| Signal Transduction System of Experimentally Induced Cholesteatoma in the Mongolian Gerbil. |
| Dong Hoon Lee, Kee Hyun Park, Hong Joon Park, Jeong Min Chun, Sung Chul Hwang |
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. parkkh@madang.ajou.ac.kr
2Department of Otolaryngology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea.
3Department of Pulmonary and Critical Medicine, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea. |
| Mongolian Gerbil에서 실험적으로 유도된 진주종에서의 신호전달체계에 관한 연구 |
| 이동훈1 · 박기현2 · 박홍준2 · 전정민2 · 황성철3 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;아주대학교 의과대학 이비인후과학교실2;호흡기내과학교실3; |
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| 주제어:
실험적 진주종ㆍ신호전달체계ㆍPLC-γ1ㆍEGFR. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Hyperproliferative character of the cholesteatoma in the middle ear seems to be related to epithelial cell proliferation and differentiation. The proliferation of cells, their differentiation and organization in specialized tissues and the expression of their differentiated properties are under control of a large number of regulatory processes and complex interactions called signal transduction. PLC-gamma1 is a substrate of protein kinase located in EGFR, PDGFR-alpha and -beta and signal transduction through PLC-gamma1 participates in the regulation of cell growth and differentiation. This study was undertaken to investigate the distribution of PLC-gamma1, EGFR and PDGFR in experimentally induced cholesteatoma, deep meatal skin and retroauricular skin of Mongolian gerbil.
MATERIALS AND METHODS:
Using Western blotting and immunohistochemical techniques, we investigated the reaction patterns of antibody to PLC-gamma1, EGFR, PDGFR-alpha and PDGFR-beta as a proliferation and differentiation marker in the experimentally induced cholesteatoma matrices of Mongolian gerbil. For the control, same study was performed with deep meatal skin and retrosuricular skin.
RESULTS:
By Western blotting, considerably higher levels of PLC-gamma1, EGFR protein were detectable in cholesteatoma compared with control, however, PDGFR-alpha and -beta were not detected in cholesteatoma The immunostaining intensity of PLC-gamma1 and EGFR at suprabasal cell layer and basal cell layer were intense in cholesteatoma than in control.
PDGFR-alpha and -beta were not detected in both cholestatoma and control.
CONCLUSION:
Over-expression of PLC-gamma1 and EGFR in induced cholesteatomas may contribute abnormal proliferation and differentiation of their epithelial cell. Authors suggest that induced cholesteatoma in Mongolian gerbils can be a good model of signal transduction study for cholesteatoma. |
| Keywords:
Induced cholesteatomaㆍSignal transductionㆍPLC-gamma1ㆍEGFR |
서론
중이 진주종은 만성중이염과 동반되거나 또는 단독 질환으로 발생하여 중이 주위의 두개골을 포함한 구조물들을 파괴하여 난청과 어지럼증 등의 내이 질환을 유발함은 물론 심할 경우에는 두개강 내까지 침범하여 생명을 위협할 수 있는 질환으로, 이 질환의 원인과 발병기전에 대하여 많은 연구가 되어 왔다. 현재까지는 기본적으로 상피세포의 과증식(hyperproliferation), 과분화(hyperdifferentiation), 이동(migration)등이 중요한 발병기전이 되는 것으로 생각되고 있다.1)2) 이러한 현상에 대한 현재까지의 연구는 주로 사람의 중이 진주종을 대상으로 면역조직화학염색법 등을 통해서 cytokeratin, involucrin, filaggrin 등의 발현을 확인하여 과분화나 과증식된 상태를 증명하여 왔으나,3) 최근에는 분자생물학적 방법이 도입되면서 세포외의 신호가 상피세포의 표면수용체 뿐만 아니라 세포내에서 어떻게 전달되는 지에 대한 연구가 시작되고 있다. 외부로부터의 정보가 세포막을 통해 여러 이차전달물질을 이용하여 세포의 내부로 전달되어 세포핵까지 이르는 일련의 과정을 신호전달체계(signal transduction pathway)라고 한다.4)5)
진주종의 발병기전에 대한 연구에 있어서 세포의 성장과 분화 그리고 종양화변환까지도 유발할 수 있는 신호전달체계에 대한 연구는 매우 중요하리라고 생각되며, 세포의 성장과 분화를 조절하는 유전자의 이상이 진주종의 형성에 관련될 수 있다는 가설이 제기되고 있어서 그 중요성이 더욱 강조될 수 있다고 생각한다.2)
이제까지 진주종의 신호전달체계에 대한 연구는 수술 중 얻어진 사람의 진주종을 대상으로 한 것이 있었으나,6)7)8) 수술적 치료를 시행하는 경우는 대부분이 상당히 진행된 상태이므로 그 발생이나 진행과정을 규명하기에는 많은 제약이 따르게 된다. 이에 저자들은 Mongolian gerbil의 외이도를 인위적으로 결찰하여 얻은 진주종으로 PLC-γ1, EGFR, PDGFR-α, PDGFR-β의 발현을 면역조직화학적 염색과 Western blotting을 이용하여 관찰하여 신호전달체계의 일부를 밝히고자 하였으며, 또한 향후 진주종 신호전달체계의 실험에 있어서 적절한 동물 모델로서 이용될 수 있는가에 대한 가능성을 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
실험적 진주종의 유발 및 실험조직의 제작
실험동물은, 체중 60∼75 g의 생후 90일에서 120일 된 25마리의 건강한 Mongolian gerbil들을 이용하였으며, ketamine hydrochloride(상품명 Ketar, 투여량 40 mg/kg)와 xylazine(상품명 Rompun, 투여량 8 mg/kg)을 근육 주사하여 Mongolian gerbil을 마취시키고, 일측 이개 후방을 연골이 보일 때까지 절개를 한 후 외이도를 2번 black silk로 결찰하였다.
일측 외이도를 결찰한 25마리의 Mongolian gerbil중 3개월 후 진주종이 형성된 21귀를 실험 대상으로 하였고, 반대측 귀는 정상 대조군으로 심부외이도상피와 후이개 상피를 채취하였다. Ether로 진주종이 형성된 Mongolian gerbil을 희생시킨 후 유양돌기포를 개방하여 생성된 진주종 중 절반을 취하여 진주종 주위의 골편을 제거한 후 생리식염수에 세척을 하자마자 -70℃로 조직을 급속냉동 시켰다. 심부외이도상피와 후이개상피도 역시 가급적 상피층 아래의 결체조직을 가능한 한 제거한 후 -70℃로 급속냉동 시켰다. 진주종 조직 중 유양돌기포에 남아있는 부분은 10% 포르말린에서 24시간 이상 고정한 후 10% EDTA(ethlenediamine tetraacetic acid)용액에 2∼3주간 탈석회화시킨 후 통상적인 방법에 따라 파라핀에 포매하였다. 대조군은 심부외이도 상피와 후이개상피를 외이도를 결찰하지 않은 쪽의 귀에서 채취하여 10% 포르말린에 24시간 고정 후 파라핀에 포매하였다.
Western blotting
조직을 EBC 완충액(40 mM Tris/HCl, pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.5% NP-40, 2 μg/ml aprotinine, 2μg/ml pepstatin, 2 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride)에 넣은 후 유리파쇄기를 이용하여서 조직을 파쇄한 후, 4℃에서 20분간 보관하면서 5분마다 vortex로 섞어주었다. 그 후 4℃에서 12,000 RPM으로 15분간 원심분리하여 상층액만을 다시 취하였다. 소의 혈청 알부민액을 표준으로 하여 ELISA법으로 각각의 단백질 양을 측정한 후 2 mg/ml 농도의 단백질이 되게 2Xsodium dedecyl sulfate(SDS) sample 완충액(100 mM Tris/HCl, pH 6.8, 200mM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)을 가한 후 75℃에서 5분간 가열하여 시료로 이용하였다. 전기영동은 mini-gel kit(Bio-Radⓡ)를 이용하여 100V로 1.5∼2시간동안 영동을 시켰고, 젤은 6.5% SDS/polyacrylamide를 사용하였다.
