서     론

   면역계가 분화되는 과정에서 자신에게 반응하는 면역세포들은 제거되고 자신이 가지고 있는 항원(self antigen)에는 면역관용이 형성되나 이것이 깨지게 되면 자가면역질환이 발생한다고 알려져 있다. 지금까지 동물실험을 통해 암소의 뇌조직,¹⁾ 흰쥐의 간,²⁾ 토끼의 흉선조직³⁾으로 감작시켰을때 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루프스 등의 전신 자가면역질환을 유발시키므로서 내이에서도 자가면역의 발생가능성을 시사하고 있다.
   McCabe⁴⁾가 면역학적 검사소견 및 스테로이드와 면역억제제에 대한 반응을 근거로 자가면역성 감각신경성 난청이라는 용어를 처음 사용하였지만 아직 내이 자가면역질환의 정확한 발생기전은 완전히 규명되어 있지는 않으며 자가항원에 대한 면역관용의 소실, 교차반응항체, 염증이나 약제에 의한 자가항체의 변형 및 조직손상에 의해 노출된 자가항원에 의해서 발생된다고 추정되고 있다.⁵⁾
   자가면역질환은 매우 다양한 임상양상을 보이는데 특히 여성에게 호발하고⁶⁾ 류마치스양 관절염을 앓고 있는 여성의 약 70%에서 배란 중 증상의 일시적인 호전을 보이고 전신성 홍반성 루프스는 임신중 증상이 더 악화되는 것으로 알려져 있다.⁷⁾ 이러한 사실은 자가면역성 질환의 발생기전에 성호르몬이 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다. 테스토스테론은 핵산에 대한 항체가 IgM에서 IgG로 전환되는 것을 지연시키므로서 자가면역 현상을 약화시킬 수 있다고 하였다.⁸⁾⁹⁾
   이에 저자들은 암소 내이 조직항원을 이용하여 흰쥐에서 실험적으로 내이 자가면역을 일으킨 후 이에 대한 치료로서 성호르몬의 일종인 테스토스테론의 치료효과를 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상

   몸무게 200 g의 Wistar 암컷 흰쥐 29마리를 대상으로 하였으며, 그 중 15마리를 내이자가면역 대조군으로 암소 내이항원 단백질로 전신감작만을 시행하였으며 14마리는 테스토스테론 투여군으로 전신감작과 테스토스테론 투여를 시행하였다. 각 동물들은 다시 A, B, C, D의 4군으로 나누어 전신감작 후 1주(A군), 2주(B군), 4주(C군), 8주(D군)에 각각 희생시켰다.

항  원

   암소의 내이조직을 1 μg/m1의 aprotinin 을 포함한 50 mM/L의 Tris 완충용액안에서 조직파쇄(homogenization) 시킨 다음 4°C에서 약 1시간동안 100,000 g의 속도로 원심분리시켰다. 상층액은 버린 후 침전물은 다시 2 mM/L phenylmethylsulfonyl fluoride, 4 mM/L EDTA, 10 mM/L N-ethylmaleimide, 0.5% sodium dodecyl sulfate(SDS)를 포함한 50 mM/L Tris 완충액(pH 6.8)과 24시간동안 4°C에서 혼합시킨 후 10분동안 1,000 g의 속도로 원심분리를 시행하였으며, 상층액은 항원으로 사용하였고 침전물은 폐기하였다. 내이조직으로 부터의 항원 추출물의 단백질 농도는 BCA Protein assay kit(Biochemicals, Ohio, USA)를 이용하여 확인하였다.

전신감작 및 테스토스테론 투여

   내이자가면역 대조군의 각 실험동물(ABC군 각 4마리씩, D군 3마리)에게 1주 간격으로 3주에 걸쳐 암소 내이 조직항원을 흰쥐의 등에 표피하 주사하였다. 제 1 회에는 1 mg(250 μl)의 항원을 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)와 섞은 후 동량의 complete Freund's adjuvant로 유화시켜 주사하였고, 제 2 회 및 3 회에는 500 μg의 항원을 인산완충식염수에 섞은 후 incomplete Freund's adjuvant로 유화시켜 주사하였다(Fig. 1).
   테스토스테론 투여군의 실험동물(AD군 각 3마리씩, BC 군 각 4마리씩)에게는 내이자가면역 대조군에서와 동일한 항원을 동일한 방법으로 주사한 후 Testosterone propionate(50 mg/ml) 5 μl(250 μg)를 sesame oil에 잘 유화시켜 전신감작 1주일전부터 총 3회의 전신감작 후 1주일까지 1주일에 3회씩 총 12회(3000 ug)에 걸쳐 흰쥐의 다리에 근육주사 하였다. A군은 전신감작 후 1주에, B군은 2주에, C군은 4주에, D군은 8주에 각각 심장관류를 통해 희생시켰다(Fig. 2).

