서     론

   알레르기성 비염의 특징은 호산구, 림프구 등의 출현과 더불어 싸이토카인, 효소, 접착분자 등 여러 종류의 염증성 단백질의 발현 증가가 특징이다.¹⁾ 그러나 알레르기성 비염에서 지속적인 싸이토카인 발현의 유도와 염증세포의 보충 및 활성화에 관여하는 분자생물학적 조절 기전은 아직 확실히 알려져 있지 않다.¹⁾
   유전자 전사(gene transcription)란 DNA원형으로부터 RNA가 합성되어 유전자로부터 단백질이 합성되는 과정으로, 전사인자는 이 과정에서 특정 유전자의 촉진자 부위에 결합하여 그 유전자의 발현을 조절하는 단백질이다.²⁾ 천식에서 보이는 싸이토카인이나 chemokine, 효소 등 염증성 단백질의 증가는 전사인자들에 의해 이러한 염증단백질 유전자들의 전사가 증가하여 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.³⁾ 이러한 전사인자들 중에는 nuclear factor-κB(NF-κB), activator protein-1(AP-1), nuclear factor of activated T-cells(NF-AT), cyclic AMP response element binding protein(CREB), signal transduction-activated transcription factors(STAT) 등이 있다.⁴⁾ 이들 중에 NF-κB 및 이에 결합하여 활성화를 억제하는 전사인자인 Inhibitory κB(I-κB)는 면역과 염증반응에 관여하는 여러 종류의 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자로 알려져 있다.⁵⁾
   지금까지 천식을 비롯한 여러 염증성 질환에서 NF-κB의 증가가 보고되고 있으며³⁾ 천식성 기도점막에서 보이는 호산구의 증가에 NF-κB가 관련됨이 알려져 있다.⁶⁾ 그러나 알레르기성 비염에서는 NF-κB 및 I-κB의 발현에 관하여 알려진 바가 없다. 이에 저자들은 정상 및 알레르기성 비염환자의 비점막에서 NF-κB와 I-κBα의 분포양상을 관찰하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상

   대상 환자군은 대상환자는 통년성 알레르기성 비염 20례(남 11, 여 9, 평균 27세), 정상군 7례(남 3, 여 4, 평균 31세) 등 두 군으로 나누어 시행하였다. 모든 환자는 1개월전부터 모든 약물을 끊은 상태에서 알레르기성 비염의 전형적인 임상적 증상을 보이며 피부단자 검사상 집먼지 진드기Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus 등에 3＋ 이상의 반응이 있었고, 집먼지 진드기에 대한 Radioallergosorbent test(RAST) 검사로 확인된 경우로 하였다. 정상대조군은 비중격 교정술을 시행한 환자에서 채취한 편측의 정상 하비갑개 점막조직을 사용하였다. 실험 재료는 하비갑개 전단에서부터 1 cm 뒤에서 겸자로 비점막을 채취하였다.

방     법

면역조직화학적 검사
   파라핀 포매조직을 자일렌을 사용하여 탈파라핀화한 후 100%, 75% 알코올로 함수화하였고 내재성 페록시다아제를 억제하기 위하여 3% 과산화수소를 5분간 반응시켰다. 조직내에 비특이적 결합을 억제하기 위하여 단백질억제제를 실온에서 15분간 적용하였다. NF-κB에는 p50(NF-κB1)과 p65(Rel-A) subunit로 나뉘는데 이중 p65 subunit에 대한 단클론성 항체(Santa Cruz, Delaware, CA)를 1：100으로 희석하고, I-κBα는 다클론성 항체(Santa Cruz, Delaware, CA)를 1；1,000으로 희석한 후 모두 4°C에서 하룻밤 반응시켰다. 이차항체는 바이오틴이 부착된 anti-rabbit immunoglobulin(Dako, Carpitenia, CA)를 상온에서 30분간 반응시킨 후 스트렙아비딘-퍼옥시다제를 15분간 반응시켰다. 발색제로는 3-amino-9 ethyl carbarzole(Zymed, South San Francisco, CA)를 사용하였으며 대조염색으로 Meyer's hematoxylin을 사용하였다. 음성대조군은 일차항체대신 인산완충용액을 사용하여 같은 방법으로 시행한 후 관찰하였다. 400배하의 고배율하에서 한 시야에서 핵질에 염색된 활동형과 세포질에 염색된 비활동형으로 분류하였다(Figs. 1 and 2). 각 슬라이드당 10군데에서 관찰하여 평균을 구하였다.

