Distribution and Origin of Nitrergic Innervation of the Canine Laryngeal Ventricle.

Kim, Hyung Tae; Cho, Seung Ho

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(5); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(5): 610-616.

Distribution and Origin of Nitrergic Innervation of the Canine Laryngeal Ventricle.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Catholic University of Korea, College of Medicine, Seoul, Korea. htkim@cmc.cuk.ac.kr

개후두실의 Nitrergic 신경분포와 기원

김형태 · 조승호

가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: 후두실ㆍNitric oxideㆍ상경신경절ㆍ교감신경절ㆍ후두내 신경절.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Recently, nitric oxide (NO) has been considered to be a neurotransmitter or a signaling molecule in a number of distinct subpopulation of neurons in the central and peripheral nervous systems. This study attempted to define the distribution patterns and quantitative participation according to the origin of nitrergic innervation in the canine laryngeal ventricles of eight adult dogs.
MATERIALS AND METHODS:
The nitrergic innervation in the intralaryngeal, superior cervical and nodose ganglion to the laryngeal ventricle were investigated by using double labelled neuronal NO synthase (nNOS) immunocytochemistry combined with a retrograde tracer, cholera toxin subunit B-conjugated horseradish peroxidase (CTB-HRP).
RESULTS:
NO is suggested to participate in parasympathetic, sympathetic and sensory innervation. Intralaryngeal ganglion is the main source of nitrergic innervation in the canine laryngeal ventricle. The proportions of the nitrergic innervation in the intralaryngeal ganglion, superior cervical ganglion, and nodose ganglion to the canine laryngeal ventricle were 63.1%, 37.7%, 4.9% respectively.
CONCLUSION:
NO originating from the intralaryngeal ganglion in a canine laryngeal ventricle may play an important role in controlling the laryngeal gland secretion and in regulating the blood flow by modulating the classical parasympathetic cholinergic neurotransmitter as like a neuronal messenger or comediator. NO also may participate