뇌간유발반응 청력검사

   3회에 걸친 전신감작 시행 직전과 시행 후 실험동물을 희생시킬 때까지 1주일 간격으로 뇌간유발반응 청력검사를 시행하였다. 소리자극은 rarefacting tone burst type으로 8000 Hz의 주파수에서, 초당 12.5회 총 1024회로 82 dB부터 2 dB까지 주었다. 청력역치는 wave Ⅰ이 0.1 μV이상의 amplitude를 보이는 가장 낮은 수준으로 정하였다.

   -A군：3회 전신감작 후, 1주후 추적검사(총4회)
   -B군：3회 전신감작 후, 1주간격으로 2주간 추적검사(총5회)
   -C군：3회 전신감작 후, 1주간격으로 4주간 추적검사(총7회)
   -D군：3회 전신감작 후, 1주간격으로 8주간 추적검사(총9회)

Western blotting

   3회에 걸친 전신감작 시행직전과 전신감작 후 1주일간격으로 capillary tube를 사용하여 안와정맥총에서 500 μl의 피를 채혈하여 분리한 혈청으로 western blot 면역검사를 시행하여 내이항원 단백질에 대한 항체검사를 시행하였다. 비특이성 결합을 방지하기 위해 각각의 blot들을 5% dry milk와 0.2% Tween 20 in PBS(pH 7.4)으로 실온에서 2시간동안 반응시킨 후, 1：1,000의 비율로 희석시킨 실험동물의 혈청으로 밤새도록 4°C에서 반응시켰다. 그 후 1：3,000으로 희석시킨 peroxidaselabeled rabbit anti-rat IgG로 blot 들을 실온에서 2시간동안 반응시켰으며, 결합된 peroxidase-labeled secondary antibody를 0.05 M Tris, 0.2M NaCL, 0.03% hydrogen peroxide 33 ml에 용해된 3,3-diaminobenzidine 20 mg과 10~20분간 반응시킨 후 증류수로 세척하므로서 그 반응을 종료시켰다.

통계학적 검정

   통계학적 검정은 반복측정 자료의 분산분석을 위하여 SAS(ver 6.11) 프로그램을 이용한 repeated measures ANOVA test를 시행하였다.

결     과

내이 자가면역 대조군에서 뇌간유발반응 청력검사

   청력변화는 10 dB에서 40 dB까지 관찰되었으며, 20 dB 이상의 청력변화는 전체 30귀중 16귀(53.3%)에서, 30 dB이상의 청력변화는 12귀(40.0%)에서, 40 dB이상의 청력변화는 5귀(16.6%)에서 각각 관찰되었다. 그러나 청력손실이 발생하는 양상은 일정하지 않아 7마리(14귀)에서는 양측, 2마리(2귀)에서는 편측에서 발생하였고, 양측 귀 모두에서 청력손실이 발생하는 경우에도 난청의 정도 및 발생시기가 반드시 일치하지는 않았다. 20 dB이상 청력손실이 발생한 16귀 중 3귀(18.8%)에서는 희생시킬 때까지 20 dB 이상의 청력손실이 유지되었으나, 13귀(81.2%)에서는 청력손실이 10 dB 이내로 회복되는 양상을 보였다. 시간경과에 따른 청력변화는 전신감작 후 1~3주 사이에 각각 13.67 dB, 12.27 dB, 14.29 dB로 청력손실의 정도가 심했으며 6주에도 15.00 dB를 보였다(Table 1)(Fig. 3).

테스토스테론 투여군에서 뇌간유발반응 청력검사

   청력변화는 10 dB 부터 20 dB 까지 관찰되었으며 30 dB 이상의 청력변화는 관찰되지 않았다. 20 dB의 청력변화는 전체 28귀 중 7귀(25.0%)에서 관찰되었으며 20 dB이상의 청력손실 발생율은 내이자가면역 대조군에 비해 의의있게 낮았다(p<0.05). 그러나 청력손실이 발생하는 양상은 일정하지 않아 1마리(2귀)에서는 양측, 5마리(5귀)에서는 편측에서 발생하였다. 또한 청력손실이 발생한 7귀 중 5귀는 1, 2차 추가감작 시에 발생하였으며 나머지 2귀만이 마지막 감작 후 2주와 4주에 각각 발생하였다. 20 dB의 청력손실이 발생한 7귀 중 1귀(14.3%)에서는 희생시킬 때 까지 청력의 회복을 보이지 않았으나, 6귀(85.7%)에서는 전신감작 후 2주에 청력손실이 완전히 회복되는 양상을 보였다. 청력손실은 1, 2차 추가감작시에 가장 심하였고(4.64 dB, 6.07 dB), 가장 흔히 관찰되었으며(7.1%, 14.3%), 특히 전신감작 후 1주, 2주에 테스토스테론 투여군과 내이 자가면역 대조군 사이에 유의한 청력손실의 차이를 보였다(p<0.01)(Table 2)(Fig. 3).

