서     론

   현재 진주종의 병리기전을 밝히기 위한 연구 방법 중 대표적인 것이 동물모델을 이용하거나 진주종 세포의 배양을 이용하는 방법이다. 피부 각질형성세포의 실험실내 배양은 1975년 Rheinwald와 Green¹⁾에 의하여 최초로 시행되었으며 이 방법에 의한 중이 진주종의 배양은 1983년에 Proops 등²⁾에 의하여 explant culture가 최초로 발표되었다. 이 배양법은 방사선 조사를 한 쥐의 섬유아세포(murine 3T3 cells)를 영양층으로 배양기에 부착시킨 후 그 위에서 각질형성세포를 배양하는 방법이므로 인체의 환경과는 상이한 영양층의 작용 및 혈청 내에 함유된 입증할 수 없는 영향인자가 포함되어 정확한 목적세포만의 성질을 알기 위한 실험실내 배양으로는 부적합한 면이 있었다. 이후 Yoon 등³⁾은 혈청과 영양층을 포함하지 않는 무혈청 배양액을 사용한 진주종 배양을 발표하였다.
   중이 진주종 각질형성세포의 배양은 실제 생체와 같은 환경의 조성이 아니므로 각질형성세포의 환경에 따른 생물학적 특성을 해석하기 어려운 면이 있다. 영양층과 혈청이 함유된 배양의 단점을 무혈청 배양으로 극복할 수 있었으나 실제 인체와 동일한 상황에서 진주종의 세포생물학적인 특성을 연구하려면 동일 개체에서 추출한 진주종의 각 구성세포를 함께 배양하여 인체와 유사한 환경을 제공한 상태에서 세포간의 영향 및 기능을 검사하여야 한다. 최근 인체 표피와 유사한 조직을 얻을 수 있는 각질형성세포의 삼차원적인 배양방법이 개발되어 피부의 분화연구에 이용되고 있다.⁴⁾⁵⁾
   중이 진주종은 조직학적으로 기질(matrix)과 주위기질(paramatrix)로 구성되고 기질은 중층의 각질형성세포이며 주위기질에서 가장 흔한 세포는 미성숙된 섬유아세포이다.⁶⁾ 중이 진주종의 구성상 기질의 각질형성세포의 증식 및 분화는 섬유아세포의 영향을 받을 수 있으므로 이러한 세포간의 영향을 연구하려면 각질형성세포와 섬유아세포를 삼차원적으로 함께 배양하여야 한다고 생각된다.
   위와 같은 배경 하에 본 연구는 다음과 같은 목적으로 계획되었다. 첫째, 진주종의 새로운 연구모델인 삼차원적 배양시스템을 구축하고자 한다. 중이 수술시 채취한 진주종 조직에서 각질형성세포 및 섬유아세포를 추출하여 인체에서와 같이 서로간의 영향을 미칠 수 있는 삼차원적 배양 시스템을 구축한다. 이러한 삼차원적 배양 시스템의 완성도를 검증하기 위하여 배양된 각질형성세포를 면역조직화학적으로 표식자를 통하여 동정한다. 둘째, 동일한 배양시스템 하에서 섬유아세포 유무에 따른 각질형성세포의 배양상태를 비교하여 섬유아세포가 각질형성세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석하고자 한다.

대상 및 방법

대상 및 재료

   진주종 조직은 1998년 11월부터 1999년 1월까지 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과에서 진주종성 중이염으로 수술 받은 환자에서 수술시 채취한 10예의 진주종 조직을 대상으로 하였다.
   각질형성세포의 동정 및 분화지표는 분화된 각질형성세포에서 발현되는 cytokeratin에 대한 mouse anti-cytokeratin 34βB4(Enzo Diagnostics, Inc., NY, USA)와 involucrin에 대한 rabbit anti-human involucrin(Biomedical Technologics Inc., Stoughton, MA, USA)을 이용하였다.