in the same role through the sympathetic innervation of superior cervical ganglion: however, NO originating from intralaryngeal ganglion may play more important role than that from superior cervical ganglion. Many neurons of nodose ganglion have demonstrated to have nNOS, but might be less involved in the ventricular sensory innervation.

Keywords: Neuronal nitric oxide synthaseㆍLaryngeal ventricleㆍIntralaryngeal ganglionㆍSuperior cervical ganglionㆍNodose ganglion

서론 후두는 운동신경과 더불어 풍부한 감각신경과 자율신경계에 의하여 지배를 받으며, 교감신경계와 부교감신경계는 후두분비선과 혈관에 분포하여 후두분비물 및 혈류량을 조절한다. 또한 noradrenalin, acetylcholine, substance P(SP), calcitonin generelated peptide(CGRP), vasoactive intestinal polypeptide(VIP), enkephalin(ENK) 등 신경말단부위에서 분비되는 여러 신경물질과 신경펩타이드가 후두분비선의 분비조절에 작용하는 것으로 밝혀지고 있다.1)2) 최근에 후두내 자율신경계, 감각신경계 및 운동신경계의 일부 신경세포가 일산화질소(nitric oxide, NO)를 신경전달물질로 합성 이용하고 있음이 분자생물학적 및 면역세포화학법에 의하여 밝혀졌으며,3) 기니픽의 상기도에서는 NO가 부교감신경계의 콜린성 신경전달물질의 작용을 조절하는 신경조절물질로 알려졌다.4) 또한 후두선에서도 NO 합성신경섬유가 분포하는 것으로 밝혀져 후두선 분비기능에도 관여할 것으로 생각된다.5) 그러나 후두에서 NO 합성 신경섬유의 분포 및 그 기원과 지배작용기전에 관하여서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없는 실정이다. 따라서 후두실에 존재하는 NO 합성 신경섬유의 분포특성과 그 기원을 밝히고자 신경 역추적물질을 이용하여 후두내 신경절(intralaryngeal ganglion), 상경신경절(superior cervical ganglion) 및 결절신경절(nodose ganglion)에서 후두실 지배 신경세포를 확인하고, NO의 합성효소인 nitric oxide synthase(NOS)에 대한 항체를 이용한 이중표지 면역세포화학법을 시행하여, 후두실을 지배하는 신경세포가 이용하고 있는 신경전달물질이 NO인지를 확인함으로써 후두에 대한 신경조절기전의 일단을 밝히고자 하였다. 재료 및 방법 실험동물 및 표본제작 육안적으로 정상 후두를 갖고 있는 체중이 약 8∼10 kg의 잡종개 8마리를 암수 구별없이 사용하였다. Ketamin(유한양행, 서울) 50 mg/kg 근육주사와 thiopental(대한약품, 서울) 25 mg/kg 정맥주사를 혼용하여 개를 마취하였다. 경부에 중심성 절개를 가한 후 흉골설골근과 흉골갑상근을 박리하여 양측으로 견인하고 갑상연골과 윤상연골을 노출시킨 후 갑상연골의 정중부를 절개하여 후두내강을 노출시켰다. 5 μl Hamilton syringe를 이용하여 1% cholera toxin B-horseradish peroxidase(CTB-HRP, C4672, Sigma-Aldrich INC., St. Louis, MO, USA) 3∼5 μl를 우측 후두실 소낭(saccule) 점막 아래에 주입한 후 갑상연골과 주위 근육 및 피부를 봉합하여 격리 사육하였다. 주입후 48∼72 시간이 지난 후 전술한 방법으로 전신마취를 시킨 다음 좌심실을 통해 4% paraformaldehyde-0.2% picric acid in 0.1 M phosphate buffer(PB)로 관류 고정하였다. 관류 고정 후 후두와 양측 상경신경절 및 결절신경절을 추출하여 동일한 고정액에 6시간동안 고정한 다음 동결에 의한 세포손상을 방지하기 위하여 30% 자당 첨가 인산 완충용액에 하루동안 세정하였다. 