서     론

   급성 중이염은 이비인후과 영역 특히 소아에서 흔히 발생하는 질환으로 적절히 치료되지 못할 경우 중이강내의 염증반응이 전음성 및 감각신경성 난청, 안면신경마비, 유양돌기염, 뇌막염, 뇌농양 등과 같은 다양한 합병증을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 질환에서 발견되는 가장 흔한 원인균은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)과 인플루엔자균(Haemophilus influenzae)이며 중이에 감염된 세균에서 만들어진 독성 물질과 이와 관련한 염증대사물이 작용하여 중이 점막과 고막에 염증 세포의 침윤 및 다양한 염증반응을 일으키고, 점막 상피의 이형성으로 삼출성 중이염이 발생할 수 있음이 알려져 있다. 폐렴구균이나 인플루엔자균 등을 이용하여 흰쥐에서 실험적으로 유발시킨 급성 중이염에서 중이 점막의 조직 소견이 인체에서의 중이염 소견과 비슷함이 밝혀졌으며, 급성 중이염의 치료로 항생제의 초기 투여가 질병의 경과를 짧게 하고 중이 점막에서의 염증반응을 감소시킬 뿐만 아니라 삼출성 중이염으로의 이행 빈도도 감소시켰음이 보고되었다.^1-4)
   또한 급, 만성 중이염의 합병증으로 발생할 수 있는 고실경화증(tympanosclerosis)과 관련해 유전적으로 골이형성 질환이 발생하는 생쥐를 이용한 실험에서 질환 발현의 방지에 면역 억제 및 항염증 효과를 지닌 스테로이드의 투여가 도움을 주었다는 보고가 있고,⁵⁾ 임상적으로는 급성 중이염에 합병된 안면신경마비나 돌발성 감각신경성 난청의 치료와 Haemophilus influenzae에 의한 세균성 뇌막염 환자에서 감각신경성 난청을 포함한 다양한 후유증을 감소시키는데 항생제와 함께 스테로이드의 사용이 유용하다는 보고도 있어,⁶⁾⁷⁾ 급성 세균성 감염의 초기에 항생제와 스테로이드의 병합 투여가 염증반응을 감소시키는데 효과적일 수 있음을 알 수 있다.
급성 중이염의 병인이 감염균의 독성 작용과 관련된 염증반응으로 설명되므로 이같은 염증반응을 억제하는 스테로이드를 항생제와 함께 투여할 때 중이 점막의 염증반응의 정도와 분비 세포로의 이형성에 미치는 효과가 항생제 단독 투여시와 어떠한 차이를 보이는지 확인하고 이를 임상적으로 적용하는 근거를 제시하고자 본 연구를 계획하였다.

재료 및 방법

재  료

세  균
  실험적으로 급성 중이염을 일으키기 위해 사용한 균주는 ATCC 49619 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae 균주(American Type Culture Collection, USA)로 Mc-Farland No. 1.0과 동일한 균수를 가지도록 하였으며, 1×10⁹ colony forming unit/ml의 균을 생리 식염수에 녹여 중이강에 주입하였다.

항생제 및 스테로이드제
   실험군에 사용한 항생제는 주사용 페니실린 G(Penicillin G kalium, 근화제약)로 1회 주사시 16만 단위/kg의 용량을 근육주사하였고, 스테로이드제는 덱사메타손(Dexamethasone, 유한양행)으로 1회 주사시 1 mg/kg의 용량을 근육주사하였다.

실험동물

   동일조건 하에서 사육한 생후 8주된 체중 200~250 gm의 성숙한 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(male Sprague-Dawley rat) 27마리를 사용하였으며, 모두 케타라(Keta-mine hydrochloride, 유한양행) 50 mg/kg와 럼푼(xylazine, Bayer) 5 mg/kg을 근육주사하고 마취상태에서 수술용 현미경하에 이경 검사법으로 건강한 외이와 중이를 확인하였다.

방  법

실험적 급성중이염 유발
   실험동물을 마취시키고 고막 긴장부의 전상부에 인슐린 주사기를 이용하여 우측 귀에는 ATCC 49619 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae 균주를 McFarland No. 1.0과 동일한 균수를 가지도록 하여 0.03 ml를 중이강내로 주입하였고, 대조군으로 좌측 귀에는 0.03 ml의 멸균 생리식염수를 같은 방법으로 주입하였다.