방  법

삼차원적 세포 배양

진주종 조직의 각질형성세포 배양
   진주종 수술시 채취된 진주종 조직을 phosphate buffered saline(이하 PBS라 약함)용액에 담아 즉시 실험실로 옮겨 penicillin G sodium 100 units/ml, streptomycin sulfate 100 μg/ml, amphotericin B 0.25 μg/ml 가 첨가된 PBS용액으로 3~4회 세척하였다. 세척된 조직에서 각질층을 가능한 제거한 후 0.05% trypsin-0.53mM ethylenediamine tetraacetic acid(Gibco BRL Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA, 이하 trypsin-EDTA)용액에 넣어 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 90분간 방치하였다. 여기에 소량의 fetal bovine serum을 첨가하여 trypsin활성을 제거한 후 시험관에 옮기고 진탕기에서 1~2분 진탕하여 낱개의 세포가 유리되도록 하였다. 유리된 세포는 PBS로 2~3회 세척한 뒤 Medium 154(Cascade Biologics Inc., Portland, Oregon, USA, 이하 M154) 무혈청 배양액으로 배양하였다. 세포가 90%정도의 단층을 형성하면 대기에 노출시켜 계대배양하였다.

진주종 주위기질의 섬유아세포 배양
   진주종 조직을 trypsin-EDTA용액으로 처리하여 표피 및 기질 세포를 제거하고 남은 조직을 PBS 용액으로 2~3회 세척한 후 1 mm³ 크기의 조직단편을 만들었다. 이 조직단편들을 배양용 접시 위에 고정시킨 다음 fetal bovine serum이 10%되게 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 세포가 단층을 형성할 때까지 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 단층을 형성하면 계대배양하였다.

섬유아세포와 각질형성세포의 공배양(co-culture)
   2차 계대배양한 진주종 각질형성세포를 trypsin-EDTA로 처리하여 낱개의 세포로 유리시킨 후 세포농도를 M154 배지에 2.5×10⁵ 세포로 조정하였다. 이들 세포를 collagen 막(Koken, Cellgen, Tokyo, Japan)위에 0.5~2 ml씩 분주하여 단층의 세포층이 형성되도록 한 후 진주종의 주위기질 섬유아세포가 단층으로 배양된 6-well plate로 옮겨 7일간 배양하였으며 2~3일마다 배양액을 교환하였다. 일주일 후 collagen 막 위의 배양액을 제거하여 기질세포가 공기에 노출되도록 한 후 8일 간 배양하였다(Fig. 1). 배양액은 매 2일마다 교체하였다.

면역조직화학염색
   배양된 각질형성세포층은 collagen 막과 함께 배양액에서 구조적 변형이 없도록 조심스럽게 들어내어 10% neutral formalin 용액에 고정하여 파라핀 포매 후 6 μm의 두께로 연속절편을 작성하여 gelatin 처리된 슬라이드에 붙인 후 일부는 hematoxylineosin 염색하여 형태학적 관찰을 시행하였고 나머지 조직절편들은 다음과 같은 과정을 거쳐 각질형성세포의 지표로 사용되는 cytokeratin과 involucrin에 대한 면역조직 화학염색을 시행하였다.
   Xylene으로 탈파라핀화 후 100%, 90%, 80%의 연속적 알콜과 증류수로 함수시켰다. 내인성 과산화 효소의 반응을 억제시키기 위하여 3% hydrogen peroxide에 15분간 반응시켰으며 cytokeratin 염색은 pepsin으로 15분간 처리하였다. 이후 Tris 완충액으로 5분간 2회 세척 후 cytokeratin에 대한 일차 항체는 mouse anti-cytokeratin 34βB4(Enzo Diagnostics, Inc., NY, USA)를 involucrin에 대한 일차 항체는 rabbit anti-human involucrin(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA, USA)을 1시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액으로 5분간 2회 세척하였으며 Large Volume DAKO LSAB^® Kit(DAKO Corporation, CA, USA)를 이용하여 발색을 유도한 후 diaminobenzidine(DAB, Sigma, USA)시약으로 10분간 처리하였고 1분간 Harris hematoxylin염색으로 대조염색하였다.

결     과

중이 진주종의 3차원적 세포배양 시스템
   10예의 배양 중 7예는 감염에 의한 원인으로 실패하였고 3예에서 성공적으로 배양을 수행하였다. 진주종 주위기질의 주요세포인 섬유아세포의 영향하에 진주종 기질세포인 각질형성세포를 중층으로 배양하기 위하여 세포에서의 분비물이 자유롭게 통과할 수 있는 collagen 막을 사이에 두고 상부에 각질형성세포를, 하부의 6-well plate 바닥에는 섬유아세포를 배양하였다(Fig. 1).
   Collagen 막의 상부에 배양된 세포층이 진주종 기질의 각질형성세포로 구성되었음을 동정하기 위한 cytokeratin 및 involucrin에 대한 면역조직화학 염색에서 두 가지 검사 모두에서 배양층 전체에서 갈색으로 염색되어 각질형성세포로 구성되었음이 관찰되어 삼차원적 분리공배양이 성공하였음을 확인하였다. 면역조직화학적 검사상 cytokeratin에 대한 조직염색에서 세포층 전체에 갈색으로 염색되었고(Fig. 2A) involucrin에 대한 조직염색에서도 세포층 전체에서 갈색으로 염색되어(Fig. 2B) collagen막 상부의 세포층은 각질형성세포로 구성되었음을 동정하였다.

