| Expression of bFGF and CD-31 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. |
| Woo Seok Kim, Dong Yeup Lee, Yong Bum Kim, Chang IL Cha, Joong Saeng Cho, Howe Young Ahn |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul, Korea. enthn@unitel.co.kr |
| 후두 편평세포암종에서 Basic Fibroblast Growth Factor와 CD-31의 발현양상 |
| 김우석 · 이동엽 · 김용범 · 차창일 · 조중생 · 안회영 |
| 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
후두편평상피세포암ㆍBasic fibroblast growth factorㆍCD31ㆍAngiogenesis. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Tumor angiogenesis is an essential process required for growth and metastasis of cancer. Basic fibroblast growth factor (bFGF) is one of angiogenetic factors, and platelet endothelial cell adhesion molecule (CD-31) is the commonly used marker to identify the vessel. It is unclear that the degree of angiogenesis and expression of bFGF are related to the growth and metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma. We examined the expression of bFGF and degree of angiogenesis in laryngeal squamous cell carcinoma and compared them to normal larynx.
Relationship between bFGF and angiogenesis to growth and nodal metastasis in laryngeal squamous cell carcinoma was also evaluated.
MATERIAL AND METHODS: Immunohistochemical study for bFGF and CD-31 were performed to detect the angiogenetic factor and degree of angiogenesis in 24 squamous cell carcinoma of larynx and 6 normal laryngeal tissue. Relationship of bFGF expression and degree of angiogenesis in laryngeal squamous cell carcinoma were compared to that in normal larynx. We evaluated relationship of expression of bFGF and degree of angiogenesis to primary stage and nodal stage in laryngeal squamous cell carcinoma.
RESULTS:
These expression of bFGF and degree of angiogenesis in laryngeal squamous cell carcinoma were significantly higher than in the normal control (p<0.05). The degree of angiogensis were significantly correlated with bFGF expression (p<0.05): the bFGF expression and degree of angiogenesis were not correlated to the nodal stage, but to the primary stage in laryngeal squamous cell carcinoma (p<0.05).
CONCLUSION:
These results indicate that bFGF and angiogenesis may play an important role in the growth of larygeal squamous cell carcinoma. |
| Keywords:
bFGFㆍCD-31ㆍAngiogenesisㆍLaryngeal squamous cell carcinoma |
서론
신생혈관 생성(angiogenesis)은 종양과 같은 병리적인 상태나 발생과정에서 일어나는 새로운 미세혈관의 발달과 성장을 의미한다. 종양은 새로운 혈관의 생성 없이는 3 mm3 에서 5 mm3이상 성장할 수 없다고 보고되고 있다.1) 따라서 신생혈관 생성은 태생기 발달과정이나 상처치유 뿐 아니라 종양의 성장과 전이에 영향을 주는 중요한 과정이다. 1971년 Folkman에 의해 종양의 성장이 신생혈관 생성에 의존한다는 가설이 처음 제기된 이래로 종양의 성장및 전이와 신생혈관 생성에 관한 연구가 진행되어 왔다. 현재 혈관생성을 촉진시키는 인자로는 basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-β, vascular endothelial growth factor 등 다양한 인자들이 발견되었으며2) 이중 Basic fibroblast growth factor(이하 bFGF)는 강력한 혈관 생성 유발인자의 하나로 종양의 성장과 전이를 유발시키는 물질로 알려져 있고 방광암, 성상 세포종 및 두경부 편평세포암종 등에서 작용함이 보고되고 있다.3-6) 또 최근에는 Platelet endothelial cell adhesion molecule(PECAM-1/CD-31, 이하 CD-31)과 factor Ⅷ-related antigen이 신생혈관의 생성정도를 정량적으로 파악하는데 이용되고 있으며, 이중 CD-31이 훨씬 민감하여 널리 이용되고 있다.7)8) 이와같이 다양한 종양에서 혈관의 생성정도나 유발인자의 발현을 통한 실험이 진행되고 있으나 후두 편평세포암종에서 bFGF가 혈관 생성을 유발하는지, 또 종양의 성장과 전이에 관여하는지에 대한 연구는 없다.