역전사 중합효소 연쇄 반응

총 RNA의 추출 및 cDNA의 합성
   RNA를 추출하기 위하여 D용액 20 ml에 2 M sodium acetate, DEPC-saturated phenol, β-mercaptoethanol을 첨가한 후 각각의 조직을 100 mg정도 넣고 유리 동질화기를 이용하여 균질화시켰다. 클로로포름을 첨가하여 원심분리하고 상층액을 취한 후 ­20°C에서 이소프로파놀을 넣고 1시간 정도 배양한 후 다시 원심분리하여 총 RNA로 된 침전물을 얻었다. 이것을 70% 에탄올로 세척한 후 원심분리하여 만든 침전물을 증류수 50 μl에 녹인 후 흡광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 RNA의 농도를 정량하였다. 이중 RNA 2 μg에 Moloney murine leukemia virus(Life Technologies, Gaithersberg, MD)역전사 효소, 5x Reverse transcription buffer, 10 mM dNTPs, RNase inhibitor, random hexamer 등을 첨가하여 37°C에서 1시간 반응시킨 후 94°C에서 5분간 불활성화시켜 cDNA를 합성하는 역전사 반응을 시행하였다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)
   cDNA을 이용하여 NF-κB와 I-κBα 유전자의 발현을 보기위해 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응은 5 μl의 cDNA에 10x PCR reaction buffer, 25 mM MgCl 2, 2.5 mM dNTPs, NF-κB와 I-κBα 각각의 20 ρmol의 sense와 antisense primer(Table 1), 또는 GAPDH의 sense와 antisense primer, Taq polymerase, 증류수 등을 넣어 중합효소 연쇄반응에 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer)에서 94°C에서 5분간 변성시킨 후 94°C에서 45초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분 주기로 약 35회 증폭한 후 최종 72°C에서 약 7분간 반응을 연장시켰다. 음성 대조군으로는 cDNA대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 사용하였다. 최종 중합효소 연쇄반응 산물을 2% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide용액으로 30분간 염색하여 확인하였다. 총 RNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대조군으로 GAPDH을 사용하여 각각의 중합효소반응 띠의 밝기를 농도분석기(Image analyser, Bio-Profile, Vilber Lournat, France)를 사용하여 비교하였다.

연구자료분석
   통계학적 분석은 SPSS 7.5 for Windows(version 7.5, SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 paired t-test를 시행하였고 p값이 0.05이하인 경우 통계학적으로 유의하다고 하였다.

결     과

면역조직화학적 분포

   정상 비점막에서 NF-κB의 분포는 상피세포층에서는 기저세포층에 주로 분포하였고 점막하 고유층에서는 염증세포 및 점막하 분비선세포, 혈관 내피 세포 등에 분포함을 보여주었다(Fig. 3). 알레르기성 비염군의 상피층에서는 핵질에 염색된 활동형과 세포질에 염색이 된 비활동형이 모두 정상 대조군에 비해 유의하게 증가되었으나(p<0.05), 점막하 고유층에서는 비활동형만이 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 4).

   I-κBα 양성세포는 비점막 상피세포층과 점막하 고유층에서는 주로 염증세포, 분비선세포 및 혈관 내피세포 등에 분포하였다(Fig. 3). 정상 비점막과 알레르기성 비염에 있어 양성세포의 분포양상의 차이는 보이지 않았다. NF-κB와는 달리 알레르기성 비염군이 비점막 상피세포와 점막하 고유층에서 활동형과 비활동형 모두 정상 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 5).