실험군의 분류
   제 1 군 9마리는 폐렴구균의 실험적 중이염 발생의 감염 대조군으로 우측 귀에 실험적 급성 중이염만을 유발시키고 좌측귀는 정상 대조군으로 멸균 생리식염수를 고막천자를 통해 주입하였다. 제 2 군 9마리는 항생제가 실험적 급성 중이염에 미치는 영향을 확인하고자 제 1 군과 동일하게 처치한 후 수술 후 36시간째부터 5일간 페니실린 G를 16만 단위/kg의 용량으로 하루 한차례씩 근육주사하였다. 제 3 군 9마리는 급성 중이염에서 항생제와 스테로이드를 함께 사용하는 경우 중이 점막의 조직학적 변화를 확인하고자 제 1 군과 동일하게 처치한 후 수술 후 36시간째 부터 5일간 페니실린 G 16만 단위/kg와 덱사메타손 1 mg/kg의 용량을 모든 개체에 근육주사하였다. 세 군 모두 시간에 따른 급성 중이염의 조직 변화 정도를 관찰하고자 4일, 7일, 14일째 각각 3마리씩 희생하였다.

고막 관찰과 조직 채취 및 고정
   실험적 급성 중이염을 유발시킨 후 4일, 7일, 14일째 각각 3마리씩의 흰쥐를 케타라(Ketamine hydrochloride, 유한양행) 50 mg/kg와 럼푼(xylazine, Bayer) 5 mg/kg을 근육주사하여 전신마취시킨 후 먼저 수술용 현미경하에서 고막을 관찰한 후 개흉하여 심장을 노출시키고 헤파린으로 처리한 생리식염수와 인산완충식염수용액(0.1 M, pH 7.4)에 용해한 4% paraformaldehyde로 심장관류를 통해 고정하였다. 측두골을 적출하고 4% paraformaldehyde로 4°C에서 하루밤 후고정한 후 인산완충식염수용액(0.1 M, pH 7.4)으로 세척하고 10% EDTA에서 4주간 탈회한 후 수술 현미경하에서 고막의 전하방을 이등분하는 방향으로 고막에 수직으로 절개를 가하여 고막, 고실갑각(promontory)과 이낭(bulla)을 모두 관찰할 수 있도록 한 후 파라핀에 포매하였다.

슬라이드 제작 및 염색
   파라핀에 포매된 측두골을 미세절편기를 이용하여 5 μm의 두께로 절편한 후 슬라이드에 부착시켰으며 고막과 중이 점막의 일반적인 관찰을 위해 Hematoxylin-Eosin 염색을 하였고, 점액 분비 세포의 관찰을 위해 Periodic acid-Schiff(PAS) 염색을 실시하였다.

결과 판정

고막 소견
   수술 현미경하에서 고막의 혈관 확장, 화농성 삼출액의 존재 여부, 고막 두께의 육안적 변화와 같은 염증 반응을 관찰하되 대조군인 좌측 고막에 비해 차이가 없는 경우 -, 경도의 염증 반응을 보이는 경우 ＋, 심한 염증 반응을 보이는 경우 ＋＋로 하였으며, 각 군간에 인슐린 주사기로 천자한 고막 천공 부위가 차이가 있음을 발견하여 그 정도를 관찰하되 천자 부위의 크기가 50% 이상 감소된 경우 ＋, 50% 이하 감소된 경우 ＋＋로 표기하였다.