이에 저자들은 bFGF가 다른 종양에서와 마찬가지로 후두 편평세포암종에서 정상에 비해 높게 발현되며 신생혈관 생성을 증진시키는지의 여부를 알아보고, 후두 편평세포암종에서 bFGF와 신생혈관형성정도가 종양의 성장과 전이에 관계가 있는지를 알아보기 위해 원발병소의 병기와 림프절 전이여부에 따른 발현율을 비교하고자 하였다.
대상 및 방법
대상
1993년 1월부터 1997년 3월까지 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 후두 편평세포암종으로 진단받은 환자중 24예를 대상으로 하였고, 대조군은 후두 결절 환자에서 수술중 채취한 주위의 정상 후두 조직 6예를 대상으로 하였다.
24예 모두가 남자였으며, 연령 분포는 46세에서 70세(중앙값 58세)였다. 후두암의 임상적 분류는 1997년 AJCC의 TMN 분류에 의해 구분하였으며(Table 1), T1이 3예, T2가 9예, T3가 7예, T4가 5예였고, stage Ⅰ이 3예, sta-ge Ⅱ가 3예, stage Ⅲ가 8예, stage Ⅳ가 10예였다.
방법
면역조직화학적 검사
각각의 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 포매시키고 4 μm의 두께로 연속절편을 작성하여 Hematoxylin-Eosin으로 염색하여 병변조직이 현저한 곳을 선정하였다. bFGF과 CD-31의 검출은 일반적인 면역조직화학 염색법(immunohistochemistry method)을 사용하였다. 먼저 xylene으로 5분간 탈 파라핀화하고 100%, 90%, 80 % 알콜로 처리한 후 증류수로 함수시켰다. 3% 과산화수소수로 15분간 처리하여 내인성 과산화효소를 억제시킨 후 pH 7.6의 Tris 완충액으로 5분간 2회 헹군 후 비특이적 염색을 없애기 위해 blocking 시약(phosphate buffered saline, carrier protein, 15 mM sodium azide)으로 처리하고 microwave oven에서 121℃로 15분간 가열한후 Tris 완충액으로 5분간 2회 수세하고 각각의 일차항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. bFGF의 일차 항체로는 monoclonal mouse anti-human bFGF(Cat# GF22, Oncogene research products, Cambridge, MA)를 1：50으로 희석하여 사용하였고, CD-31의 일차항체로는 혈관내피세포에 있는 CD-31에 대하여 선택적으로 반응하는 단클론성항체인 monoclonal mouse antihuman CD-31(Cat# M0823, Dako Corporation, Carpinteria, California)를 1：80으로 희석하여 사용하였다. 이후에 Tris 완충액으로 5분간 2회 수세 후 이차항체(Biotin으로 결합된 antimouse Ig)로 10분간 반응시켰으며 streptoavidin 시약으로 10분간 반응시킨 후 diaminobenzidine 시약으로 양성세포가 갈색으로 충분히 염색될 때까지 관찰하면서 반응시간을 조절하였고 15초간 Harris hematoxylin 염색으로 대조염색한 후 봉입하였다. 음성 대조군은 CD-31, bFGF에 대한 일차항체 대신 phosphate buffered saline으로 대치시키고 나머지 과정은 같은 방법으로 면역염색하였다.
bFGF의 평가
면역염색된 모든 조직은 임상양상을 알지 못하는 두명의 병리전문의가 조사하였으며 저배율로 관찰하면서 염색이 잘 되어 있는 부분을 골라 200배의 확대시야에서 관찰하고 음성 대조군에서의 염색강도를 음성(-)으로 정하였고, 세포막주위에만 염색된 경우를 약양성(＋1), 세포질에 염색되나, 세포가 선명하게 보이는 경우를 중등도 양성(＋2), 모든 세포질이 진하게 염색된 경우를 강양성(＋3)으로 정하여 구분하였고, 반응범위에 따라 검경시야의 25% 이하의 세포에서 염색상을 보일 경우를(＋1), 25%에서 50%의 양성반응을 보일 경우(＋2), 50%에서 75%의 양성 반응을 보일 경우를(＋3), 75% 이상의 경우를(＋4)로 하여 염색정도와 염색범위를 곱한 값으로 bFGF에 대한 종양세포의 양성 반응을 준 정량적으로 측정하였다.