역전사 중합효소 연쇄 반응

   NF-κB와 I-κBα의 역전사 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동한 결과 각각 532 및 355 염기쌍 크기의 cDNA 띠가 검출되었다. 정상 대조군과 알레르기성 비염군 모두에서 NF-κB와 I-κBα의 발현이 관찰되었다(Fig. 6). 각 군에서 농도분석기를 이용하여 GAPDH와 비교 분석한 결과 NF-κB는 알레르기성 비염군에서 정상군에 비해 의미있게 높게 나왔다(p>0.05). 그러나 I-κBα는 알레르기성 비염군에서 정상군에 비해 약하게 발현되었으나 유의한 차이는 없었다(Fig. 7).

고     찰

   NF-κB는 쥐의 B 림파구에 있는 면역글로부린 κ경쇄 유전자의 발현을 조절하는 인자로 처음 알려졌다.⁷⁾ NF-κB는 Rel 단백질의 일종인 p50아단위와 p65아단위의 결합으로 이루어진 이형이합체로, 비자극 상태에서는 세포질에서 억제 단백질인 I-κB에 붙어 있다가 외부에서 자극을 받아 활성화되면 이 복합체에서 억제 단백질인 I-κB가 떨어져 나간다. 분리된 NF-κB는 핵안으로 들어가 표적유전자인 염증유전자의 촉진자부위에 있는 특정한 κB 염기서열에 붙게 되어 염증유전자의 전사를 급격히 증가시키면서 염증단백질의 합성을 증가시키는 역할을 한다.⁹⁾ NF-κB를 자극하는 인자로는 IL-1β와 TNF-α와 같은 싸이토카인, protein kinase C activator, 바이러스, 오존과 같은 산화제 등으로, 이러한 자극에 의해 활성화된 NF-κB는 면역반응과 염증반응에 관여하는 IL-1β와 TNF-α, GM-CSF, IL-8, RA-NTES, eotaxin, iNOS, COX-2, ICAM-1, VCAM-1들의 유전자 발현을 조절하여 이러한 단백질 분자들의 발현을 증가시킨다.⁸⁾⁹⁾ 본 실험의 결과 NF-κB가 알레르기성 비염에서 증가되는 경향을 보여주었다. 이는 NF-κB의 활성화를 통해 조절받는 염증성 단백질들이 알레르기성 비염의 비점막에 대부분 존재하기 때문에, NF-κB의 활성화를 통해 이러한 단백질들의 발현이 자극받을 수 있다고 생각한다.
   천식의 병태생리에 관여하는 염증 분자들의 작용기전에 NF-κB가 중요한 역할을 하며, 천식환자의 기도상피에서 지속적인 NF-κB의 활성화가 만성 기도염증의 지속을 가져올 수 있다고 알려져 있다.^2-4) NF-κB는 급성 호흡기 질환 증후군 환자의 폐포내 대식세포에서 증가되 있으며,¹⁰⁾ 기도상피세포의 배양에서 IL-1β나 TNF-α에 노출된 후 빠르게 활성화되어 GM-CSF의 발현을 증가시켜 기도상피에서 싸이토카인 유전자들의 발현을 조절하는 중요한 전사인자로 보고되었다.¹¹⁾ 기도상피에서 산소의 감소는 NF-κB를 활성화시키고 iNOS mRNA를 증가시켜 산화자극에 대한 기도의 방어기전에 중요한 역할을 하며,¹²⁾ 비강내 rhinovirus 감염후에 비세정액에서 증가되는 IL-6는 NF-κB에 의해 매개된다고 하였다.¹³⁾ NF-κB의 p50 아단위가 결손된 쥐의 기도상피에서 호산구 증가성 기도염증을 보이지 않았는데 따라서 호산구의 생산 및 활성화에 필요한 IL-5와 eotaxin의 반응을 증폭시키는데 NF-κB가 필요하다고 하였다.⁶⁾