Hematoxylin-Eosin 염색시 조직 소견
   고막 긴장부, 고실 갑각, 이관의 고실 입구부 및 이관 직후방에 위치한 이낭 부위에서 기저막이 뚜렷하게 관찰되는 조직 절편을 각 개체별로 3개씩 고른 후 다음을 관찰하였다.
상피하층의 두께 측정
   한 개체내에서 실험군인 우측 귀와 대조군인 좌측 귀의 조직 절편 3개에서 조직 관찰 부위 4곳의 상피하층 두께를 200배 시야에서 측정한 후 이를 각각 평균하고 실험군에서의 상피하층 평균 두께가 대조군의 상피하층 평균 두께에 비해 변화가 없는 경우 0, 10∼25% 이상 증가한 경우를 ＋, 25% 이상 증가한 경우를 ＋＋로 판정하였다.
혈관 변화
   200배 시야에서 조직 관찰 부위 4곳의 점막내 혈관 수를 측정한 후 이를 평균하여 실험군인 우측 귀의 평균 혈관수가 대조군에 비해 차이가 없는 경우 0, 10∼25% 이상 증가한 경우 ＋로 25% 이상 증가한 경우 ＋＋로 판정하였다.
염증 세포 침윤
   200배 시야에서 3개 조직절편의 관찰 부위 4곳의 점막내 평균 염증 세포 침윤수가 없을 경우 0, 5개 미만인 경우 ＋, 5개 이상인 경우 ＋＋로 판정하였다.
상피의 이형성 정도
   정상적으로도 입방형 혹은 원주형 상피를 보일 수 있는 이관의 고실 입구부를 제외한 조직 관찰 부위 3곳에서 편평상피세포가 입방형 혹은 원주형으로 이형성을 일으킨 정도를 관찰하되 200배 시야에서 50% 미만의 상피 세포 이형성을 보이는 경우 ＋, 50% 이상의 이형성을 보이는 경우 ＋＋로 판정하였다.

Periodic acid­Schiff(PAS) 염색 조직 소견­점액 분비 세포 관찰
   각 개체별로 고막, 고실 갑각, 이낭 상피에서 점액 분비 세포로의 이형성으로 인해 PAS 염색시 양성을 보이는 세포가 가장 많은 곳을 200배 시야로 관찰하되 세 부위에서 PAS 양성 세포가 이따금씩 관찰될 경우 ＋, 한 시야 전체에서 광범위하게 관찰될 경우 ＋＋로 판정하였다.

결     과

고막 소견

   고막의 염증 소견을 대조군인 좌측 귀와 비교 관찰한 결과 약물 투여를 하지 않은 제 1 군에 비해 항생제 단독 투여를 시행한 제 2 군 및 항생제와 스테로이드를 병합 투여한 제 3 군에서 염증반응의 정도가 경함을 관찰할 수 있었으며, 천자 부위의 고막 천공이 대조군인 좌측 귀에서는 4일째부터 전 예에서 관찰되지 않았던 반면, 실험군인 우측 귀는 군에 따라 천공 부위의 치유 속도에 차이가 있음을 실험 과정에서 관찰할 수 있었다(Table 1).

제 1 군
   고막천자를 통하여 균을 주입한 후 4일째 실험군인 우측 귀는 전 예에서 급성 중이염에 합당한 고막 소견으로 고막의 발적, 화농성 삼출액의 존재 및 고막이 두꺼워진 소견을 관찰할 수 있었으며, 천자 부위의 천공의 크기는 감소한 소견을 관찰할 수 있었다. 7일째 역시 전 예에서 고막의 염증을 관찰할 수 있었으나 삼출액은 소실된 양상을 보여 4일째 소견에 비해 염증 소견이 감소된 양상을 보였고 고막 천공은 3예 중 2예에서 아직 남아 있었으나 크기는 현저히 줄어 있었다. 14일째에도 전 예에서 고막은 완전한 정상 소견을 보이지 못하였으나 천공은 모두 치유된 소견을 보였다.

제 2 군
   4일째 고막은 급성 중이염에 합당한 소견을 보여 주었으나, 제 1 군에 비해서는 그 반응이 경미하였고, 고막 천공은 크기가 감소하였으나 3예 모두 존재하였다. 7일째는 전 예에서 약간의 고막 발적과 두께 증가 외에는 염증반응이 현저히 감소한 소견을 관찰할 수 있었고, 고막 천공은 전 예에서 관찰되지 않았다. 14일째는 3예 중 1예에서 고막이 약간 두꺼워져 있는 소견 이외에는 거의 정상 소견을 보였다.