미세혈관 생성정도의 평가
CD-31의 면역화학염색후 두명의 병리의사가 저배율(×40, ×100) 광학현미경하에서 슬라이드내에 종양조직 근처에서 염색된 미세혈관(세정맥과 모세혈관)이 가장 많은 부위를 선택한 후 배율을 200배로 바꾸어 한 시야 내에 있는 혈관의 수를 세어 평균값으로 표시하였고, CD-31에 염색된 종양주변의 미세혈관의 수는 혈관내피세포(endothelial cell)의 세포질에 갈색으로 염색된 혈관만을 세었다.
결과 분석 및 통계학적 검증
먼저 후두 편평세포암종과 정상조직에서의 bFGF의 발형정도와 신생혈관의 생성정도를 비교하고 bFGF가 혈관신생에 미치는 영향을 관찰하였다. 또한 후두 편평세포암종에서 bFGF와 혈관 생성정도가 종양의 성장과 전이에 관계가 있는지를 알아보기 위해 원발병소의 병기와 림프절 전이여부에 따른 발현율을 비교하였다. 이들의 연관성 여부에 대한 통계학적 검증은 student t-test를 사용하였다.
결과
정상후두와 후두 편평세포암종에서 bFGF의 발현율과 미세혈관의 생성 정도
후두 편평세포암종에서의 bFGF의 발현율은 6.2±4.3이었고 대조군인 정상 후두조직에서의 bFGF의 발현율은 0.7±0.8로서 후두 편평세포암종에서 bFGF의 발현율이 의미있게 증가 하였다(p<0.05)(Fig. 1).
후두 편평세포암종에서는 미세 혈관의 수가 27.3±8.2였고, 정상 후두조직에서의 미세혈관의 수는 8.2±2.8로 후두 편평세포암종에서 미세 혈관의 수가 의미있게 증가 하였다(p<0.05)(Table 2)(Fig. 2).
후두 편평세포암종에서 bFGF의 발현율과 미세혈관의 생성 정도
후두 편평세포암종에서 미세혈관의 평균수 27.3을 기준으로 미세혈관의 수가 평균미만인 군 13예와 이상인 군 11예로 비교하였을 때 bFGF의 양성 발현율은 각각 4.3±4.0, 8.5±3.5로 미세혈관의 수가 많은 군에서 양성 발현율이 의미있게 증가하였다(p<0.05)(Table 3).
후두 편평세포암종에서 원발병소의 병기와 bFGF의 발현율과 미세혈관의 생성정도와의 관계
각 원발병소의 병기는 T1, T2군이 12예, T3, T4군이 12예로, bFGF의 양성 발현율은 T1, T2군 4.3±3.2, T3, T4 군 8.1±4.5로 T3, T4군에서 bFGF의 발현률이 의미있게 증가하였다(p<0.05). 또한 미세혈관의 수에 있어서 T1, T2군은 24.5±5.0, T3, T4군은 31.2±8.6으로 T3, T4군에서 T1, T2군에 비하여 미세혈관의 수가 의미있게 증가하였다(p<0.05)(Table 4).
후두 편평세포암종에서 경부 림프절 전이 유무에 따른 bFGF의 발현율과 미세혈관의 생성정도와의 관계
총 24예에서 bFGF의 양성 발현율은 비전이군 8예에서 5.5±4.8, 전이군 16예에서 6.7±4.3으로 림프절 전이가 있는 군에서 전이가 없는 군에 비하여 증가하였으나 통계학적 의미는 없었다(p>0.05). 또한 미세혈관의 평균수는 비전이군에서 28.5±6.2, 전이군에서 26.9±8.6으로 두 군 사이에 미세혈관 수의 차이는 없었다(p>0.05)(Table 5).