   Wilson 등¹⁴⁾은 비용에서 면역조직화학적 검사상 NF-κB가 상피세포 및 내피세포, 비만세포, 호산구, 림프구와 대식세포 등에 존재하는 것을 보여주었다. 따라서 면역조직화학적 검사는 NF-κB가 생성되는 세포의 종류 및 이들의 세포와 조직에서의 활성화 정도를 확인할 수 있는 방법이며 동시에 염증의 척도가 될 수 있다고 하였다. 그러나 Ramis 등¹⁵⁾은 정상 비점막과 비용에서 iNOS와 관련하여 NF-κB의 분포를 본 결과 NF-κB의 활성화 정도가 차이가 없다고 하였다. 저자들의 실험에서는 NF-κB 양성세포의 분포가 상피세포 및 염증세포와 내피세포 및 분비선 등에 분포하여 Wilson 등¹⁴⁾과 유사한 결과를 보여주었으나, 알레르기성 비염에서는 정상 비점막에 비해 상피세포층에 활성형의 NF-κB가 증가되어 Ramis 등¹⁵⁾과는 다른 결과를 보여주었다. 이와같이 상피세포층에서 NF-κB가 증가되는 이유는 상피세포층이 외부 자극에 의해 지속적으로 노출되어 NF-κB가 활성화되며, 상피세포층에서 NF-κB를 활성화시키기는 싸이토카인 등 염증성 단백질의 분비가 증가되기 때문이라고 생각한다.
   알레르기성 비염에서의 지속적인 NF-κB의 증가는 NF-κB에 의해 조절되는 유전자에 의해 만들어진 물질이 다시 NF-κB를 활성화시키기 때문인데, IL-1β나 TNF-α는 NF-κB를 활성화시키기도 하고 NF-κB에 의해 활성화되기도 한다. 이러한 국소부위의 반응 고리가 염증을 지속시키고 증폭하는 원인이 될 수 있다.²⁾ 또한 NF-κB는 단독으로 유전자전사를 활성화하기에는 불충분하며 Activator-1(AP-1) 등 다른 전사인자들과 동시에 상호작용으로 지속적인 염증을 유발하기 때문에 NF-κB의 지속적인 증가의 원인이 될 수 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾ Thompson 등¹⁸⁾의 실험에 의하면 일부 종류의 자극은 주로 IκB-α복합체에 영향을 주어서 신속하지만 일시적인 NF-κB의 활성화를 초래하지만, 박테리아성 리포다당질 등의 자극은 IκB-α와 IκB-β 복합체에 모두 영향을 주어서 NF-κB를 지속적으로 활성화시키는 것으로 보고하였다.
   본 실험에서 점막하층에서는 비활동형만이 증가하였는데 이는 NF-κB의 활성화된 상태가 상피세포층에서만 국한되고 점막하 고유층까지 진행되지 않는 것으로 생각되며 또한 알레르기성 비염에서 보이는 점막하층에서의 호산구나 대식세포 등의 숫자가 증가된 것과 관련이 있으리라고 생각된다.
   NF-κB의 작용을 억제하는 IκB 단백질의 종류에는 IκB-α, IκB-β, IκB-γ, IκB-δ, IκB-ε가 있는데 이중 IκB-α이 가장 많다.⁸⁾ IκB 단백질은 주로 NF-κB의 p65와 작용하며 p50과는 결합하지 않는다고 알려져 있다.⁵⁾⁸⁾ I-κB는 아직 비점막 및 기도 상피에서 분포하는 위치에 대해 알려진 바가 없으나 저자들의 실험에서는 NF-κB와 유사한 분포양상을 보여주었다. 본 실험에서 IκB-α의 분포는 정상군과 알레르기성 비염군간에 유의한 차이가 없었다. 이와 같이 나타난 이유는 정확히 알 수 없지만 IκB-α의 존재는 NF-κB와 결합되어 비활성화된 형태로 존재하기도 하지만 IκB-α 단독으로도 세포내에 존재하기 때문에⁵⁾⁸⁾ NF-κB의 분포와 다를 수 있으며 또한 알레르기성 비염에서 IκB-α를 활성화에 영향을 주는 다른 기전이 있을 수 있다고 생각한다. 그러나 알레르기성 비염에서의 IκB-α의 역할에 관해서는 더욱 연구가 필요하다고 생각한다.
   향후 알레르기성 비염에서 이러한 NF-κB의 활성화를 조절하는 인자들에 대한 연구를 통해 알레르기 비염에서 보이는 염증성 단백질의 증가 및 활성을 억제하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각한다.