각 조직은 OCT compound(Tissue-Tek 4583, Sakura Finetechnical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 포매, 동결시킨 후 동결 미세절단기를 이용하여 20 μm의 연속 동결절편을 작성한 다음 Probeon Plus microscope slide(15-188-52, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 부착시켜 -70℃에 냉동 보관하였다. 우측 후두와 상경신경절 및 결절신경절의 동결절편을 본 실험에 이용하였으며, 좌측 표본은 대조군으로 이용하여 신경 역추적자가 존재하지 않음을 관찰함으로써, 우측 후두실에 추적자가 올바르게 주입되었음을 확인하였다. CTB-HRP에 대한 세포화학법 동결절편에서 추적자의 위치를 확인하기 위하여 냉동 보관된 동결절편을 상온에서 1시간 동안 건조시킨 후 재함수화 과정을 거쳐 흐르는 물에 10분간 세척한 후 0.05% 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride-0.03% H2O2 in Tris buffer, pH 7.6 혼합액으로 발색하였다. 발색의 정도는 광학현미경하에서 관찰하였으며 발색이 완료되면 즉시 Tris buffer(pH 7.6)에 담구어 반응을 종료하였다. 각 조직절편은 흐르는 물에 20분간 담구어 세척한 후 nNOS에 대한 이중 표지 면역세포형광법을 시행하였다. nNOS에 대한 이중표지 면역세포형광법 CTB-HRP에 대한 세포화학법으로 염색된 표본을 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum, 1：10 dilution in PBS)에서 1시간 동안 반응시킨 후 일차항체로서 rabbit anti-nNOS antiserum(1：1,000, 47H4813, Sigma-Ald-rich INC., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이차항체로서 Cy3-conjugated AffiniPure F(ab') 2 fragment of goat anti-rabbit IgG(1：600, Jackson ImmunoResearch Lab. INC., West Gro-ve, PA, USA)에 2시간 동안 반응시킨 후 인산완충용액으로 세척한 후 glycerin-gelatine으로 봉입하였다. 동일시야에서 형광현미경과 광학현미경이 함께 관찰 가능한 Olympus BX50(Olympus Optical Co, LTD. Ja-pan) 현미경을 이용하여 각각의 조직절편에서 nNOS 와 CTB-HRP를 모두 함유하는 이중표지된 신경세포를 관찰하였다. nNOS 함유 신경세포의 기원에 따른 후두실내 분포 비율의 정량적 분석 후두실에 분포하는 신경섬유 중 nitrergic 신경지배의 정도를 정량적으로 확인하기 위하여, 후두내 신경절과 상경신경절 및 결절신경절의 각각의 조직절편에서 신경 역추적자가 표지된 신경세포들 중에서 nNOS를 함유한 이중표지된 세포의 수를 비율로 환산하였다. 각각의 신경절에서 한 개의 조직절편마다 200배 시야 5곳을 정하여 먼저 광학현미경하에서 신경 역추적자가 함유된 세포를 관찰하고 계측한 후 동일시야의 형광현미경하에서 신경 역추적자와 nNOS가 이중표지된 신경세포를 계측하여, 각 신경절에서 후두실에 분포하는 신경섬유 중 NO를 합성 이용하는 신경섬유의 분포비율과 지배하는 정도를 정량화하였다. 각 신경절 간에 NO 합성신경섬유의 분포비율 차이에 대한 통계학적인 유의성은 SAS 프로그램을 이용한 ANOVA로 자료 분석 후 Scheffe's test로 검정하였으며, 유의수준은 5% 미만으로 하였다. 결과 후두실내 CTB-HRP와 nNOS가 이중 표지된 신경세포의 분포와 비율 후두실에서 nNOS 함유 신경세포는 주로 점막하선 주위와 점막하 고유층에서 관찰되었으며, 특히 일부 표본에서는 가성대(false vocal fold)와 후두실 점막하부위에 축삭염주(vari-cosites)를 형성하면서 분포하는 것을 관찰할 수 있었다. 점막하선 일부에서 nNOS 면역반응 신경섬유가 관찰되었으며, 갈색 반점으로 표시되는 신경 역추적자를 함유하고 nNOS에 이중표지되는 신경세포도 관찰 가능하였다. 