전기영동으로 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane으로 50V에서 약 1시간 동안 전기적인 방법으로 옮겼으며, Ponceaus 용액을 이용하여 단백질이 nitrocellulose membrane으로 옮겨졌음을 확인하였다. 이 nitrocellulose membrane을 5% non-fat dry milk(Carnation)가 함유된 TNE 완충액(10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 1시간 처리한 후 세균증식억제를 위한 10% sodium azide가 함유된 각각의 일차항체를 4℃에서 16시간 반응시켰다. 항EGFR항체(Santa Cruz Biotec. Inc. Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 1：1,000으로, 항PDGFR-α항체(Santa Cruz Biotec. Inc. Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 1：1,000으로, 항PD-GFR-β항체(Santa cruz Biotec. Inc. Santa Cruz. CA, U.S.A.)를 1：1,000으로, 항PLC-γ1항체(Lab. of Cell Signaling at NIH, Bethesda, Mayland, U.S.A.)를 1：4,000으로 희석시켰다. 그 후 TNE 완충액으로 10분간 3회 수세 후 이차 항체를 은박지로 싼 용기에 nitrocellulose membrane를 옮기고 1시간 정도 처리한 다음 다시 TNE 완충액으로 수세한 후 chemilumin-nescence reagent(NEN, Boston, MA)를 이용하여 X-ray film(Kodakⓡ)에서 3초에서 5분동안 감광시켰다.
Western blotting 결과의 분석은 진주종과 심부외이도 상피, 후이개상피의 해당 band의 발현 강도를 서로 비교하여 발현이 매우 강하면 강양성(＋＋), 보통의 강도로 확실한 발현이 보이면 양성(＋), 희미한 발현을 보이면 약양성(±), 발현이 되지 않으면 음성(-)으로 해석하였다.
면역조직화학적 염색
Paraffin에 포매한 조직을 4 μm로 절편을 만들어 poly-L-lysin으로 도포된 slide에 조직을 부착시켰다. 조직 slide를 58℃ 오븐에서 12시간 처리를 하고 xylene으로 15분씩 3회 탈파라핀하였다. 100%, 90%, 80%, 70%로 농도를 달리한 ethanol에 각각 5분간 처리한 후 증류수에 넣어서 함수화 과정을 진행하였다. 조직내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위하여 3% 과산화수소수와 methanol을 1：9을 비율로 혼합한 용액에서 15분간 처리를 한 후 비특이적 반응을 억제하기 위하여 정상 염소 혈청에 30∼40분간 처리하였다. 1차 항체인 항EGFR항체(Santa Cruz Biotec. Inc. Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 1：100으로, 항PDGFR-α항체(Santa Cruz Biotec. Inc. Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 1：30으로, 항PDGFR-β항체(Santa Cruz Biotec. Inc. Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 1：30으로, 항PLC-γ1항체(Lab. of Cell Signaling at NIH, Bethesda, Mayland, U.S.A.)를 1：150으로 각각 희석시켜서 4℃에서 16∼18시간 동안 반응시켰다. TBS로 세척 후 이차항체를 처리하고 Avidin-biotin Complex와 30분간 반응시킨 후 3-amino-9-ethyl-carbizole(AEC)로 약 4분 정도 발색시키고 Meyer's hematozylin으로 대조 염색을 시행하였다. 각각의 일차항체마다 16개의 진주종 조직 표본 중 5장씩의 slide를 염색하였고 각각 염색 시마다 심부외이도 상피와 후이개상피를 동일한 조건으로 염색하였다.
면역조직화학염색의 판정은, 염색된 조직 상피를 기저층(basal layer)와 기저상층(suprabasal layer)으로 나누어 관찰하였으며, 1차항체 대신 TBS를 도말시킨 표본을 음성대조군으로하여 양성 반응은 모두 특이 반응임을 확인하였고, 반응이 세포막 주변부만 약하게 염색된 경우를 약양성(focal staining, (±)), 400배 시야를 거의 채우는 정도로 강하게 염색이 된 경우를 양성(＋)으로 판정하였으며, 100배 현미경 시야에서 염색이 잘된 부위를 확인하고, 400배 시야에서 10회 판독하여 평균치를 구하였다.
결과
Western Blotting
Phospholipase C-γ1(PLC-γ1)
총 8회의 실험을 각각 다른 시료로 시행하였으며, 5회에서 30 μg protein/lane에서 진주종, 심부외이도상피, 후이개상피의 순서로 145KD의 protein band에서 강한 발현을 보였으며, 1회에서는 심부외이도상피, 진주종, 후이개상피, 1번에서는 후이개상피, 심부외이도상피, 진주종, 1번에서는 어느 lane에서도 발현이 관찰되지 않았다(Table 1, Fig. 1).
Epithelial growth factor receptor(EGFR)
총 5회의 실험을 각각 다른 시료를 이용하여 시행하여서 3회는 60 μg protein/lane에서 진주종에서 심부외이도상피나 후이개상피보다 170KD의 protein band에서 강한 양성발현을 보였으나 심부외이도상피나 후이개상피에서는 발현이 미미하였다. 나머지 2회에서는 진주종, 심부외이도상피나 후이개상피에서 모두 음성 반응을 보였다(Table 1, Fig. 2).
