서     론

   당뇨병으로 인한 청력장애의 원인은 대부분 고음역에서 양측성으로 나타나며 고령자에서 많이 발생한다. 당뇨병에서 청력장애의 병리학적 원인은 당뇨병성 혈관병변이 주로 와우의 혈관선조에서 병변이 일어 나는 것으로 알려져 왔다.¹⁾ 그러나 Friedmann 등²⁾은 이러한 모세혈관의 변화는 당뇨병 환자의 여러 조직에서 발견할 수 있으며 이것은 단지 비특이적 소견이고 청신경의 탈수초화로 인한 신경장애가 일차병변이라고 보고하였다. 또한 Jung 등³⁾의 streptozotocin(이하 STZ으로 칭함)으로 유발된 당뇨병 흰쥐에서 와우유모세포의 형태학적 변화를 관찰한 연구에서도 당뇨군과 정상군의 유모세포에서 특별한 차이를 발견하지 못했다고 하였으며 Nageris 등⁴⁾도 유전적 처리한 당뇨쥐의 와우에서 특별한 변화를 발견할 수 없었다고 보고하였다. 따라서 당뇨병이 청신경 수초에 미치는 연구가 필요한 실정이다. 청신경 탈수초화에 있어서 중요한 슈반세포의 변성에 관한 연구는 드문 편이다.
   유전조작한 당뇨쥐는 쉽게 구하기 어려워 당뇨병의 실험적 연구를 위해 alloxan, STZ 등이 당뇨유발 제재로써 사용되고 있다.³⁾⁵⁾
   STZ는 alloxan에 비해 췌장의 베타세포에 더 특이적으로 반응하며 지속적으로 당뇨병 상태를 유지하고 기타 장점들이 있어 많이 사용되고 있다. 지금까지 밝혀진 STZ의 β-세포 파괴에 의한 당뇨병의 유발기전을 보면 poly(ADP-ribose) synthetase를 활성화시키며 세포의 DNA손상을 초래하거나 비특이적인 면역반응에 의하여 단핵세포의 침입을 유발함으로서 병변을 유발한 것으로 알려져 있다.⁶⁾ Wolff 등⁷⁾이 STZ가 세포의 DNA 손상외에 산소유리기를 생성하여 β-세포를 파괴한다고 보고한 이래 STZ의 독성효과를 산화적 손상의 측면에서 규명하려는 연구가 이루어 지고 있다. 또한 Tuck 등⁸⁾에 의하면 STZ에 의한 유발당뇨병쥐에 있어서, 혈류감소로 인하여 신경내막에 저산소증의 초래와, 동시에 이같은 저산소증은 산소유리기의 생산을 자극시켜 산화적 손상을 유도한다고 한다고 보고하였다. 그러나 아직까지 STZ의 세포독성 및 신경독성의 작용에 대하여 정확히 정립되어 있지 않은 실정이다.
   저자들은 STZ를 사용하여 당뇨병이 청신경 슈반세포에 미치는 신경독성과 STZ의 신경독성에 대한 신경보호효과(neuroprotective effect)를 통하여 당뇨병에서 발생하는 감각신경성난청의 원인을 간접적으로 알아보고 동시에 신경성장인자로 알려진 IGF-II의 신경보호효과를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