제 3 군
   4일째 고막은 제 1 군 및 제 2 군에 비해 발적 및 두께 증가와 같은 염증반응이 경미한 소견을 보였으나, 고막천자 부위의 천공은 전 예에서 크기가 거의 줄지 않는 소견을 보였다. 7일째에는 3예 중 1예에서만 약간의 고막 발적을 보일 뿐 그외 염증반응은 관찰 되지 않았고, 천공은 전 예에서 크기는 감소하였으나 여전히 남아 있었다. 14일째는 전 예에서 대조군인 좌측 귀와 비교할 때 차이를 보이지 않아 염증 반응이 소실되었음을 확인할 수 있었고, 고막 천공은 모두 치유된 소견을 보였다.

조직 소견

   중이 및 이낭의 여러 부위에서 점막의 염증 소견은 비교적 비슷한 양상을 보였으며, 염증반응의 정도에 대한 반정량적인 분석 결과는 Table 2와 같다.

제 1 군
   고막천자를 통하여 폐렴구균을 주입한 4일째와 7일째 조직학적으로 상피하층의 두께 증가, 혈관 확장 및 현저한 염증세포 침윤과 같은 급성 염증 반응이 뚜렷이 관찰되었고(Fig. 1A and D；Fig. 2A and D), 중이 상피세포도 대조군에 비해 많은 부분에서 편평상피에서 입방형 또는 원주형 섬모세포로 대치되어 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 2A and D). 14일째는 상피하층 두께가 감소되고 혈관 확장 및 염증세포 침윤은 줄어 염증 반응이 경감되었음을 확인할 수 있었으나(Fig. 1G, Fig. 2G), 편평 상피 세포에서 섬모 세포로의 이형성은 여전히 남아 있었다(Table 2)(Fig. 2G). 중이 점막에서 PAS 염색상 양성을 보이는 점액 분비 세포로의 이형성 또한 시간이 경과함에 따라 감소하는 양상을 보였으나 14일째에도 관찰할 수 있었다(Fig. 2A, D and G；Fig. 3).

제 2 군
   4일째 중이 점막의 조직 소견은 약물 투여를 하지 않은 제 1 군에서 처럼 심한 염증 소견을 보였으나 그 정도가 경미 하였고 7일, 14일째 조직 소견에서는 빠른 염증반응의 감소를 관찰할 수 있었으며 상피 점막의 점액 분비 세포로의 이형성도 4일째 소견에 비해 7일 및 14일째는 뚜렷이 감소하는 양상이 관찰되었다(Table 2, 3.)(Fig. 1B, E and H；Fig. 2B, E and H).

제 3 군
   4일째 점막의 조직 소견에서 점액 분비 세포로의 이형성을 포함한 염증 반응이 제 1 군 및 제 2 군에 비해 현저히 경미하였으며, 7일째는 상피하층 두께와 혈관 확장 정도만 대조군에 비해 약간 증가했을 뿐 그외 조직 소견은 대조군과 비교할 때 크게 차이를 보이지 않았고, 14일째 점막의 조직 소견은 대조군과 거의 동일하였다(Table 2, 3)(Fig. 1C, F and I；Fig. 2C, F and I).