그러나 이들의 분포가 일정한 양상을 보이지는 않았으며 8마리 중 4마리의 조직표본에서 후두실 첨부에 위치한 점막하선 주위에 이중표지된 nNOS 함유 신경세포가 군집을 형성하며 분포되어 있었으나, 다른 점막하선에서는 군집형성을 관찰할 수 없었다(Fig. 1). 또한 동일 개체에서도 일부 표본에서만 혈관주위에 이중표지된 nNOS 함유 신경세포가 관찰되기도 하였다(Fig. 2). 후두실내 점막하 고유층에서는 신경 역추적자를 함유하는 다수의 후두내 신경절을 8마리 모두에서 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 특히 이들의 분포는 후두실의 점막하 고유층과 갑상연골과 후두내근사이의 결합조직내에서 주로 관찰되었다. 후두내 신경절은 대부분이 신경 역추적자를 함유하고 있었으며, 200배 시야의 광학현미경하에서 CTB-HRP를 함유한 신경세포수는 평균 13.0±6.6개였으며, 이들 중 nNOS로 이중표지된 신경세포의 비율은 평균 63.1±10.2%였다(Table 1 and 2). 상경신경절내 CTB-HRP와 nNOS가 이중 표지된 신경세포의 분포와 비율 상경신경절에서는 평균 21.6±10.4개의 nNOS 함유 신경세포가 관찰되었으며 이들은 일정한 분포구역이 없이 전반적으로 산재되어 있었고 어떤 규칙성이나 분포 특성은 발견할 수 없었다(Table 1, Fig. 4). 상경신경절내 신경 역추적자를 함유한 신경세포 중 평균 37.7±11.6%가 nNOS를 함유하고 있는 이중표지 신경절세포였으며(Table 2), 이들의 분포 또한 규칙성을 찾아볼 수 없이 산재되어 있었다. 결절신경절내 CTB-HRP와 nNOS가 이중 표지된 신경세포의 분포와 비율 결절신경절내에서의 CTB-HRP 함유 신경세포는 평균 18.2±4.5개였고 nNOS 함유 신경세포는 평균 19.1±6.6개였으며(Table 1), nitrergic 신경세포의 경우 신경절의 중앙부위 보다는 문외측(rostral-lateral) 부위에 주로 분포하였다. 동일개체에서도 일부 표본에서만 신경 역추적자 함유신경세포 중 nNOS를 함유하는 이중표지 신경절 세포(4.9±0.8%)를 관찰할 수 있었다(Table 2, Fig. 5). 고찰 후두는 발성, 호흡 및 보호 기능의 주된 3가지 생리적 기능을 갖는다. 이러한 후두의 기능은 자율신경계, 감각신경계와 운동신경계가 서로 혼합된 다양한 신경작용에 의하여 이루어진다. 특히 발성기능과 관련하여 후두분비물은 자율신경계와 감각신경계의 상호작용에 의하여 최적의 분비량과 점액성분 함량이 조절되어 윤활, 함습 및 냉각작용에 기여한다.6) 최근 후두내 자율신경계의 기능 중 후두분비선의 분비물과 후두내 혈류량을 조절하는 부교감신경과 교감신경의 이원화된 작용기전과 VIP, ENK, peptide histi-dine isoleucine(PHI), peptide histidine methionine(PHM), SP, CGRP, neurokinins A and B, neuropeptide Y(NPY), galanin, gastrin-releasing peptide 등과 같은 신경펩타이드에 의한 후두선 신경분포가 밝혀지고 있다. 또한 NO가 자율신경계의 새로운 신경전달물질과 전령물질(messenger molecule)로서 후두내에 분포하는 신경섬유에서 이용되고 있음이 알려졌다.7)8) NO는 무기 기체 유리기로서 NOS를 이용하여 아미노산, L-arginine로부터 citrullin과 함께 생성된다. NO는 현재 중추신경계와 말초신경계에서 신경전달물질 혹은 신호전달물질로 생각되며, 신경전달물질의 분비를 조절하고 신경계의 morphogenesis와 synaptic plasticity 및 유전자발현을 조절하는데 결정적인 역할을 담당하는 것으로 여겨지고 있다.3)9) 또한 생체내 여러기관에서 혈관이완물질로도 작용하며, 과도하게 생성시 주된 신경 독성효과를 나타내기도 한다.10) NO는 매우 불안정하고 반응성이 강하여 형성된 후 신경섬유 내에 존재하지 않고 수초내에 사라지므로 NO를 직접 조직내에서 증명하는 것은 불가능하다. 