섬유아세포의 각질형성세포 배양에 대한 영향

   섬유아세포의 각질형성세포 배양에 대한 영향을 알아보기 위하여 삼차원적 배양 시스템과 동일한 조건이면서 collagen층 하부에 섬유아세포를 배양한 상태와 배양하지 않은 상태를 비교하였다. 각질형성세포층의 hematoxylineosin 염색을 통한 비교에서 섬유아세포와 함께 배양한 각질형성세포는 세포층이 증가되고 세포핵의 형태가 비정형적인 미분화 소견을 나타내어 섬유아세포는 각질형성세포의 증식 촉진 및 분화 억제를 조장하는 효과를 나타내었다. 이러한 소견의 관찰을 통하여 본 연구에서의 3차원적 세포배양 시스템은 섬유아세포의 각질형성세포에 대한 영향을 반영시키고 있음이 확인되었다(Fig. 3A and B).

고     찰

   중이 진주종은 조직학적으로 기질(matrix)과 주위기질(paramatrix)로 이루어진다. 기질은 중층의 각질형성세포로 구성되며, 주위기질은 미성숙된 섬유아세포가 가장 많이 분포하고 상피하 결합조직 및 육아조직으로 구성된다.⁶⁾
   지금까지 각질형성세포의 배양이 어려웠던 점은 각질형성세포보다 매우 빠르게 증식하는 섬유아세포에 의해 각질형성세포가 도태되며, 또한 기저세포에서 각질세포로 빠르게 분화하여 사멸하는 점이었는데, Rheinwald와 Green¹⁾은 각질세포의 배양 시에 방사능을 쬐어 죽인 3T3 세포를 배양 기질로 이용하여 이러한 문제를 극복하였다. 그 후 이 방법은 각질형성세포의 배양에 많이 이용되었으나, 3T3 세포 기질이라는 규명되지 않은 진피 성분이 각질형성세포의 증식과 분화 억제에 필수적인 요소로 작용한다는 점이 문제가 되었다. 이후 MCDB(Department of Molecular, Cellular & Developmental Biology) 배양액이 개발되어 혈청 없이 각질형성세포를 배양할 수 있게 되었다.⁷⁾
최근에 인체의 표피와 유사한 기저세포층, 유극세포층, 과립층, 각질층으로 구성된 피부조직을 얻을 수 있는 각질형성세포의 삼차원적인 배양이 개발되어 피부의 분화연구, 피부에서의 독성검사, 약물대사 등의 연구에 이용되고 있다.⁴⁾⁵⁾ 삼차원적 배양은 단층 배양에 비해 생체에 근접한 환경을 제공할 수 있고 삼차원적 배양한 섬유아세포는 생물학적 차이뿐만 아니라 형태학적인 면에 있어서도 차이를 보여 섬유아세포의 생물학적 연구에는 삼차원 배양 모델이 적절하다고 보고되었다.⁸⁾ 그러나 현재까지 진주종의 연구에서는 삼차원적 배양에 대한 보고가 없었는데 이는 중이염 수술시 채취한 진주종 대부분에서 염증조직을 동반하므로 채취한 시료를 배양할 경우 배양의 감염 가능성이 많고, 채취한 시료 자체의 양이 적기 때문에 목적한 세포를 추출하기가 힘들며 배양시 세포에 적절한 환경조성의 어려움이 있기 때문이었다.
   중이 진주종은 대부분 감염을 동반하므로 세포배양 시 세균에 의한 오염을 방지하기 위하여 Proops 등²⁾은 penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg/ml, amphotericin-B(Fungizone^®) 등을 배양액에 첨가하였는데 본 연구에서도 같은 용량의 항생제가 첨가된 PBS용액에 진주종 조직을 3~4차례 세척하여 감염을 방지하였다. 본 연구에서는 제한된 시료 양으로 인한 배양의 어려움을 극복하기 위해서 세척된 진주종조직을 trypsin 처리하여 기질을 효소분해 한 후 진탕하여 주위기질의 섬유아세포가 제외된 낱개의 기질세포를 분리하고 각질형성세포의 선택적 배지인 M154 무혈청 배양액에 배양하여 진주종 각질형성세포에 적절한 환경이 조성되도록 하였다. 또한 주위기질세포의 대부분을 차지하는 섬유아세포를 각질형성세포와 함께 공배양(co-culture) 하였다. 섬유아세포에서 유리되어 각질형성세포의 증식과 분화에 영향을 미칠 것으로 보여지는 물질들이 자유롭게 통과되어 각질형성세포에 도달할 수 있도록 collagen 막 위에 대기를 노출시킨 상태로 기질 세포인 각질형성세포를 배양하여 인체내의 환경과 유사한 상황을 조성하였다. 배양된 조직은 정상적인 구조물보다 유약하여 파라핀포매 등의 고정작업 중 조직의 손상 및 유실을 가능한 피하도록 섬세하고 조심스러운 작업이 필요하였다.