고찰
종양의 암세포가 종양주변에서 새로운 colony를 형성하고 주변의 림프절이나 타장기로 전이하기 위하여는 종괴 주위에 새로운 혈관 형성(angiogenesis)이 필수적이다. 혈관형성 없이 단순히 확산에 의하여 산소나 영양소를 공급받는 경우 종괴의 직경이 1∼2 mm 이상은 자랄 수 없다.9) 또한 형성된 신생혈관은 기존의 정상혈관과는 달리 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 암세포가 침습할 수 있어 전이의 통로가 될 수 있으므로 신생혈관의 형성은 암세포의 성장과 전이에 중요하다.9) Folkman 등10)이 종양의 성장과 혈관의 수가 밀접하게 연관된다는 것을 밝혔고, 혈관형성에 관여하는 tumor angiogenesis factor(TAF)라는 매개체를 처음으로 악성종양에서 추출한 이후 fibroblast growth factor(FGF), angiogenin, transforming growth factor α, β(TGF-α, β), tumor necrotic factor α(TNF-α), vascular endothelial growth factor(VEGF), platelet derived endothelial cell growth factor(PDECGF), granulocyte colony-stimulating factor, placental growth factor, interleukin-8, hepatocyte growth factor, proliferin 등의 혈관 생성 인자가 밝혀져 있다.2) 이러한 혈관 생성 인자중의 하나인 Fibroblast growth factor(FGF)는 소의 뇌하수체에서 추출한 활성성분의 하나로 2가지의 형태인 acid-FGF와 basic-FGF로 구분되며, acid-FGF는 뇌와 망막에 국한되어 존재하나 basic form은 어느 곳에나 존재한다고 알려져 있다.10) 최근 이러한 bFGF는 9가지의 FGF군 중 하나인 FGF-2로 받아 들여지고 있고,2) 146개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 중배엽성 조직과 신경 외배엽에서 기인된 세포의 분화를 촉진시키는 요소로 증식과 발달에 영향을 미치는 인자로 알려져 있다. 이러한 bFGF는 혈관형성과 창상치유를 촉진시키며 특히 태생기 발생 초기에 크게 영향을 미친다.11) 이외에도 bFGF는 세포의 접착, 신경의 분화 등에도 영향을 미치며 섬유아세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 골아세포, 근육세포 등의 유사분열을 유발시키고 섬유아세포, 대식세포, 내피세포 등의 세포에서 생성되는 것으로 알려져 있다.12) 이러한 bFGF는 강력한 혈관 생성 유발인자일 뿐 아니라 종양의 성장과 전이를 유발시키는 강력한 인자로서 방광암3) 환자의 소변내에서 정상인에 비해 bFGF의 양이 높으며, 성상세포종5) 등에서 bFGF의 발현이 높으며, 폐의 선세포암13)에서는 bFGF의 발현이 증가할뿐만 아니라, 종양의 원발병기와 림프절 전이와도 상관관계를 가진다고 하였다. Dellacono 등6)은 bFGF가 두경부 편평세포암에서 종양과 혈관 내피세포에서 발현이 증가하나 종양조직내의 괴사된 부위에서는 발현하지 않는다고 하였고, Schultz-Hector 등14)은 편평상피 세포암을 가진 생쥐에 대한 실험을 통해 bFGF의 발현이 있는 종양에서 발현이 없는 종양보다 종양의 성장이 의미있게 증가된다고 하였으며 종양세포에의한 bFGF의 생산과 종양의 성장과의 상관관계를 보고 하였다. 현재까지 다양한 암종에서 bFGF에 대한 연구가 이루어졌으나 후두 편평세포암종은 두경부 편평세포암종의 일부로서만 연구되어 있을 뿐으로 후두 편평세포암종에서의 bFGF의 발현 및 영향에 대해서는 정확히 알수 없었다. 따라서 본 연구에서는 후두 편평세포암종에서의 bFGF의 발현도에 대해 연구하였으며, 후두 편평세포암종에서 정상 후두조직보다 bFGF의 발현도가 유의하게 높음을 알수 있었고, 종양의 원발병기와의 비교에서 종양의 크기가 클수록 bFGF의 발현이 증가함을 알수 있었다.