그러므로 간접적인 방법으로 NO의 합성효소인 NOS를 증명하므로써 존재를 확인할 수 있다. NO의 합성조절에 중요한 NOS는 구성성(constitutive) NOS와 유발성(inducible) NOS로 구분될 수 있다. 구성성 NOS에는 neuronal NOS(nNOS or bNOS)와 endothelial NOS(eNOS)가 있으며 이들은 칼슘이 유입되어 활성화된다. 반면에 유발성 NOS에는 대식세포(macrophage) NOS(mNOS)가 있으며, 면역자극 후에 대식세포내에 새로운 NOS 단백질의 합성이 증가되며, 한번 대식세포에서 NOS가 유발되면 상당기간 동안 다량의 NO를 생산하게 된다.11) 후두내 분포하는 NO 함유신경섬유의 기원을 확인하고 신경섬유의 생리적 기능과 그 분포 비율을 간접적으로 확인하기 위하여서는 신경역추적물질을 이용하여야 하며, HRP, wheat germ agglutini-HRP, True Blue, fluorescent-labelled latex microspheres, lectin에 결합시킨 colloidal gold particles, CTB, CTB-HRP, CTB-gold 등이 이용되고 있다.12) 이중 HRP에 결합시킨 CTB-HRP는 매우 민감한 역추적자로서, 역행적으로만 이동되어 신경세포체의 말단 수지상 돌기에서 강하게 검출되며, 소량만 사용하여도 되고 신경에 장시간 머물러 있으며 면역염색을 통하여서 광학현미경과 전자현미경 모두에 잘 관찰되는 장점을 가지고 있다.13-15) 본 연구에서도 CTB-HRP를 이용하여, 부교감신경계의 신경세포체로 구성된 후두내 신경절과 교감신경계의 주된 기원인 상경신경절, 그리고 감각신경계의 주된 기원인 결절신경절에서 후두실로부터 이동된 신경 역추적자가 위치하는 신경세포체를 관찰하여 후두실내에 분포하는 신경섬유의 기원을 확인하였으며, 이들 신경세포체안에서 nNOS의 존재를 확인하므로서 NO를 이용하는 신경섬유의 후두실내 신경지배기능과 분포비율을 확인할 수 있었다. 쥐와 개의 후두에 분포하는 NO 함유신경섬유는 비아드레날린성 비콜린성 신경섬유(non-adrenergic non-cholinergic innervation, NANC)로서 다양한 곳에서 관찰되며, 후두내 상피와 근육 및 분비선에 분포하고 있는 것이 증명되었다.5)8)16) 이들은 종(species)에 따라 분포양상에 상당한 차이를 보이며, 동일 개체에서도 후두조직에 대한 NO 함유신경분포는 일정하지 않다. 일반적으로 점막하선에 대한 NO 함유신경섬유의 분포는 쥐의 비 점막하선에는 매우 풍부하게 분포되나 사람과 쥐의 폐, 쥐의 요도관이나 위장관 안에 존재하는 점막하선에서는 거의 발견되지 않는다.17) 후두분비선에서 NO 함유신경은 모든 후두선에 분포하지 않으며, 부분적으로 존재만 확인되고 있다.5) 이러한 부분적 분포는 후두선 중 장액세포와 점액세포에 대한 신경분포의 이원성이 관여할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 CTB-HRP가 표지되는 신경세포체가 일부 후두 점막하 선세포주위에 분포되고 있었으며 이들은 일부 표본에서 군집을 형성하고 있는 것이 관찰되기도 하였다. 군집을 형성하는 신경세포군은 후두점막하선 주위에 분포되는 후두내 신경절일 것으로 생각되며 이 중 일부의 신경세포가 NO를 합성 이용하고 있었다. 신경절을 형성하지 않고 있는 이중표지된 nNOS 합성신경세포들은 점막하선 이외에도 혈관주위와 후두실 간질조직에서 일부 관찰되었다. 이러한 결과로 NO가 후두선의 외분비기능과 혈류량을 조절하는 자율신경계의 기능을 담당할 것으로 생각된다. 후두내 신경절에 대한 연구에서 Domeij 등18)은 쥐의 후두내 신경절 신경세포는 모두 acetylcholinesterase가 양성으로 콜린계 부교감 신경절임을 확인하였으며, 또한 Hisa 등5)이 개의 후두내 신경절 및 후두선에 분포하는 NANC 신경펩타이드 연구에서 혈관운동성 신경펩타이드인 VIP와 CGRP가 신경섬유와 신경세포체안에 nNOS와 같이 공존하고 있음을 보고하였다. 이러한 보고는 NO가 VIP와 공존하여 콜린성 신경전달물질의 내부조절자 로서 작용하여 VIP에 의한 콜린성 혈관확장기능의 신경성 보조매개체(neuronal comediator)로서 작용하고, CGRP와 공존하여 NANC 신경섬유로서 감각신경계에 관여함을 시사한다. 