhinal fissure), 해마(hippocampus), 대뇌피질, 상구(superior colliculus), 소뇌 및 망막 등에서 이루어졌다.^1)11)12) 
   이 연구에서 NOS에 대한 항체를 이용한 면역세포화학법으로 흰쥐 후구에 있는 NOS 면역반응 신경세포를 동정한 결과 NOS 면역반응세포는 사구체주위세포와 과립세포임을 알 수 있었다. 이는 흰쥐 후구에서 NOS 면역반응 신경세포는 일부의 사구체주위세포, 과립세포라는 보고¹¹⁾와 상응하는 결과이다. 한편 승모세포가 NOS 면역반응을 나타냄을 보고하였는데,¹³⁾ 이 연구에서는 NOS 면역반응을 나타내는 승모세포를 전혀 관찰할 수 없었다. 이는 면역세포화학법의 기술적 차이나, 또는 승모세포에서 NOS의 활성이 동물의 조건에 따라 달라 질 수 있음을 시사하는 것으로 생각되나, 앞으로 밝혀야할 과제로 생각된다.
   후구에서 사구체주위세포와 과립세포는 개재신경원(intrinsic neuron)이며 사구체주위세포는 단축삭세포 범주 안에 들어가는 신경세포로 짧은 수상돌기를 내고 후구의 사구체 안에서 분지를 내어 사구체내에서 승모세포 및 속모세포의 수상돌기와 1형과 2형의 통상화학연접을 한다. 또한 사구체주위세포의 약 25%가 상호연접(reciprocal synapse)을 한다고 알려져 있다.⁷⁾ 또한 후각신경을 통해 후각 정보를 받아 이를 승모세포와 속모세포로 전달하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾⁸⁾ 현재까지 연구결과에 의하면, 사구체주위세포는 이용하는 신경활성물질의 종류에 따라 NOS성 세포,¹¹⁾ dopamine성 세포,¹⁴⁾ GABA성 세포,¹⁵⁾ cholecystokinin성 세포,¹⁶⁾ enkephalin성 세포¹⁵⁾로 구분된다.
   이 연구에서 NOS 면역반응 사구체주위세포는 후각신경의 축삭종말과 다른 종류의 사구체주위세포로부터 연접입력(synaptic input)을 받고, 후각신경의 축삭종말과 다른 사구체주위세포에 연접출력(synaptic output)을 이루고 있음을 확인하였다. 이는 NOS 면역반응 사구체주위세포는 다른 종류의 사구체주위세포나 후각신경으로부터 영향을 받은 후 다시 다른 종류의 사구체주위세포나 후각신경 축삭에 영향을 미치는 작용을 나타내는 형태학적 증거로 생각된다. 그러나 다른 종류의 사구체주위세포가 합성 이용하고 있는 신경활성 물질의 종류는 이 실험의 결과로서는 알 수 없으며 장차 밝혀져야 할 과제로 생각된다.
   과립세포는 세포돌기를 과립세포층과 외망상층으로 분지하여 투사신경원인 승모세포와 속모세포를 조절하는 개재신경원으로 알려져 있으며,⁶⁾ 함유하고 있는 신경활성물질의 종류에 따라 NOS성 세포,¹¹⁾ GABA성 세포,¹⁵⁾ enkephalin성 세포,¹⁷⁾ substance P성 세포¹⁸⁾로 구분됨이 밝혀졌다. 이 실험에서 NOS 면역반응 과립세포는 다른 종류의 과립세포나 승모세포로부터 영향을 받은 후 승모세포에 영향을 미치는 연접회로를 확인하였다. 이는 과립세포는 승모세포와 연접을 이루는 개재신경원이며, 승모세포로부터 분비되는 흥분성 신경전달물질인 glutamate에 의해 과립세포가 조정된다는 Nakanishi⁹⁾의 보고와 상응하는 결과로 생각된다. 후구에서 산화질소의 작용기전에 대한 연구에 의하면 NOS성 신경세포는 흥분성 아미노산 수용체에 의하여 활성화되어 산화질소를 합성하고, 합성된 산화질소는 이웃에 위치하고 있는 신경세포나 신경교세포로 확산되어 세포내 guanylyl cyclase를 통하여 cyclic GMP를 활성화시킨다는 보고⁵⁾로 미루어 NOS 함유세포에서 합성된 산화질소는 세포막을 통하여 확산되어 이웃에 위치하고 있는 다른 신경세포에 영향을 미칠 것으로 생각된다.
   이 연구에서 NOS 면역반응 사구체주위세포는 총 사구체주위세포 중 25.0%를 차지하였고, NOS 면역반응을 보이는 과립세포는 총 과립세포 중 18.9%를 차지하였다. 이는 흰쥐 후구에서 GABA성 사구체주위세포는 총 사구체주위세포 중 90.6%를 차지하고, 과립세포 중 95.4%가 GABA성이라는 연구보고¹⁹⁾로 미루어 볼 때, 일부의 사구체주위세포와 과립세포는 억제성신경전달물질인 GABA와 NOS를 함께 함유할 것으로 생각된다. 이는 흰쥐 후구에서는 아직 밝혀진 바 없으나, 토끼와 흰쥐의 망막에서 NOS 면역반응 세포는 GABA성 세포의 아형을 이룬다고 보고된 바 있다.²⁰⁾ 따라서 NOS 함유신경세포에서 합성된 산화질소는 GABA와 함께 분비되어 GABA는 NOS 면역반응 세포와 연접을 이루는 세포를 차단하고, 산화질소는 NOS 면역반응 세포와 연접을 이루지 않는 주위의 신경세포에 작용할 또 다른 전달로가 있을 것으로 생각되며, 이는 장차 연구로 밝혀야 할 과제로 생각된다.

결     론

   후구에 있는 NOS 면역반응 사구체주위세포의 돌기는 사구체내에서 비면역반응 후각신경의 축삭종말 및 비면역반응 사구체주위세포와 연접을 이루고, NOS 면역반응성 과립세포의 돌기는 비면역반응성 과립세포 및 승모세포의 축삭돌기와 연접을 이루어 개재신경원으로 작용하며, 이들 NOS 면역반응세포에서 분비된 산화질소는 후각정보의 분석과 처리과정에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

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