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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(5): 582-586. |
| Isolation and Characterization of Primary Human Nasal Submucosal Gland Cell Culture. |
| Woo Jeong Kim, Ji Hoon Park, Seung Hoon Han, Sang Hag Lee |
| Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. sanghag@ns.kumc.or.kr |
| 인체 비점막에서 분리한 분비선세포의 배양 |
| 김우정 · 박지훈 · 한승훈 · 이상학 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
분비선세포ㆍ분리ㆍ배양. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND:
All tissue components in the nasal mucosa, including the epithelium, goblet cells, excretory glands, and blood capillaries participate in nasal secretory response. In vivo studies have suggested that, of these components, submucosal glands are thought to play an important role in nasal mucus secretion. These studies, however, are limited in dealing with pure secretory activity of submucosal glands. Therefore, in vitro study using cultured nasal submucosal glands is required to evaluate the pathophysiological mechanisms of nasal mucus secretion. The present study draws on experience obtained from the culture of human submucosal glands isolated from nasal mucosa.
MATERIALS AND METHODS:
To obtain isolated submucosal gland cells, the uncinate process mucosa was stripped of surface epithelum by stroking the luminal surface with cotton tip applicator and minced into small fragments. By enzymatic treatment, thereafter, the submucosal gland cells were isolated and plated on culture flasks containing media.
Using millipore inserts and cover slide, culuted cell was stained AB-PAS to identify that confluent monolayer cells were submucosal gland cell.
RESULTS:
The uncinate process mucosa were appropriate for the isolation of submucosal gland cell. An average of 1.2X106 cells were obtained in every preparation of cells.
The exclusion ratio of trypan blue was 95%. The isolated cells were strongly stained in AB-PAS, suggesting that cells are of glandular origin. Plated gland cell formed colony on the 3rd day and became confluent after 5-7 days. The proportion of the stained cells to the total cells decreased depending the duration of cell culture.
CONCLUSION:
We succeeded in isolation and culture of submucosal gland cells which can provide model systems for studying the mechanisms of nasal glandular cell secretion in vivo. |
| Keywords:
IsolationㆍCultureㆍSubmucosal gland |
서론
비루는 코점막으로부터 분비되어 외부로부터 비강내로 유입되는 여러가지 자극물질들을 여과하여 제거하거나, 흡입공기의 습도를 조절하고, 비점막의 방어기능에 중요한 역할을 하며, 점액당단백질, 락토페린, 리소자임, 알부민, 면역글로불린 등과 수분으로 구성되어있다.1)2) 알레르기 및 만성비부비동염 등과 같은 비점막의 만성염증시에는 그 분비가 증가된다.
비루는 비점막을 구성하는 구조물 중 분비선에서 분비되는 점액성분이 주된 성분이며 이것은 배세포와 점막하선세포에서 분비되고 이 두가지 세포 중에서 특히 점막하선세포가 주된 역할을 하고있다.3)4) 비분비물의 분비기전을 포함한 여러가지 분비선세포에 관한 기초적 연구는 비분비물의 채취를 통한 직접적인 연구,5)6) 면역조직화학7) 그리고 자가방사선학적 분석8) 등과 같은 여러 방법이 그동안 시도되어왔다. 그러나 비점막은 다양한 세포로 구성되어 있고, 이들 세포간 상호작용으로 비분비물의 특성이 혼합되어 나타나기 때문에 분비선세포의 반응 결과를 파악하기 힘든 문제점이 있어 세포배양을 통한 in vitro하에서 단일세포의 분비양상 및 그 반응에 대한 연구가 필요하다.
지금까지 알려진 비강의 점막하선세포의 배양은 비용조직에서 얻은 세포이거나,3) 조직편유출배양법(explant out-growth culture)9)으로 시행한 것이 유일하다. 이러한 방법은 순수한 정상 인체비점막하 분비선세포를 배양하여 연구재료로 사용하는 것보다는 많은 단점이 있다고 생각된다. 따라서 저자들은 정상 인체 비점막에서 비점막하 선세포의 분리와 일차배양을 시도하고, 이를 통해 일차배양된 분비선세포의 특성을 파악하고자 하였다.