내이 자가면역 대조군에서 Western blotting

   본 실험에서는 68 kD 항원 단백질에 대한 분자량표지로서 66 kD 분자량의 암소 혈청알부민을 사용하였다. Western blot 검사상, 68 kD 단백질에 대한 항체는 15마리 중 7마리에서 관찰할 수 있었으며, 대개 전신감작 후 1~4주 사이에 뚜렷이 나타나 청력손실 발생시기와 대체로 일치하였다. 68 kD 단백질에 대한 band가 나타난 7마리 중 5마리에서 20 dB 이상의 청력손실이 발생하였으며, 그 중 2마리에서는 항 68 kD 항체가 전신감작 1주부터 희생시킬 때까지 계속 발현되었다.

테스토스테론 투여군에서 Western blotting

   테스토스테론을 투여한 동물의 혈청으로 암소 내이항원 단백질에 대해 시행한 western blot 검사상 D 군의 3번째 동물만이 전신감작 후 4, 6, 8주에 강하고 뚜렷한 68 kD에 대한 band를 보였으며 청력검사상 이 동물은 전신감작 후 4, 6, 8주에 각각 20 dB의 청력손실을 보였다(Fig. 4). 그 외의 실험동물 13마리에서는 68 kD 항원 단백질에 대한 항체가 발견되지 않았다.