그러나 후두내 신경절 이외에 후두선과 혈관주위에 개별적으로 존재하는 nNOS 함유 신경세포체가 후두내에 존재하는 부교감신경계의 신경절세포에 속하는지 아니면 장과 인두에 존재하는 장신경계(enteric nervous system)와 같은 자율신경계의 제3분지로서, 중추신경계의 신경절전 신경세포에서 직접 신호를 받지 않는 콜린계도 아닌 신경세포 인지를 밝히기 위하여서는 많은 연구가 필요하리라 생각된다. 본 실험에서 자율신경계 중 부교감신경계에 작용하는 NO 합성 신경세포의 후두실내 지배양상은 후두실로부터 신경 역추적자에 의하여 표지되는 후두내 신경절의 신경원 중에서 nNOS 함유신경원의 비율이 평균 63.1%로서 상당 부분에서 NO가 부교감신경계에 작용하는 것을 알 수 있다. 또한 후두내 신경절의 신경원은 중추신경계와는 달리 NO가 직접 신경 전달물질로 작용하지 않고 신경전달물질의 내부조절자와 신경펩타이드의 신경성 보조매개체로서의 역할을 담당할 것으로 생각된다. 교감신경지배와 관련하여 NO는 종(species)에 따라 분명한 차이를 나타낸다. 개에서는 후두내 교감신경섬유의 주된 기원이 되는 상경신경절에서 nNOS 함유 신경원이 다수 분포되고 있으나 쥐의 상경신경절에서는 nNOS 함유신경원을 발견할 수 없어 쥐 후두에 분포되는 교감신경계에서는 NO가 관여하지 않는 것을 알 수 있다.19) 본 실험에서는 상경신경절에서 신경 역추적자를 함유한 신경원 중 nNOS에 이중 표지되는 비율은 평균 37.7%로 나타났다. 이 결과는 신경 역추적자가 후두실에만 주입되어 후두실에 대한 교감신경계에 국한된 것이나 후두실에 점막하선이 매우 풍부하게 분포되어 있으므로 후두분비기능과 관련된 교감신경계의 신경학적 조절기능에서 NO가 관여하는 비율을 나타내는 것이라 생각된다. 감각신경계에서는 CGRP와 SP가 후두의 원심성신경계의 주된 신경 전달물질로 생각되고 있다.6)20) 또한 결절신경절에서 약 81.5%가 CGRP를 갖는 신경섬유로 후두내 분포되는 것이 보고되었으며,1) 후두의 주된 감각신경절이 결절신경절임을 확인할 수 있다. 결절신경절에서 CGRP와 nNOS가 서로 공존하는 CGRP양성인 nitrergic 신경세포체가 상당수 분포되고 있음이 증명되었으며, CGRP양성인 nitrergic 신경섬유는 억제성 NANC 신경섬유로 여겨지고 있다.5) 본 연구에서 결절신경절내에 상당수의 nNOS 함유신경원이 존재하고 주로 문외측에 분포되어 있었고, 다수의 신경세포가 신경 역추적자를 함유하고 있었지만, 이들 중 nNOS에 이중 표지되는 신경세포 비율은 평균 4.9%로서 후두실에 분포되는 감각신경계의 원심성 신경섬유에 NO가 관여하는 것은 매우 미약한 것을 알 수 있었다. 그러므로 NO가 작용하는 후두 감각신경섬유는 대부분이 후두실을 제외한 후두의 다른 부분에서 감각신경계의 억제성 NANC 신경섬유로 작용할 것으로 생각된다. 결론 NO는 개의 후두실에서 자율신경계의 부교감신경과 교감신경 및 감각 신경계에 모두 관여하며, NO 합성신경섬유의 기원은 각각 후두내 신경절과 상경신경절, 그리고 결절신경절로서 이들 신경절에서 후두실내 분포하는 신경원 중 NO를 합성 이용하는 신경원이 차지하는 비율은 평균적으로 후두내 신경절에서 63.1%, 상경신경절에서 37.7%, 그리고 결절신경절에서는 4.9%였다. NO 합성신경섬유의 기원에 따른 분포비율의 특성에 의하여, 후두내 신경절에서 기원하는 NO는 부교감신경계의 신경전달물질인 아세틸콜린의 분비를 조절하는 신호전달물질과 전령물질로써 후두선과 혈관에 분포하여 후두 분비기능과 후두내 혈류량을 조절하는 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다. 교감신경계인 상경신경절에서 기원하는 NO도 후두 분비기능과 혈류량을 조절할 것으로 생각되나 후두실내에서는 상경신경절을 기원으로하는 교감신경섬유보다 후두내 신경절을 기원으로 하는 부교감 신경섬유에서 NO가 더 많이 작용할 것으로 생각된다. 후두내 감각 신경의 기원이 되는 결절신경절의 많은 신경세포가 후두실에 분포하고, NO를 합성 이용하고 있으나 NO가 후두실내 감각신경계에 작용하는 비율은 매우 미약하였으며, 주로 후두실이외의 다른 후두 부분에 분포되어 신경 조절자로서 억제성 NANC 신경섬유에 작용하리라 생각된다.