고     찰

   실험적으로 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae 혹은 Staphylococcus aureus 등의 균주를 이용해 급성 중이염을 일으키는 동물 모델이 개발되어 왔다.^1)2)8-12) 이들은 고막천자를 통해 중이강내로 직접 균주를 투여하거나 혹은 이낭을 열고 균주를 주입한 후 시간 경과에 따라 중이내에서 일어나는 염증반응을 관찰하였는데, 대부분의 보고에서 균의 투입 후 100%에서 급성 중이염이 유발되었고, 투여 후 3∼4일에 염증반응이 최고에 달하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 이러한 실험적 급성 중이염의 중이 점막은 균주의 자극과 같은 항원 자극 이후 중이 점막 내의 혈관 및 점막 자체에 면역글로불린 G, 분비 면역글로불린 A 및 면역글로불린 M 등이 발현되고, 이러한 면역 글로불린의 발현과 함께 호중구 및 림프구 등의 염증세포가 다양하게 관찰되어 균주 투여 후 중이 점막에서의 급성 염증반응이 중이염의 발생에 관여한다고 알려져 있다.¹²⁾ 또한 이같은 실험적 급성 중이염의 발생 여부는 수술 현미경하 고막 관찰시 삼출액의 존재나 고막의 두께 증가 및 발적 등과 같은 염증 소견의 관찰과 함께 중이 점막의 조직학적 관찰로 급성 염증반응이 나타나는 정도를 관찰함으로써 가능하였다. 본 실험에서도 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae의 중이강내 투여시 100%에서 급성 중이염이 유발됨을 수술 현미경하 고막 관찰 및 중이 점막의 조직학적 관찰을 통해 확인할 수 있었다.
   실험적 급성 중이염을 일으킨 흰쥐의 고막 소견으로 사람에서 처럼 고막 발적, 고막 두께의 증가, 삼출액의 존재 등이 관찰되었는데,¹⁾²⁾ 본 실험에서도 급성 중이염을 일으킨 모든 실험군에서 4일째 고막 소견은 급성 중이염에 합당하였고, 시간이 경과함에 따라 염증반응이 소실되는 양상을 관찰할 수 있었다. 항생제 투여시 고막의 염증반응은 보다 빠르게 정상화된다고 보고되었으며,¹⁾²⁾ 본 실험에서도 항생제를 투여한 제 2 군에서는 약물 투여를 하지 않은 제 1 군에 비해 고막 소견에서 경한 염증반응과 빠른 치료효과를 확인할 수 있었다.
   실험적으로 급성 중이염을 일으킨 흰쥐의 중이 점막에 미치는 항생제의 효과를 조직학적으로 살펴본 보고에 의하면 항생제의 투여는 점막 상피하층의 두께를 감소시키고 염증세포의 동원을 감소시키며, 혈관 확장이나 점막 상피층의 이형성을 현저히 감소시킨다고 알려져 있는데,¹⁾²⁾ 이는 본 실험에서 약물 투여를 하지 않은 제 1 군의 중이 점막에 비해 제 2 군의 점막에서 염증반응이 감소된 것과 일치하였다. 특히 항생제 투여는 중이 점막의 상피층이 점액분비세포로 이형성되는 현상도 경감시켜 급성 중이염에서 삼출성 중이염으로의 진행을 감소시킬 수 있음이 임상적 및 실험적으로 밝혀졌는데,²⁾¹³⁾ 실험적으로 급성 중이염을 일으킨 흰쥐의 중이 점막을 조직학적으로 관찰했을 때 항생제를 투여한 군에서 상피세포의 점액분비세포 혹은 폴립으로의 이형성이 적게 일어난다고 하였다. 본 실험에서도 항생제 단독 투여군인 제 2 군의 중이 점막이 제 1 군에 비해 경한 상피세포 이형성 소견을 보였고, 특히 PAS 염색을 통해 관찰한 조직 소견에서도 점액분비세포로의 이형성이 감소되었음을 관찰할 수 있었다. 이같은 실험 결과는 급성 중이염의 치료로 적절한 항생제의 충분한 투여가 삼출성 중이염과 같은 급성 중이염의 후유증 발생을 방지한다는 임상에서의 치료 원칙을 뒷받침하는 실험적 근거를 제시한다고 할 수 있다.
   스테로이드가 염증반응에 미치는 영향에 대해서는 염증세포내에서 Interleukin-1(IL-1), IL-6 및 종양괴사인자(Tumor necrosis factor)와 같은 염증매개물질 유전자의 전사를 억제하고, 혈관 내피 세포에서 중성구의 유착 및 이동에 결정적인 역할을 담당하는 세포유착분자인 Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) 등의 발현을 억제함으로써 염증 반응을 감소시키는 것으로 알려져 있는데,¹⁴⁾ 이같은 항염증 효과를 조직학적으로 관찰하는 실험으로 Brodie 등은 유전적으로 내이에 골이형성이 일어나는 LP/J 생쥐에서 스테로이드를 투여한 경우 염증 반응이 감소됨을 보고하였다.⁵⁾