   본 연구에서는 진주종 각질형성세포의 삼차원적 배양에서 정상피부와 같은 기저층, 극상층, 과립층, 각질층의 뚜렷한 구분을 관찰할 수 없었고 각질층의 형성이 미약하였다. 이것은 각질형성세포의 배양 시 대기 노출시간이 짧았거나 섬유아세포의 직접적인 세포접촉으로 인한 영향의 결여, 밝혀지지 않은 collagen막의 세포분화에 미치는 영향 등을 고려할 수 있겠다.
   본 연구에서 각질형성세포를 섬유아세포와 함께 공배양시 각질형성 세포층의 증가가 관찰되고 세포핵의 형태가 다양하게 나타나는 등의 증식이 증가되고 분화가 억제된 소견을 보여서 섬유아세포가 각질형성세포의 증식과 분화에 영향을 미치는 것을 시사하였다.
   광학현미경적 조직검사 상 정상고막이나 외이도 상피와 비교해 볼 때 상피하 염증조직 이외에는 조직학적 차이는 관찰되지 않으면서도 어떻게 진주종이 특징적인 임상양상을 유발하는지에 대한 중이 진주종의 병리기전에 대한 많은 생화학적, 면역조직화학적 연구가 이루어져 왔다. 진주종의 병인에 대한 면역조직화학적 연구에서 진주종의 과증식 성향 연구에 있어서는 Wullstein 등⁹⁾이 진주종에서 기저세포의 증식이론(basal cell proliferation theory)을 제시한 이래 증식능력을 가진 기저세포 수의 증가를 확인하였고 기저세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아있음을 cytokeratin¹⁰⁾과 PCNA(proliferating cell nuclear antigen),¹¹⁾ cytokine¹²⁾ 등을 통한 면역조직화학적 연구에서 확인하였다. 그리고 진주종 상피에서 특징적으로 보여지는 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져 있으며,¹³⁾ Stammberger 등¹⁴⁾은 involucrin과 filaggrin 분화인자를 이용한 면역조직화학적 연구에서 기저상부세포에서의 조기분화(early differentiation)를 확인하였다.
   본 연구에서 편평상피세포의 분화 표식자로 사용된 anti-cytokeratin34βB4는 분화된 편평상피세포의 기저상부층 에서만 염색되는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 본 연구의 중이 진주종 기질세포의 배양에서 각질층을 제외한 부위에서 염색되는 소견을 보여 편평상피세포가 배양되었음을 확인할 수 있었다.
   Involucrin은 Rice와 Green¹⁶⁾에 의해 처음으로 규명되어 졌으며 인체의 편평상피에서 합성되는 일종의 세포질 단백으로써 인체 중층편평상피의 성숙과정에 있는 세포는 원형질막의 세포질면에 약 12 nm 두께인 단백 기낭(protein envelope)을 형성하는데 involucrin은 이 단백질의 수용성 단백 전구물질이다. 분자량이 140 kD의 비교적 고분자량의 세포질 단백으로써 인간의 정상표피에서는 과립층과 상부극세포층의 각질형성 세포에서 발견되고 기저층과 각질층에서는 대개 발견되지 않으므로 편평상피 세포의 중간단계 분화(intermediate stage of squamous differentiation)에 대한 좋은 지표로 사용되어지고 있다. 정상 피부에 대한 involucrin의 반응에 관한 연구에서 Murphy 등¹⁷⁾은 표피의 상부 1/3에서 세포질이 균일하게 염색되었고 기저각질세포(basal keratinocyte)와 극세포층(stratum sponsiosum)의 직상부층은 염색이 안된다고 보고하였다. Park¹⁸⁾등은 생체 진주종을 대상으로 한 연구에서 8예 중 7예에서 상부 1/3이외에 기저상부층에서도 염색되어졌다고 발표하였다. 본 연구에서도 중이 진주종 기질세포의 배양에서 involucrin이 각질층 이전부위까지 강하게 염색되는 소견을 보여 정상 상피세포의 성숙을 시사하는 것으로 보여졌다.