재료 및 방법
비점막 채취 및 분비선세포분리
비부비동염이 없이 단순한 코막힘을 주소로 내원한 환자에서 환자의 동의하에 비중격 수술시 얻은 구상돌기점막을 이용하였다. Culp 등의 세포분리방법10)을 변형하여 비점막의 분비선세포를 분리하였다. 수술시 채취한 구상돌기점막을 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS) 속에 넣은 후 점액과 혈흔 등을 제거하고 면봉을 사용하여 상피세포를 제거하였다. 그 다음 점막편을 가위로 1 mm 2 이하가 되게 잘게 잘랐다. 각각 자른 조직들을 Penicillin G(100 U/ml, Sigma, St. Louis), Streptomycin sulfate(100 ug/ml, Sigma), Amphotericin B(2.5 ug/ml, Sigma), Protease type XV(1 mg/ml, Sigma)를 넣은 Dulb-ecco's modified Eagle's medium(DMEM)：Ham's F12 (1：1) 용액으로 옮긴 후 Orbital shaker에서 160 rpm의 속도로 20분간 천천히 흔든 다음 원심분리를 하여(150 g, 5분) 상층액을 제거하였다. 침전물을 Collagenase type Ⅱ (500 U/ml, Sigma), Elastase type Ⅲ(8 U/ml, Sigma), Hyaluronidase(200 U/ml, Sigma)를 각각 혼합한 DM-EM：F12(1：1) 용액에 넣어 다시 15분간 흔들었다. 그 다음 원심분리(150 g, 5분)하여 상층액을 버리고 침전물을 다시 1% EDTA를 넣은 DMEM：F12 용액에 넣어 20분간 orbital shaker에서 160 rpm으로 천천히 흔든 후 단일세포의 분리를 증가시키기 위해 Pasteur pipetting을 수차례 하였다. 다시 원심분리(50 g, 1분)하여 침전물을 제거하고 상층액속에 부유하는 분리된 세포를 얻었다.
분리된 세포는 그 활성도를 측정하기 위해 세포부유액 100 ul에 생리식염수와 섞어 만든 0.2% trypan blue 200 ul를 첨가하여 15분간 반응시켰다. Hemocytometer에 이 용액을 떨어뜨리고, 염색되지 않는 세포의 수를 세어 염색된 세포와의 그 비율을 구하였다. 또한 채취한 비점막에서 분리된 세포가 분비선 세포인지를 확인하기 위하여 분리된 세포를 4% 파라포름알데히드에 고정 후, periodic acid 1% 용액에서 5분간 산화시키고, Schiff 용액으로 5분간 처리하여 PAS 염색을 실시하였다.
분리된 세포는 다시 원심분리(200 g, 5분)하여 침전된 세포를 얻어 배양액에 넣었다.
분리된 분비선세포의 배양
Merten의 방법11)에 따라 다음과 같이 제작한 collagen 도말 배양용기에 분비선세포를 배양하였다. Collagen type Ⅰ(from calf skin, Sigma)을 증류수와 혼합하여 0.25 mg/cm2의 농도로 배양용기에 도말하고 실온에서 자연 건조시킨 후 DPBS로 세차례 씻어내고 배양액을 넣었다. 배양액은 DMEM：F12(1：1) 용액에 fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL life Technologies Inc., Grand Island, NY) 10 %, retinoic acid 0.1 uM(Sigma), insulin 10 ug/ml(Sigma), corticosteroid 0.5 ug/ml(Sigma), gentamicin 50 ug/ml(Sigma), cholera toxin 20 ng/ml(Sigma)을 첨가하였다. 또한 세포의 성장을 촉진하기 위해 EGF 25 ng/ml(Sigma), endothelial cell growth supplement 7.5 ug/ml(Sigma), triidothyronine 20 ng/ml(Sigma), transferrin 5 ug/ml(Sigma)을 첨가하였다. 배양액은 48시간 후 세포가 배양용기의 바닥에 붙은 후 배양액을 바꾸어 주었고, 그 후 2∼3일에 한 번씩 배지를 교환하였다.
배양된 세포는 위상차 현미경으로 매일 변화를 관찰하였고, 배양된 세포가 분비선세포임을 확인하기 위해 colony를 형성한 후 융합된 세포를 0.05% trypsin과 0.02% EDTA를 37℃에서 3분간 처치하여 떨어진 세포를 0.4 um millicell inserts(Transwell, Corning, Cambridge, NK) 혹은 collagen으로 도말한 coverslips(Nunc Thermamox(r))에서 배양하였다. Millicell inserts 혹은 coverslips 위에서 배양된 일차배양세포를 2일, 4일, 6일에 Alcian blue-Periodic acid Schiff(AB-PAS) 염색을 하여 변화를 관찰하였다. PBS로 수차례 세척한 후, 4% paraformaldehyde에 1시간 고정하고, 0.05% Triton-X 100으로 30분 처리하였다. 그 후 Alcian blue(pH 2.5)에 30분간 염색하고, 1% Periodic acid에 5분, Schiff 용액에 10분간 처리하였다. 그 다음 탈수과정을 거친 후 봉입하여 관찰하였다.