Platelet derived growth factor receptor-α(PDGFR-α)와 platelet derived growth factor receptor-β(PDGFR-β)
총 5회의 실험을 역시 각각 다른 시료를 이용하여 시행하였으며, PDGFR-α(170KD)나 PDGFR-β(180KD) 모두 후이개상피에서만이 약간의 발현이 있었을 뿐 진주종이나 심부외이도상피에서는 확실한 protein band를 관찰할 수 없었다(Table 1).
면역조직화학적 염색
Phospholipase C-γ1(PLC-γ1)
총 16개의 진주종 조직에서 12개에서 기저층과 기저상층의 강한 양성반응을 확인할 수 있었고 기저상층이 기저층보다 약간 강하게 염색되는 소견을 보였다. 심부외이도상피 역시 16개의 조직중 10개에서 강한 발현을 보였으며 기저상층의 발현이 기저층보다 약간 강한 듯 하였으나 큰 차이는 없었다. 2개의 조직에서는 동일한 조건하에서 염색한 심부외이도상피가 진주종보다 더 강한 발현을 하였다. 후이개상피의 경우 4개의 조직에서 약양성을 보였다(Table 2, Fig. 3).
Epithelial growth factor receptor(EGFR)
진주종이 형성된 16개의 조직을 심부외이도상피와 후이개상피와 동일한 조건하에서 염색하여서 본 결과 진주종의 경우는 13개의 조직이 기저상층과 기저층에서 강양성을 보였으며, 심부외이도상피와 후이개상피의 경우는 대부분이 발현이 약양성이거나 음성이었다(Table 2, Fig. 4).
Platelet derived growth factor receptor-α(PDGFR-α)와 platelet derived growth factor receptor-β(PDGFR-β)
16개의 진주종 조직에서 PDGFR-α나 PDGFR-β는 극히 일부에서만 약양성이 관찰되었고, 대부분이 음성발현을 보였다. 심부외이도상피와 후이개상피와 동일한 조건하에서 염색하여서 본 결과 모두 발현이 거의 없었다(Table 2).
고찰
진주종의 기원에 상관없이 진주종은 중이강내에 비정상적인 각질편평상피세포가 존재하는 것으로 특징지워질 수 있다. 중이강 내의 편평상피세포들은 과증식과 과분화의 양상을 보이며, 이 현상들은 cytokeratin 16, proliferation-associated nuclear antigen(Ki-67),9) filaggrin 그리고 involucrin등을 이용하여 어느 정도 증명이 되어 왔으나,1)3) 최근에는 신호전달체계가 발견되면서 연구에 분자생물학적 개념이 많이 도입되고 있다.
인체를 구성하는 세포는 각각의 단일한 세포 단위의 기능을 수행하고, 또한 하나의 기관으로서, 나아가서는 하나의 개체 수준의 기능을 수행하여야 한다. 이를 위해서는 세포와 세포간에 정보의 교환이 원활하게 이루어져야 하고, 결국 변화하는 외부 상황에 대하여 적절하게 대처하게 개체가 생명현상을 유지하게 된다. 즉 신호전달체계란 외부의 정보가 세포막을 통과하여 세포질을 거쳐 핵내로 전달되어 세포의 변화를 유발하는 일련의 과정으로 성장과 분화, 대사 등 생명 현상의 모든 과정에 필수적이며, 이러한 신호전달체계의 이상은 여러 질병을 초래하게 된다. 이 여러 단계들 중에서 한 부분의 이상이 있다면 신호전달과정이 정상적으로 이루어지지 않을 것이고, 비정상적인 증식이나 세포의 괴사등을 유사할 수도 있을 것이다. 진주종 세포에서 이 신호전달체계의 기전이 밝혀진다면 진주종의 병태생리에 대한 이해는 물론이고 나아가서 진주종의 치료와 예방에 있어서 중요한 전기를 마련할 수도 있을 것으로 사료된다.