결     론

   생물학적 연구에서는 단층 배양 모델에 비하여 인체내의 환경과 근접한 3차원적 배양 모델이 더 적절하다고 생각되나 아직 중이 진주종 기질세포의 삼차원적 배양에 성공한 문헌적 보고는 없었다. 본 연구는 중이수술 중 채취한 중이 진주종에서 기질세포 및 주위기질세포를 분리 후 서로간의 영향력을 보존한 상태의 삼차원적 세포배양 시스템을 구축하는데 성공하였으며, 섬유아세포가 각질형성세포의 배양에 미치는 증식 증가 및 분화 억제의 영향을 관찰하였다. 이 시스템은 향후 중이 진주종의 세포생물학적 특성 연구에서 단일 세포만의 분석이 아닌 세포간의 연관성을 연구하는데 도움을 줄 것으로 생각된다.

1. Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes. The formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975;6:331-43.

2. Proops DW, Parkinson EK. Tissue culture of human cholesteatomatous keratinocytes. Clin Otolaryngol 1983;8:165-70.

3. Yoon TH, Sung KJ. In vitro culture of human keratinocyte of external ear and cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1996;39:754-61.

4. Bell E, Parenteau N, Gay R, et al. The living skin equivalent: Its manufacture, its organotypic properties and its responses to irritants. Toxic In Vitro 1991;5:591-6.

5. Regnier M, Prunieras M, Woodley D. Growth and differentiation of adult human epidermal cells on dermal substrates. Front Matrix Biol 1981;9:4-35.

6. Park KH, Lee JH, Kim KY, Kang JS, Park SI. Morphological evaluation for cholesteatomatous otitis media. Korean J Otolaryngol 1988;31:212-23.

7. Boyce ST, Ham RG. Calciumregulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serumfree serial culture. J Invest Dermatol 1983;81Suppl:33s-40s.

8. Weber L, Mauch C, Kirsch E, Muller P, Krieg T. Modulation of collagen type synthesis in organ and cell cultures of fibroblast. J Invest Dermatol 1986;87:217-20.

9. Wullstein HL, Wullstein S. Cholesteatoma, etiology, nosology, and tympanoplasty. Ann Otol Rhinol Laryngol 1980;42:313-5.

10. Chao WY, Huang CC. An immunohistochemical study of cytokeratin expression in human middle ear cholesteatoma. Arch Otorhinolaryngol 1989;246:37-42.

11. Uchida N, Ito S, Hirano M. Localization of prolifreative cell nuclear antigen in aural cholesteatoma. Kurume Med J 1993;40:225-8.

12. Yan SD, Huang CC. Lymphotoxin in human middle ear cholesteatoma. Laryngoscope 1991;101:411-5.

13. Stammberger M, Bujia J, Kastenbauer E, Schilling V. Hyperproliferation associated keratin expression in human middle ear cholesteatoma. Acta Otolaryngol (Stockh) 1993;113:364-8.

14. Stammberger M, Bujia J, Kastenbauer E. Alteration of epidermal differentiation in middle ear cholesteatoma. Am J Otol 1995;16:527-31.

15. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins. Am J Pathol 1984;114:309-21.

16. Rice R, Green H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precusor of the cross-linking by calcium ions. Cell 1979;18:204-8.

17. Murphy GF, Flynn TC, Rice RH, Pinkus GS. Involucrin expression in normal and neoplastic human skin: A marker for keratinocyte differentiation. J Invest Dermatol 1984;82:453-7.

18. Park KH, Park HJ, Chun YM, Lee JS, Kim HJ. Immunohistochemical study for differentiation of human middle ear cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1998;41:1521-6.