   실험에 사용한 대상과 약제의 처리：실험 동물은 생후 3일된 CD-1계통의 생쥐를 실험 1회시 10마리 사용하였으며 6회를 시행하였다.
   본 실험에 사용한 streptozotocin(STZ, Sigma, USA)은 증류수에 용해하여 각각 100 mM, 10 mM, 5 mM 및 1 mM의 저장액으로 만들어 냉암소에 보관하였다.
   또한 insulin-like growth factor II(IGF-II, Sigma, USA)는 각각 100 mg/ml, 10 mg/ml 및 1 mg/ml 등의 저장액을 만들어 위와 동일하게 보관하였다. 이 약제들은 실험 당일 필요한 양을 희석 사용하거나 직접 배양액에 첨가하여 사용하였다.
   슈반세포의 분리와 배양：생쥐에서 청신경을 분리한 다음 청신경에서 슈반세포 분리를 위해 0.25% trypsin 용액으로 처리한 후 36°C에서 5%, CO₂/95% air로 조절된 항온기내에서 배양한 다음 혈청이 포함된 배양액을 넣어 잘 혼합하였다. 이와같이 처리한 신경세포는 Eagle's minimum essintial medium(EMEM, Gibco, USA)으로 서너번 세척한 다음 Pasteur 피펫을 이용하여 분리하였다. 분리된 세포는 800g에서 3분간 원침시킨 후 poly-L-lysine(Sigma, USA)으로 전 처리된 35 mm 배양용기에 도입하였다. 세포 도입 2시간 후 배양액의 상층액만 분리하여 새로운 배양액에 부유시킨 다음 항온기에서 9~10일 동안 배양하였다.
   이때 배양액은 EMEM(Gibco)의 배양액에 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco)이나 또는 0.5 mg/ml nerve growth factor(NGF, Sigma)를 넣어 사용하였다. 배양 완료 후 0.25% trypsin을 사용하여 슈반세포를 배양용기로 부터 분리하여 phosphate buffered salin(PBS)으로 3회 세척한 다음 poly-L-lysine으로 전처리된 96-multiwell에 1×10 6 cells/well의 세포수가 되도록 산정, 도입하였다. 도입된 세포는 5일 동안 배양한 다음, 본 실험에 사용하였으며 또한 도입후 3일 간격으로 새로운 배양액으로 교환하여 주었다.
   STZ의 독성효과와 IGF-II의 방어효과 조사：STZ가 세포에 미치는 독성효과를 조사하기 위하여 배양중인 신경세포를 50 μM STZ가 포함된 배양액내에서 6~48시간 동안 배양하였다. 또한 STZ의 독성효과에 대한 신경성장인자로 알려진 IGF-II의 신경보호효과를 알아보았다. 즉 실험 직전까지 일차 배양한 슈반세포를 STZ에 노출시키기 2시간 전에 여러농도의 IGF-II가 포함된 배양액에서 세포를 배양한 후 이를 다시 STZ에 24시간 노출시킨 다음 STZ의 독성에 대한 IGF-II의 영향을 조사하였다.
   세포독성 및 방어효과 검정을 위하여 세포생존률을 분석하였다. 즉 일차배양 신경세포에 여러농도의 STZ를 처리한 후 STZ가 세포에 미치는 독성효과 및 STZ에 대한 IGF-Ⅱ의 신경방어효과를 MTT assay법에 의하여 분석하였다. MTT assay는 배양이 완료된 세포에 실험 전날 제조한 50 mg/ml의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide](Sigma) 저장액을 희석 처리하여 반응시킨 다음 microelisa reader(Dynatech co.Japan)로 570 nm에서 측정하였다. 배양중인 슈반세포를 Ca2＋, MG2＋-free인 Hank's balanced salt solution(HBSS, Gibco)으로 3회 세척후 10~70 μM의 STZ가 각각 포함된 배양액에서 48시간 동안 전처치한 다음 STZ에 의하여 유발된 세포독성 효과를 MTT 분석에 의하여 측정하였다.
   실험결과의 유의성 검정은 Student's t-test에 의하여 조사하였으며 P-value가 0.05 이하일 경우에 유의한 것으로 판정하였다.

결     과

STZ의 세포독성

   대조군(100%)에 비하여 세포의 생존률이 10 μM 농도의 STZ처리군에서 79.6%로 나타났으며 20 μM 에서는 68.2%로 나타났다. 또한 40 μM과 60 μM에서는 각각 47.5%와 31.6%로 나타났다(Fig. 1). 시간에 따른 STZ의 독성효과를 조사하기 위하여 50 μM의 STZ가 포함된 배양액에서 6~48시간 동안 슈반세포를 각각 배양하여 조사한 결과 12시간 배양에서는 세포의 생존률이 대조군(100%)에 비하여 84.2%로 나타났으며 24시간 배양에서는 71.9%로 나타났다. 또한 48시간 배양과 72시간 배양에 있어서는 각각 52.6%와 43.7%로 나타났다(Fig. 2).

STZ의 독성에 대한 IGF-II의 신경보호효과
   STZ만 처리한 경우에는 대조군에 비하여 세포의 생존률이 54.7%로 나타난데 비하여 50 ng/ml IGF-II 처리한 경우 65.3%로 나타났다. 또한 100 ng/ml와 150 ng/ml IGF-Ⅱ로 처리한 경우 각각 72.6%와 89.3%의 높은 생존률을 보였다(Fig. 3).

세포의 형태학적 관찰

대조군
   약제를 처리하지 않았던 대조군에서는 숫적으로 많은 세포들이 돌기를 내어 서로 긴밀하게 연결되어 있었다(Fig. 4A).