편평상피세포의 증식과 분화의 조절에는 일차신호전달물질들인 interleukin-1, interleukin-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 종양괴사인자-β(TNF-β), transforming growth factor-α(TGF-α), prostaglandin, leukotrien, platelet derived growth factor(PDGF) 등이 관여하고, 이중 TGF-α, EFG, PDGF는 각각의 수용체내에서 phosphorylation을 통해 tyrosine kinase를 활성화시켜 세포증식을 유도하는 중요한 물질로 알려져 있으며, tyrosine kinase가 활성화되면, 이 효소의 기질인 신호전달물질로 Src homology 2(SH2) domain을 갖고 있는 phosphatidylinositol 3' kinase(PI 3-kinase), Pholpholipase C-γ(PLC-γ), Grb2/Sos1, Src 등 10여종이 활성화되어 신호전달이 이루어지는 것으로 알려져 있다.4)5)10)11)
EGFR은 170KD의 당단백질로 세포내 부위(intracellular tyrosine kinase domain), 세포외부위(extracellular ligand-binding domain), 세포막부위의 3부분으로 나뉘며, 세포외부위와 EGF가 결합하여 세포내부위의 tyrosine kinase를 활성화시키고, 신호전달경로를 통하여 핵내에서 c-jun 또는 c-fos 등의 transcription factor의 발현을 통해 DNA에 변화를 초래하여 세포의 증식을 유도한다.2) EFGR은 모든 배엽세포 기원의 조직에 모두 존재하나, 특히 피부, 위장관, 비뇨생식기의 상피에 많이 존재하는 것으로 알려져 있고 이미 피부질환인 건선이나 피부종양,12) 뇌종양,13) 사람의 진주종에서는8)9)14)15) EFGR의 과발현이 많이 알려져 있다. 정상 상피에 있어서는 EGFR의 발현이 기저상층에는 없으나 기저층에서 나타난다는 보고도 있고,14) 기저상층과 기저층에서 모두 발현이 없다는 보고도 있으나,9) Mongolian gerbil을 대상으로 한 본 연구에서는 진주종에서는 기저상층과 기저층 모두 강한 발현을 보였고 심부외이도 상피나 후이개 상피에서는 발현이 미미하였다. EGFR이 진주종의 세포 표면에 많이 분포함은 진주종 세포의 비정상적인 과증식의 원인중 중요한 하나가 될 가능성이 높을 것으로 생각되며, 심부외이도 상피와 후이개 상피에서의 미약한 발현은 사람에서의 보고와9)14) 같이 다양하게 나타날 수 있는 것으로 생각된다. PDGFR은 PDGF-α(170KD)와 PDGF-β(180KD)의 2종류로 PDGF와 결합하여 역시 수용체 내의 tyrosine kinase를 활성화시킨다. PDGF는 dimerized 단백질로 A chain과 B chain이 disulfide bond로 연결되어있으며, PDGF-AA, AB 그리고 BB의 3가지 isoform이 존재한다. 강력한 화학주성인자이며 또한 섬유아세포나 혈관내피세포 등에서 세포분열을 촉진시킨다. PDGFR-α는 3가지의 PDGF와 친화도가 매우 높으나, PDGFR-β는 PDGF-BB와만 강한 친화도를 보인다.5)16) 저자들은 PDGF와 결합한 이후 EGFR과 유사한 신호전달체계를 보이는 PDGFR의 발현을 실험적으로 유도한 진주종에서 관찰하였으나 PDGFR-α와 -β Western blotting과 면역조직화학염색에서 발현되지 않아서 PDGF에 의한 과증식 성향은 확인할 수 없었다.