   반면, 스테로이드의 항염증 효과는 조직내에서 상처 치유는 오히려 지연시킬 수 있다고 알려져 있는데,¹⁴⁾ 본 실험에서도 균의 주입을 위해 시행한 고막천자 부위의 천공이 각 군별로 치유되는 속도가 다름을 관찰할 수 있었는데 제 3 군에서 가장 느린 치유 반응을 보인 점에 대해 스테로이드의 작용을 고려하기 위해서는 추가적인 실험과 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   항생제와 스테로이드의 병합투여가 실험적 급성 중이염을 일으킨 고막 소견에 미치는 영향은 이전에 보고된 바가 없는데, 본 실험을 통해 관찰한 결과 항생제를 단독으로 투여한 제 2 군에 비해 고막 발적, 두께 증가 및 삼출액 발생 둥과 같은 염증소견이 뚜렷히 경감됨을 확인할 수 있어 항생제 투여로 인한 항균 효과와 함께 스테로이드가 지닌 항염증 효과가 이러한 결과를 초래하였을 것으로 생각된다.
   중이염 환자에게 항생제와 함께 스테로이드를 투여하는 병합요법은 대개 삼출성 중이염에서 임상시험이 이루어졌는데, Podoshin 등은 135명의 삼출성 중이염 환아를 대상으로 항생제 단독 투여에 비해 항생제와 스테로이드를 병합투여한 경우 삼출성 중이염이 의미있게 잘 치유됨을 보고한 바 있다.¹⁵⁾ 급성 중이염의 경우 일반적으로 항생제 투여가 보편적인 치료이지만 급성 중이염의 합병증으로 감각신경성 난청이 온 경우와 안면신경마비가 동반된 경우에는 항생제와 함께 스테로이드를 투여하는 것이 치료 효과를 높일 수 있으며,¹⁶⁾ 그 외에 급성 염증에 대해 항생제와 함께 스테로이드를 투여하는 치료방법은 세균성 뇌막염 환자의 치료에도 널리 알려져 합병증 및 후유증 방지에 이용되고 있는데,⁶⁾⁷⁾ 이같이 임상적으로 치료효과가 뛰어남이 보고된 급성 염증에 대한 항생제 및 스테로이드의 병합치료가 실험적으로 조직의 염증반응 감소를 일으키는 것을 확인한 보고는 매우 드물다. 본 실험에서는 항생제와 스테로이드의 병합 투여가 급성 염증에 미치는 영향을 조직학적으로 살펴보았는데, 그 결과 병합 투여군인 제 3 군의 경우 약물 투여를 하지 않은 제 1 군이나 항생제를 단독으로 투여한 제 2 군에 비해 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae로 유발시킨 급성 중이염의 염증반응을 감소시켜 4일, 7일째 조직 소견에서 혈관 확장, 염증세포 침윤 및 점막 상피하층의 두께 모두 현저히 감소되었고 14일째에는 대조군과 비교할 때 염증반응이 거의 관찰되지 않은 소견을 보였다. PAS 염색을 통해 중이 점막의 점액분비세포로의 이형성 여부를 관찰한 결과도 항생제 및 스테로이드를 병합 투여한 제 3 군의 경우 점액분비세포로의 이형성이 가장 낮게 일어남을 확인할 수 있었는데 이는 급성 중이염의 후유증 중 중이 점막 상피세포가 분비세포로 변할 경우 빈번히 발생할 수 있는 삼출성 중이염으로의 진행을 막는데 항생제와 스테로이드의 병합 투여가 항생제 단독 투여보다 효과적일 수 있음을 시사한다.

결     론

   저자들은 log phase type 3 Streptococcus pneumoniae를 이용하여 흰쥐의 중이에 급성 중이염을 유발하였고, 수술 현미경하 고막 소견의 관찰과 Hematoxylin-Eosin 염색 및 Periodic acid-Schiff 염색을 통한 중이 점막의 조직학적 소견을 통해 염증 반응을 시간적으로 관찰할 수 있었으며, 실험적 급성 중이염의 염증 반응에 미치는 항생제와 스테로이드의 효과를 분석하였다. 본 연구는 항생제와 스테로이드의 병합 투여가 급성 중이염에서 염증 반응의 예방, 치료 및 삼출성 중이염으로의 이행을 방지함에 있어 도움을 줄 수 있음을 관찰한 기초적인 동물 실험으로 앞으로 이러한 치료의 임상적 활용을 위해 보다 다양하고 추가적인 실험이 필요하리라 생각된다.

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