신생혈관의 형성정도와 종양의 성장과 전이와의 관계를 밝힌 다양한 연구가 있었으며, Weidner 등7)은 anti-factor Ⅷ-related antigen에 의한 미세혈관의 생성정도가 종양의 전이율과 유의한 상관관계를 이룬다고 하였고, Takahashi 등15)은 위의 미분화 수질암에서 factor Ⅷ을 통한 신생혈관형성의 정도가 종양의 임상적 병기가 진행함에따라 증가된다고 하였으며, Murray 등8)은 혈관과 림프관에 모두 반응하는 factor Ⅷ antigen에 비하여 CD-31이 림프관의 내피세포에는 반응하지 않고, 혈관 내피세포에만 특이적으로 반응하는 장점을 가져 CD-31이 조직내 혈관에 대한 가장 좋은 표식자라고 하였다. 또한 Maccharini 등16)은 폐의 비 소세포암 환자에서 종양의 신생 혈관 형성 정도가 전이에 대한 가장 의미있는 예후인자라고 하였고, Wakui 등17)은 전립선암에 있어서 종양의 신생혈관 형성정도가 골전이와 상관관계를 가진다고 하였다. Gasparini 등18)은 CD-31을 이용하여 두경부 편평세포암종에서 종양내 신생혈관 수와 염색강도를 측정하였는데 림프절 전이가 있는 경우가 전이가 없는 경우보다 신생혈관의 수가 통계학적으로 유의하게 높았음을 보고하였다. Murray 등8)은 후두암에 있어서 CD-31을 이용한 신생혈관 생성의 정도가 림프절 전이를 예측할 수 있다고 하였으며 신생혈관의 수가 후두암의 재발과 전이여부에 대한 예후인자중의 하나라고 하였다.
종양의 혈관 형성 인자로서의 bFGF와 미세혈관생성의 정량화를 통한 상호관계를 밝히고자 하는 연구의 일환으로 Relf 등4)은 유방암에 있어서 bFGF와 미세혈관형성과의 상관관계를 밝히고자 하였으나 통계학적 유의성을 찾지 못하였고, Li 등19)은 뇌종양에 있어서 미세혈관의 정량적 분석을 통해 bFGF가 신생혈관형성을 유발하고 종양의 표지인자로서 가능함을 밝혔다. Mattern 등20)은 폐의 상피 세포암에 있어서 Vascular endothelial growth factor(VEGF)와 bFGF의 면역화학적 염색의 발현증가가 종양의 신생혈관 형성정도와 서로 상관관계를 이룬다고 하여 종양의 신생혈관 형성에 협동적으로 관여할지도 모른다고 추론하였다.
저자들은 이비인후과영역의 대표적 종양인 후두 편평세포암종에 있어서도 신생혈관의 형성과 혈관 형성인자로서의 bFGF와의 상관관계가 있는지의 여부를 밝히고자 정상 후두 조직과 종양조직내에서의 미세혈관의 수와 bFGF의 발현도를 비교하였으며, 정상 후두조직보다 후두 편평세포암종에서 미세혈관의 수와 bFGF의 발현도가 유의하게 높아 이들이 후두 편평세포암과 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 또한 미세혈관의 수가 평균이상인 군에 있어서 bFGF의 발현이 유의하게 높아 발현된 bFGF가 후두 편평세포암종에서 혈관형성을 유발할 수 있을것이라 평가하였다. 이외에도 신생혈관의 수와 bFGF가 종양의 크기 즉 원발병소의 병기가 높은 군에서 발현율이 의미있게 높아 종양의 성장에 관여하리라고 여겨진다. 그러나 후두 편평세포암종의 림프절 전이에 따른 비교에 있어서는 통계학적 유의성을 찾을 수 없었다. 후두 편평세포암종에서 bFGF 및 신생혈관 형성정도와 림프절 전이와의 관련을 찾을수 없었던 저자들의 결과는 후두 편평세포암종이 림프절 전이가 적고 종양 발생 이후에 맥관의 형성이 이루어져 림프절 전이의 예측이 힘들다는 점 등의 여러요인들이 작용한 것으로 생각된다.
결론
이상의 결과로 후두 편평세포암종에서 bFGF의 발현도가 정상조직에 비하여 높으며, 종양의 성장에 혈관 생성 인자인 bFGF가 관여하고, 신생혈관의 성장을 유발함을 알 수 있었다. 그러나 미세혈관의 형성정도 및 bFGF의 발현과 림프절 전이와의 상관관계는 밝힐수 없었다.
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