결과
비점막으로부터 분리된 분비선세포
세포분리과정을 통해 얻은 세포의 수는 hemocytometer로 측정한 결과 1.2(±0.3)×10 6이었으며, 이들 세포의 활성도는 95% 이상이었다. 분리된 세포들은 PAS 염색에서 강하게 염색되는 분비과립을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
배양된 분비선세포
Collagen으로 도말한 배양용기에서 배양된 세포는 배양 2일 후 용기에 달라붙었고, 3일에 군집을 이루었고, 배양 5일에 아융합, 7일에 융합을 이루었다(Fig. 2. A, B and C). 세포의 모양은 난원형에서 다각형의 모양으로 뚜렷한 핵을 관찰할 수 있었다. AB-PAS 염색에서 청색, 자주색 등으로 염색되는 과립을 함유하는 세포가 관찰되었고, 이 세포들은 2일, 4일, 6일째 시간이 경과함에 따라 염색되는 세포의 비율이 줄어듬을 관찰할 수 있었다(Fig. 3. A, B and C).
고안
최근 각각의 세포의 고유한 특성을 알기 위해 세포배양법이 발달하면서 다양한 종류의 세포들의 증식이나 분화, 냉동보관을 통한 장기간의 저장법 등이 알려져 왔다.3)4)10)11) 그러나 선세포는 조직으로부터 분리하기가 어려워 단일세포를 배양하는데 문제점이 있으며,4) 배양과정에서 그 반응양상이 변하기 쉬워 선세포의 분리 및 배양이 제한되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 인체 정상비점막에서도 선세포의 분리가 가능하며 분리된 선세포를 배양하는 것이 가능하다는 것을 나타내었다.
선세포의 분리는 토끼의 위점막에서 선세포의 분리가 시도되었고,12) 소, 고양이,10) 개13) 등의 동물의 기관점막에서 분리되어 실험에 이용되어 왔다. 특히 여러 실험동물의 기관점막에는 선세포가 풍부하며 점막이 얇기 때문에 상피층을 제거하면 상피층 직하부에 분비선세포가 분포되어 있어 효소처리를 하여 분리된 여러가지 세포 중 분비선세포가 차지하는 비율이 높아 주로 기관지 점막에서 채취한 분비선세포를 배양에 이용하여왔다.10)14) 비점막에서 시도된 분비선세포의 분리는 흰쥐와 기니픽 등의 실험동물에서 주로 시도되었는데,15) 주로 비중격점막을 채취함으로써 시도되어왔다. 이는 비중격점막의 상피층 직하부에 분비선이 고밀도로 존재하며15) 분비선간질이 적어 다른 세포가 혼합되지 않고 분리하기가 쉽기 때문이었다. 인체의 정상비점막에서 분비선세포를 분리하여 배양을 시도한 연구는 거의 미흡한 실정이었으나, 최근 인체의 비점막에서 채취한 분비선세포의 일차배양이 시도되었다.3)9) 그러나 비점막 분비선세포배양은 비용조직에서 시도되거나,3) 조직편유출배양을 통한 세포배양이 이루어졌었다.9) 저자들은 세포분리를 위하여 적합한 비점막조직을 찾기 위해 하비갑개와 구상돌기에서 비점막을 얻어 세포분리를 시도했다. 하비갑개의 점막은 비교적 두껍고 선세포층과 상피세포층과의 간격이 클 뿐만 아니라 또한 분비선세포 사이의 간격도 크고 섬유아세포가 상대적으로 많아 세포분리에 적당하지 않다고 생각되었다. 그러나 정상인의 경우 사골동 점막은 채취하는 것이 어려운 반면 구상돌기의 점막은 외부로 노출되어 있어 비중격교정술을 하면서 비교적 용이하게 얻을 수 있어 본 연구에서는 구상돌기에 위치한 점막을 이용하였다. 이 부위의 선세포는 점막표층과 가까이 위치하여 상피층을 물리적으로 제거하면 섬유아세포를 포함한 다른 세포를 비교적 적게 함유하게 되고, 선세포의 밀도도 충분하였다. 분리된 대부분의 세포는 PAS에 강하게 반응하는 분비과립을 함유하고 있는 세포질과 뚜렷한 핵을 가지고 있어 선세포임을 알 수 있었고 비교적 쉽고 성공적으로 분비선세포를 분리할 수 있었다.