고     찰

   Harris 등¹⁰⁾은 암소 혈청 알부민과 Keyhole Limpet Hemocyanine(KLH)를 이용한 실험에서 내이는 면역반응이 매우 활발한 조직이라고 주장하였으며, Yoo 등¹¹⁾은 type II collagen에 대한 자가면역으로 이경화증이나 메니에르병이 발생할 수 있으며 이는 몸 전체에 존재하는 항원에 대한 자가면역반응이 와우에 병리학적 변화를 일으키기 때문이라 하였다.
   내이 자가면역질환의 진단을 위한 확실한 방법이 아직 개발되어 있지는 않지만 일반적으로 류마치스양 관절염, 전신성 홍반성 루프스, Cogan 증후군 등과 같은 전신성 자가면역질환의 동반, cryoprecipitation, C1q binding assay, hemolytic complement assay 등에 의한 면역복합체(immune complex)의 확인 및 증가, lymphocyte transformation test에서 mean stimulation index의 증가, western blot 검사에서 내이항원에 대한 항체가 검출되었을 경우 내이 자가면역질환을 의심할 수 있다고 하였다.¹²⁾
   Western blot을 이용한 내이 항원 단백질에 대한 항체의 검출이 동물 및 임상실험에서 활발하게 연구되었는데 Yamanobe 등¹³⁾은 68 kD 단백질이 양측성의 급속히 진행하는 감각신경성 난청 환자에서 가장 흔한 항원 표적(anti-genic target)이라고 하였고, Gottschlich 등¹⁴⁾은 양측성의 급속히 진행하는 감각신경성 난청 환자 279명 중 32%에서 68 kD 단백질에 대한 항체를 검출하였으며, Shin 등¹⁵⁾은 68 kD 단백질이 heat shock protein 70(HSP-70)과 동일한 물질이라고 하였다. Harris¹⁰⁾는 기니픽을 암소 내이항원으로 감작시킨 후 32%에서 난청을 발견하였고 그 중 50%에서는 난청이 편측에 생겼다고 하였으며, 다른 보고에서는 난청을 일으킨 동물의 혈청에서 68 kD 단백질에 대한 항체가 western blot 검사상 뚜렷하게 관찰되었으나 난청을 일으키지 않은 동물에서는 매우 약한 반응을 보였다고 하였다.¹⁶⁾ 그러나 난청의 발생시기와 정도, 회복시기와 western blot 검사의 결과를 비교하지는 않았다.
   본 연구에서는 흰쥐를 암소 내이항원으로 감작시킨 후 측정한 뇌간유발반응 청력검사에서 20 dB 이상의 청력손실이 53.3%에서 관찰되었으며, 청력손실의 양상이나 정도 및 발생시기가 일정하지는 않았으나 전신감작 후 1~6주사이에 주로 관찰되었다. 난청이 발생한 귀의 18.8%에서는 희생시킬 때까지 청력손실이 남아 있었다. 내이항원 감작에 의한 난청의 발생은 기존 연구보고¹⁰⁾에 비해 높은 발생율을 보였으며 특히 기존의 연구 보고들이 주로 10 dB 이상의 청력변화를 인정하였던 것에 비해 본 연구에서는 20 dB 이상의 변화만을 대상으로 함으로서 연구결과의 신뢰도를 더욱 높일 수 있었다.
   Western blot 면역검사에서 68 kD 단백질에 대한 항체는 20 dB 이상의 청력손실을 보인 동물의 62.5%에서, 청력손실이 없는 동물의 28.6%에서 관찰됨으로서 두 군간에 유의한 차이를 보였으며, 대개 전신면역 후 1~4주 사이에 뚜렷이 나타나 청력손실 발생시기와 대체로 일치하였다. 68 kD 단백질에 대한 항체의 형성은 기존 연구¹⁰⁾와 비슷한 결과를 보였다.
   자가면역질환은 매우 다양한 임상양상을 보이는데 그 중 특이한 것은 여성에게 호발한다는 점이다.⁶⁾ NZB/NZW F1 생쥐는 사람의 전신성 홍반성 루프스와 비슷한 질병을 일으키는데 암컷이 수컷보다 더 심한 증상을 보이며 에스트로겐의 투여는 증상을 더욱 악화시켰으나 테스토스테론의 투여는 증상을 완화시키며 더 오랜 생존율을 보였다.⁸⁾ 임신한 여성에서는 태아에게 해로움을 줄 수 있는 세포성 면역은 약화시키고 체액성 면역은 강화시키는 방향으로 면역학적인 변화가 일어나며 류마치스양 관절염을 앓고 있는 여성의 약 70%에서 배란 중 증상의 일시적인 호전을 보이고 전신성 홍반성 루프스는 임신 중 증상이 더 악화되는 것으로 알려져 있다.⁷⁾ 이러한 사실은 자가면역질환의 발생 및 진행에 성호르몬이 중요한 역할을 하고 있음을 보여주고 있다.
   일반적으로 자가면역질환의 치료제로서 스테로이드와 면역억제제가 주로 사용되고 있으나 스테로이드 투여로 인한 여러 가지 부작용과 면역억제제에 의한 면역기능저하가 심각한 문제점으로 대두되고 있으며 이들 약제에 대한 대체 치료제에 대한 관심이 높아지고 있다. 저자들은 흰쥐에서 내이 자가면역질환의 치료제로서 성호르몬의 효과를 알아보기 위하여 안드로겐의 일종으로 뇌하수체의 영향을 받아 고환의 Leydig cell에서 생산되어 정자생산을 조절하고 남성의 성기나 전립선의 발육과 같은 이차성징의 발달에 중요한 역할을 하는 테스토스테론을 이용하였다.¹⁷⁾
   내이자가면역 대조군에 비해 테스토스테론을 투여한 동물에서 난청의 발생빈도와 난청의 정도가 유의하게 낮았으며 청력손실이 회복되는 시기는 전신감작 후 1주부터로 더 빨랐고 단지 1귀에서만 희생시킬 때까지 청력손실이 남아 있었다. Western blot 검사상 테스토스테론 투여군에서는 한 동물만이 68 kD 단백질에 대한 항체를 보여 내이자가면역 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보였으며 항체의 존재시기와 청력손실시기가 일치하였다.
   안드로겐은 B/W 생쥐의 자가면역질환에 효과가 있으나 그 기전은 확실히 밝혀져 있지는 않다. B/W 생쥐를 이용한 실험에서 안드로겐은 핵산에 대한 항체가 IgM에서 IgG로의 전환되는 것을 지연시키며 신생 쥐에서 흉선절제술이 핵산에 대한 IgG의 생산을 정지시키는 것으로 보아 아마도 흉선­의존성 조절기전에 의해 자가면역질환을 조절한다고 시사하였다.⁸⁾⁹⁾
   본 연구에서 자가면역성 난청의 발생과 진행에 대한 테스토스테론의 억제효과는 TH1 세포를 증강시키고 TH2 세포는 억제시키며, 내이로의 immune effector cell의 유입을 억제하고, 항체형성, 보체의 활성, 염증세포의 회귀 등을 억제시키므로서 발생한다고 생각된다.
   그러나 테스토스테론의 투여는 여러가지 부작용을 초래할 수 있으므로 이를 방지하거나 최소화하기 위해 테스토스테론 투여량, 투여방식, 투여기간 및 기타 약제의 병합투여 등에 대한 연구가 필요하다.

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