결     론

   알레르기성 비염에서 보이는 알레르기 반응의 활성화에 NF-κB가 영향을 줄 수 있으며, NF-κB는 주로 비점막 상피세포에서 활성화가 이루어진다. 그러나 IκB-α는 알레르기성 비염에서 유의한 차이가 없어 NF-κB와의 관련성을 밝히는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각한다.

1. Christodoulopoulos P, Cameron L, Durham S, Hamid Q. Molecular pathology of allergic disease. II: Upper airway disease. J Allergy Clin Immunol 2000;105:211-23.

2. Barnes PJ, Karin M. Nuclear factor-κB: A pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med 1997;336:1066-71.

3. Barnes PJ, Adcock IM. NF-κB: A pivotal role in asthma and a new target for therapy. Trends Pharmacol Sci 1997;18:46-50.

4. Rahman I, MacNee. Role of transcription factors in inflammatory lung diseases. Thorax 1998;53:601-12.

5. Baeuerle PA, Baltimore D. IκB: A specific inhibitor of the NF-κB transcription factor. Science 1988;242:540-5.

6. Yang L, Cohn L, Zhang DH, Homer R, Ray A, Ray P. Essential role of nuclear factor κB in the induction of eosinophilia in allergic airway inflammation. J Exp Med 1998;188:1739-50.

7. Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immuno-globulin enhancer sequences. Cell 1986;46:705-16.

8. Baldwin AS. The NF-κB and I-κB proteins: New discoveries and insights. Annu Rev Immunol 1996;14;649-81.

9. Blackwell TS, Christman JW. The role of nuclear factor-κB in cytokine gene regulation. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;17:3-9.

10. Schwartz MD, Moore EE, Moore FA, Shenkar R, Moine P, Haenel JB, et al. Nuclear factor-kappa B is activated in alveolar machrophages from patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med 1996;24:1285-92.

11. Jany B, Betz R, Schreck R. Activation of the transcription factor NF-κB in human tracheobronchial epithelial cells by inflammatory stimuli. Eur Respir J 1995;8:387-91.

12. Adcock IM, Brown CR, Kwon OJ, Barnes PJ. Oxidative stress induces NF-κB DNA binding and inducible NOS mRNA in human epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1994;199:1518-24.

13. Zhu Z, Tang W, Ray A, Elias JA. Rhinovirus stimulation of interleukin-6 in vivo and in vitro. Evidence for nuclear factor κB-dependent transcription activation. J Clin Invest 1996;97:421-30.

14. Wilson SJ, Leone BA, Anderson D, Manning A, Holgate ST. Immuno-histochemical analysis of the activation of NF-κB and expression of associated cytokines and adhesion molecules in human models of allergic inflammation. J Pathol 1999;189:265-72.

15. Ramis I, Bioque G, Lorente J, Jares P, Quesada P, Rosello-Catafau J, et al. Constitutive nuclear factor-kappaB activity in human upper airway tissues and nasal epithelial cells. Eur Respir J 2000;15:582-9.

16. Hart LA, Krishnan VL, Adcock IM, Barnes PJ, Chung KF. Activation and localization of transcription factor, nuclear factor-kappaB, in asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998;158:1585-92.

17. Yoon HJ. Transcription factor and asthma. J Asthma, Allergy Clin Immunol 1999;19:127-41.

18. Thompson JE, Phillips RJ, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Ghosh S. IκB-βregulates the persistent response in a biphasic activation of NF-κB. Cell 1995;80:573-82.