Phospholipase C(PLC)는 1987년 Ryu 등에 의하여 돼지의 뇌에서 최초로 세종류의 isozyme이 분리되었고,17) 현재는 크게 β, γ, δ의 세가지 형태로 분류되며, 포유동물에서는 총10종이 알려져서 β 형태가 4종류, γ 형태가 2종류, δ 형태가 4종류이다. 이중 PLC-γ1은 제한적인 분포를 보이는 PLC-β나 -δ와는 달리 거의 모든 조직에서 어느 정도는 발현이 되는 것으로 알려져 있고, 선택적으로 성장 촉진인자의 신호를 전달하는 효소이다. PLC-γ1은 EGFR과 PDGFR이 각각 EGF와 PDGF와 결합하므로써 활성화되는 상피증식을 유도하는 가장 중요한 물질인 tyrosine kinase의 기질로 1989년 Meisenhelder 등에 의하여 이 과정이 첫 규명된 이래 배아의 발달과 여러 종양에서 많은 연구가 시행되어 왔다.11)18) 활성화된 PLC-γ1은 세포막의 인지질(Phospholipid)인 phosphatidylinositol 4,5-biphosphate(PIP 2)를 가수분해하여 세포질 내의 이차전달물질(second messenger 또는 mediator)인 inositol-(1,4,5) triphophate(PIP 3)와 diacylglycerol(DAG)을 생성하게 한다. PIP 3는 저장 Ca＋＋을 이동시켜 세포질 내의 Ca＋＋ 농도를 증가하게 하여 다음단계의 신호전달 분지들을 직접 활성화시키고 유전자전사의 과정에 관여하며, DAG는 protein kinase C의 활성화에 관여하여 세포의 성장과 증식, 분화, 세포의 이동, 타 수용체의 반응 강화 또는 억제, 종양화등에 관여하는 것으로 알려져 있다.4)5)19) 이외에도 PLC-γ1은 Ca＋＋과 protein kinase C의 존재하에 Na＋/H＋ exchanger의 활성화에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 유전자의 조작으로 PLC-γ1이 없는 세포에서 PIP 3와 DAG를 세포내에 투여한 경우에도 세포의 성장이 일어나지 않은 것이 보고되어, PLC-γ1은 이차전달물질을 형성하는 역할외에도 모든 세포분열과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각되어진다.20) 본 연구에서, 면역조직화학 염색에서는 진주종에서 기저상층과 기저층 모두 PLC-γ1의 발현이 강하게 관찰되었고, 심부외이도상피에서도 진주종 보다는 적지만 후이개상피보다는 훨씬 강한 발현을 관찰할 수 있었고, Western blotting에서도 역시 동일한 소견을 관찰할 수 있었다. 결국 PLC-γ1을 매개로 하여 과증식을 유발하는 기전이 진주종에 존재함을 확인할 수 있었고, 심부외이도상피는 정상 후이개상피와는 조금다르게 진주종으로 발전할 수 있는 가능성이 매우 높을 수 있다고 생각되었다. 본 연구 결과를 보면, Mongolian gerbil에서 유도한 진주종에서는 사람의 진주종과 유사하게 과다히 발현된 EGFR과 이와 관련된 신호전달물질인 PLC-γ을 이용하는 신호전달체계가 있음을 알 수 있었고, 또한 심부외이도상피에서도 PLC-γ1이 증가되어 있었다. 그러나 심부외이도상피에서는 EGFR의 발현이 저자들의 실험 전 예상보다 적었으며 Western blotting에서도 거의 발현되지를 않은 점으로 볼 때 EGFR과 PDGFR외 다른 성장인자의 수용체에 의한 PLC-γ1의 신호전달체계의 존재 가능성을 생각해 볼 수 있을 것으로 생각되며, 진주종에서도 일부에서 PLC-γ1이나 EGFR의 발현이 관찰되지 않은 점을 보면 다른 종류의 신호전달체계의 존재나 진주종의 진행 단계에 따른 차이도 고려해야 할 것으로 사료된다. 현재의 결과로 진주종의 광범위한 신호전달체계를 모두 설명할 수는 없으나 앞으로의 연구에 중요한 자료의 일부를 차지할 수 있을 것이라 믿으며, 신호전달체계를 이해하기 위해서는 신호전달물질로써 tyrosine kinase의 기질로 이용되는 다른 물질들에 대한 연구와 PLC-γ1 이후의 신호전달과정에 대한 연구, 그리고 antiphosphotyrosine 항체 등을 이용한 tyrosine phosphorylation의 정도에 대한 연구등이 병행되어야 할 것으로 생각된다. 또한 진주종의 형성 단계나 조직 파괴의 유무 등의 각기 다른 상황을 실험적으로 유도하면 한 단계 나아간 진주종의 과증식 및 과분화의 연구가 가능하리라고 사료된다.
결론
저자들의 Mongolian gerbil의 외이도 결찰을 통하여 실험적으로 유도한 진주종에서 Western blotting과 면역조직화학염색을 이용하여 EGFR과 PLC-γ1의 과발현을 확인하였고, 정상 심부외이도상피가 후이개상피에 비하여 비교적 강한 과증식 성향을 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 Mongolian gerbil이 사람의 진주종을 대신할 수 있는 적절한 실험 모델임을 다시 확인할 수 있었고, 향후 사람의 진주종과 동물실험을 통한 진주종의 신호전달체계에 대한 연구에 도움이 되리라고 생각된다.
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