STZ처리군
   일정 시간 동안 배양된 슈반세포에 MTT50농도(40 uM)를 48시간 동안 처리한 결과 약제에 의해 손상을 입은 일부세포들은 배양용기의 바닥으로부터 이탈된 후 배양액 위로 떠올라 부유하고 있었으며 그 결과 세포의 수가 대조군에 비하여 매우 감소되었다(Fig. 4B).

IGF-II 처리군
   일정 시간 동안 배양된 세포에 150 ng/ml IGF-II를 2시간 동안 처리한 후 이를 다시 40 uM STZ에 48시간 동안 배양한 결과 세포가 숫적으로 대조군과 비슷하였으며 일부 세포들은 몇 개씩 뭉치어 군락을 형성하고 세포돌기로써 다른 세포들과 상호 연결되어 있었다(Fig. 4C).

고     찰

   당뇨병에서 발생하는 감각신경성 난청은 대개 내이의 장애라고 알려졌으나 후미로성 또는 중추영역도 원인부위가 된다고 보고되었다.⁹⁾¹⁰⁾ 이러한 청력장애의 병리로는 내이의 미세혈관증 또는 변성에 의한 청신경의 일차적인 신경장애로 되어 왔다. 즉 첫째 내이의 소혈관들의 변화는 혈관선조에서 PAS반응 양성물질의 축적과 모세혈관의 확장 또는 나선신경절의 세포수 감소, 둘째 신경속 혈관(vaso nervorum)의 혈류감소에 의한 신경의 2차적 변성 및 신경섬유내의 영양 결핍이나 sorbitol의 축적에 의한 신경의 일차적 변성으로 추정되어 왔다.
   Nakae 등¹¹⁾은 투과전자현미경적 연구를 통해 와우의 기저회전부의 Corti기와 모든회전에서 혈관선조의 돌출, 변연세포의 응축(condensation), 중간세포의 팽창, 세포간강의 확장등과 Corti기에서 외유모세포의 변성 및 지지세포의 치환이 관찰되었다고 한다. 그러나 Nageris 등⁴⁾은 유전처리한 당뇨쥐에서 와우에서는 의미있는 변화를 관찰할 수 없었다고 하였다.
   본 연구에서는 저자들은 청신경의 수초변성에 중요한 역할을 하는 슈반세포의 변성을 STZ를 통하여 알아보았다. STZ는 β-세포를 파괴하여 당뇨병을 유발함은 잘 알려져 있으나 이의 신경독성에 대한 기전에 관하여서는 정립되어 있지 않다.
   본 연구에서 10 μM에서 60 μM까지의 STZ의 농도가 각각 포함된 배양액에서 생쥐의 슈반세포를 24시간 동안 배양한 결과 STZ의 농도에 비례하여 세포의 현저한 생존율 감소를 보였다. 또한 배양 슈반세포에 대한 STZ의 노출시간이 길어짐에 따라 살아 있는 배양 슈반세포가 숫적으로 많은 감소를 보였다. 특히 40 μM STZ의 농도에서는 MTT50 값을 나타냈는데 이는 Borenfreund 등¹²⁾의 독성판정 기준에 따라 고독성인 것으로 나타났다(고독성, MTT50<100 μM). 이는 STZ가 배양 슈반세포에 세포독성을 가지고 있음을 제시해 주고 있다.
   STZ의 신경병증에 대한 기전은 아직 잘 알려져 있지 않지만 현재 강력히 제시되고 있는 가설의 하나는 STZ의 산화적 손상이다.¹³⁾ STZ의 유발 당뇨병쥐에서 혈류감소에 따른 신경내막의 저산소증에 의한 산소유리의 생성촉진을 비롯하여 포도당과 당화 단백질의 자동산화, 신경의 노르에피네프린의 감소, 지질과산화물의 축적등이 산화적 손상에 의해 발생된다고 생각되고 있다.
   Low 등¹⁴⁾의 연구에 의하면 STZ에 의한 신경독성으로 당뇨병백서의 말초신경인 좌골신경에서 신경손상이 발생했으며 Tomas 등¹⁵⁾은 신경전도 속도의 장애가 나타남을 관찰하였다. 또한 Cameron 등¹⁶⁾은 STZ를 주입한 백서에 항산화제인 butylated hydroxytoluene을 투여한 결과 말초신경의 전달 속도 저하를 완전히 예방했다고 보고함으로서 STZ의 산화적 손상을 증명한다고 하겠다. 본 연구에 있어서도 산소자유기의 형성저해 기능을 가지고 있는 것으로 알려진 신경성장인자 계열의 하나인 IGF-II를 STZ에 의해 손상되는 배양 슈반세포에 처리한 결과 STZ만을 처리한 실험군에 비하여 세포의 생존률이 현저히 증가한 것이나, STZ의 독성에 의해 유발된 세포손상에 있어서 IGF-II의 방어효과에 대한 세포의 형태적 관찰 소견등을 고려하여 볼때 STZ의 독성이 산화적 손상과 관계가 있음을 배제할 수는 없다고 생각된다. 이의 자세한 규명을 위해서는 산화적 손상의 방어와 밀접한 관계가 있는 항산화계나 산소유리기의 생성억제체계등의 측면에서 많은 연구가 수행되어져야 할 것으로 생각된다.