세포분리시에는 여러가지 다른 세포가 혼합될 수 있다. 세포의 분리와 배양에서 오염된 세포의 제거를 위해서는 세포분리시에 보다 순수하게 단일세포로 분리하는 방법과 배양시에 오염세포를 제거하는 방법이 이용된다. 효소, EDTA16)17) 등으로 세포질간의 결합을 약화시키고, 세포간의 무게차이를 이용한 원심분리,10)15) 세포크기의 차이를 이용하여 망상체로 세포를 거르는 방법,10)15) 분비선세포와 섬유아세포, 상피세포가 평판되는 시간의 차이를 이용3)11)하여 순수도를 높일 수 있다. 본 실험에서는 효소, 세포무게를 이용한 원심분리를 이용하여 세포의 순수도를 높였다.
분리하여 배양된 선세포는 일반적인 다른 단일세포의 증식력과 같은 속도로 배양되었는데, 배양 2일에 세포가 소군락을 이루었고 3∼4일에 군집을 이루었으나 세포의 크기와 모양이 다소 불규칙하였다. 5일째 다각형의 세포로 모양이 균일하여졌고 2개 이상의 뚜렷해진 핵인이 관찰되어 세포의 분열이 활발하게 일어나면서 7∼8일째 합류되어 세포는 동일모양으로 밀집되었고 일부는 세포의 층이 겹쳐져 나타나기도 하였다. 합류된 상태에서 세포수의 증가는 둔화되었고, 세포내 기포가 생성되었다.
인체의 비점막의 분비선세포는 장액세포와 점액세포로 구성되어 있다. 이들 분비선 세포는 Alcian blue와 PAS 염색을 이용하여 점막하선세포임을 확인할 수 있으며 이는 점액당배합체(mucoglucoconjugates)의 존재를 의미한다.9) 장액세포는 리소자임, 락토페린, secretory leukoprotease inhibitor, secretory component IgA 등을 분비하며 락토페린, 리소자임에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 검사로 선세포임을 확인할 수 있다.3)9) 따라서 배양된 세포가 선세포임을 확인하기 위하여 in vivo 상태에서 분비되는 각각의 물질에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 방법이 주로 사용된다. 그러나 다음과 같이 배양된 선세포는 배양시간이 길어질수록 선세포에서 관찰되는 분비과립이 점점 소실되는 것을 보고하고있다. 즉, Furukawa 등3)은 배양된 분비선세포를 락토페린, 리소자임에 대한 항체를 이용한 면역형광법을 이용하여 관찰한 결과 양성반응을 보이는 세포수가 감소하므로 배양세포의 표현형(phenotype)의 변화로 그 성질이 변형됨을 보고하였다. Mushtaq 등9)은 배양세포가 시간이 경과하며 장액세포와 점액세포 각각의 고유성질을 잃고 혼합된다고 하였다. Culp 등4)도 역시 배양된 선세포에서 분비과립이 일부에 미량 나타난다고 하고있다. 본 실험에서 분리된 선세포는 분리된 즉시 PAS 염색에 강하게 반응하였으나 배양된 세포에서는 세포증식이 진행될수록 염색되지 않는 세포가 증가하였다. 이와 같이 시일이 경과함에 따라 AB-PAS 염색에 양성과립을 가진 세포가 감소하는 것은 세포증식이 진행됨에 따라 분비선 본래의 성질이 변화하는 탈분화(dedifferentiation) 때문이라 생각된다. 따라서 세포증식이 진행될수록 분비선세포를 확인할 수 있는 방법은 AB-PAS 방법만으로는 불충분하며 분비선세포에 특이적으로 반응하는 새로운 항체를 이용한 면역조직화학적 방법이 필요하며 분비과립이 점점 소실되는 분화된 세포의 성질을 파악할 수 있는 연구가 필요하다고 생각된다. 더나가서 in vitro 상태에서 분비선세포의 특성을 유지할 수 있도록 분화(differentiation)를 계속 유도하는 배양법을 개발하는 것이 in vivo 상태의 분비선의 활성을 반영할 수 있을 것으로 생각된다.
결론
본 연구에서는 비점막 분비선세포의 특성, 즉 다양한 자극에 대한 비점막 분비선세포의 분비활성을 연구하기 위한 기초자료로 인체 정상 비점막하 분비선세포의 분리 및 배양을 시도하였다. 그 결과 인체의 비점막에서도 점막하선조직의 분리가 가능하며 분리된 선세포를 이용한 선세포의 생리학적기능연구가 가능하다고 생각되며 다만 배양된 선세포에 있어서는 분비선의 세포과립이 점점 소실됨으로 분비선의 특성을 파악하고 유지할 수 있는 방법을 개발하는 연구가 필요하리라 생각된다.
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