REFERENCES
1) Kawasoe M, Shin T, Sadahiko M. Distribution of neuropeptide-like immunoreactive nerve fibers in the canine larynx. Otolaryngol Head Neck Surg 1990;103:957-62. 2) Hisa Y, Uno T, Tadaki N, Murakami Y, Okamura H, Ibata Y. Distribution of calcitonin generelated peptide nerve fibers in the canine larynx. Eur Arch Otorhinolaryngol 1992;249:52-5. 3) Dawson TM, Dawson VL. Nitric oxide: Actions and pathological roles. Neuroscientist 1995;1:9-19. 4) Belvisi MG, Stretton D, Barnes PJ. Nitric oxide as an endogenous modulator of cholinergic neurotransmission in guinea pig airways. Eur J Pharmacol 1991;198:219-21. 5) Hisa Y, Uno T, Tadaki N, Koike S, Banba H, Tanaka M, et al. Relationship of neuropeptides to nitrergic innervation of the canine laryngeal glands. Regul Peptides 1996;66:197-201. 6) Hauser-Kronberger C, Albegger K, Saria A, Hacker GW. Regulatory peptides in the human larynx and recurrent nerves. Acta Otolaryngol (Stockh) 1993;113:409-13. 7) Lownstein CJ, Dinerman JL, Snyder SH. Nitric oxide: A physiologic messenger. Ann Intern Med 1994;120:227-37. 8) Hisa Y, Tadaki N, Uno T, Koike S, Tanaka M, Okamura H, et al. Nitrergic innervation of the rat larynx measured by nitric oxide synthase immunohistochemistry and NADPH-diaphorase histochemistry. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996b;105:550-4. 9) Schmidt HHHW, Lohmann SM, Walter U. The nitric oxide and cGMP signal transduction system: Regulation and mechanism of action. Biochem Biophys Acta 1993;1178:153-75. 10) Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991;43:109-42. 11) Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J 1994;298:249-58. 12) Liu H, Llewellyn-Smith IJ, Basbaum AI. Co-injection of wheat germ agglutinin- HRP and choleragenoid-HRP into the sciatic nerve of the rat blocks transganglionic transport. J Histochem Cytochem 1995;43:489-95. 13) Llewellyn-Smith IJ, Minson JB, Wright AP, Hodgson AJ. Cholera toxin B-gold, a retrograde tracer that can be used in light and electron microscopic immunocytochemical studies. J Comp Neurol 1990;294:179-91. 14) Buller KM, Bolter CP. The localization of sympathetic and vagal neurons innervating the carotid sinus in the rabbit. J Auton Nerv Syst 1993;44:225-31. 15) Counter SA, Aldskogius H, Borg E. Cholera toxin B-HRP and wheat germ agglutinin-HRP tracing of tensor tympani muscle motorneurons and processes in rabbits. Acta Otolaryngol (Stockh) 1993;113:43-7. 16) Grozdanovic Z, Baumgarten HG, Bruning G. Histochemistry of NADPH-Diaphorase, a marker for neuronal nitric oxide synthase, in the periph-eral autonomic nervous system of the mouse. Neuroscience 1992;48:225-35. 17) Alm P, Larsson B, Ekblad E, Sundler F and Andersson KE. Immunohistochemical localization of peripheral nitric oxide synthase containing nerves using antibodies raised against synthesized C- and N-terminal fragments of a cloned enzyme from rat brain. Acta Physiol Scan 1993;148:421-9. 18) Demeij S, Dalqvist A, Forsgren S. Enkephalin-like immunoreactivity in ganglionic cells in the larynx and superior cervical ganglion of the rat. Regul Peptides 1991;32:95-107. 19) Morris R, Southam E, Braid DJ, Garthwaite J. Nitric oxide may act as a messenger between dorsal root ganglion neurons and their satellite cells. Neurosci Lett 1992;137:29-32. 20) Massari VJ, Johnson TA, Gillis RA, Gatti PJ. What are the roles of substance P and neurokinin-1 receptors in the control of negative chronotropic or negative dromotropic vagal motoneurons? A physiological and ultrastructural analysis. Brain Res 1996；715：197-207.