   산소유리기는 흥분성 아미노산의 분비촉진이나 세포내의 칼슘농도의 증가와 같은 현상을 유발시킴으로써 세포를 손상 또는 사멸시킨다. 또한 산소유리기는 독성이 강한 peroxynitrite라는 물질을 생성하여 신경세포의 손상을 일으키고 철이온들과 작용하여 산소유리기의 생성을 촉진시킨다.
   Jang 등¹⁷⁾은 배양된 생쥐의 안면신경 슈반세포에서 xanthine oxidase, hypoxanthine등의 산소유리기에 의한 신경독성효과가 나타남을 관찰하였으며 항산화제인 TPEN(tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine)은 신경독성 방어 효과가 있다고 하였다. STZ를 처리한 신경세포에 대한 형태학적 관찰소견에 있어서 대조군에 비하여 세포의 숫적감소를 보여 STZ의 강한 신경독성효과를 보였다. 한편, STZ에 의해 유발된 신경독성에 대한 IGF-II의 영향을 조사하기 위하여 STZ를 배양 슈반세포에 처리하기 2시간 전에 50 ng/ml에서 150 ng/ml의 농도가 각각 포함된 배양액에서 세포를 전처리한 결과 STZ만을 처리한 실험군의 세포생존율(54.7%)에 비하여 IGF-II를 처리한 실험군에서는 처리농도에 비례하여 세포의 생존률이 증가하였으며, 특히 150 ng/ml IGF-II 처리군에서는 대조군에 비하여 89.3%의 높은 세포의 생존률을 보였다. 이같은 실험 결과는 IGF-II가 손상된 백서의 좌골신경의 재생을 촉진시켰다는 Ishii 등¹⁸⁾의 결과와 일치하였다.
   본 연구에서 이러한 IGF-II의 방어효과는 아마도 STZ를 배양 슈반세포에 노출시키기 전 미리 처리한 IGF-II가 세포내로 들어가 있다가 STZ의 독성을 방어함으로서 세포의 손상을 방어하였을 것으로 생각된다. 지금까지 알려진 세포손상에 대한 신경성장인자의 방어효과의 기전으로는 산소자유기의 생성억제 뿐만아니라 세포내 Ca²⁺의 항상성을 조절하여 이의 균형 파괴시 나타나는 병인을 제거한다고 한다고 알려져 있다. 본 연구에서 IGF-II가 STZ의 독성으로 부터 세포의 손상을 보호한 것은 IGF-II가 IGF-I 처럼 손상된 말초신경의 재생이나 신경세포의 신경돌기의 성장에 관여하고 있다는 것도 배제할 수는 없지만, 한편 STZ의 독성효과가 산화적 손상과 밀접한 관계가 있음을 비추어 볼때 IGF-II가 STZ에 의해서 촉진되는 산소자유기의 생성을 저해하였을 가능성도 고려하지 않을 수 없다고 하겠다.¹⁹⁾ 그러나 이에 대한 정확한 조사를 위해서는 STZ의 산화적 손상에 대한 많은 연구가 막의 지질과산화반응을 비롯하여 Ca²⁺ 채널과 관계된 수용체 및 흥분성 아미노산의 대사적 측면 등에서 이루어져야 될 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구의 결과로부터 STZ는 생쥐의 배양 청신경 슈반세포에 신경독성이 있는 것으로 나타났으며, 또한 IGF-II와 같은 선택적인 신경성장인자가 STZ에 의하여 유발되는 신경독성을 방어하는데 매우 효과적이었다. 당뇨병에 의한 감각신경성난청의 병인에 대해 산소유리기에 의한 청신경의 병변과 항산화제의 연구가 필요하며 이에 대한 기초적 자료가 될것으로 사료된다.

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