| Histopathologic Changes in Nasal Mucosa of Rat with Benzalkonium Chloride. |
| Jin Hee Cho, Yong Sig Kwun, Nam Soo Lee, Yu Sung Won, He Ro Yoon, Byung Do Suh |
| Department of Otolaryngology-HNS, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. entcho@cmc.cuk.ac.kr |
| Benzalkonium Chloride에 의한 흰쥐 비점막의 병리조직학적 변화 |
| 조진희 · 권용식 · 이남수 · 원유성 · 윤희로 · 서병도 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
비점막ㆍ보존제ㆍBenzalkonium chloride. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Benzalkonium Chloride (BZC) is one of the most often used preservatives that has strong germicidal effect. Not only is it used for nasal drops, but also for eye drops and cosmetics. However, there have been many reports that lesions such as dermatitis and conjunctivitis are considered the results of irritation induced by BZC. We evaluated the histological changes after long-term administration of BZC on rat nasal respiratory mucosa.
MATERIAL AND METHODS: We divided 40 BZC treated animals into 4 groups. First group received low-concentrated BZC solution which is commonly used for nasal sprays. Second group received high-concentrated BZC solution which is reported to induce dermatitis in human. Third and Fourth group received steroid mixed in the BZC solutions of low and high concentrations, respectively. Control group was administrated with normal saline. After 1, 2, and 4 weeks of topical administration in each group, the symptomatic and histological changes with H&E stain were observed.
RESULTS:
Sneezing and nose rubbing with forelegs were observed in all subgroups on the 5th day of treatment. The BZC induced lesions, including glandular formation, inflammatory cell infiltration, and edematous changes. The symptomatic and histological changes were pronounced when the duration of BZC administration was increased. Similar results were observed in groups that received steroid mixed in the BZC solution.
CONCLUSION:
We found that even low concentration of BZC preservative can cause nasal lesions. Thus, there is a strong need to develope a preservative that can be used safely. |
| Keywords:
Nasal cavityㆍPreservativeㆍBenzalkonium chloride |
서론
비강 및 부비동을 비롯한 호흡기 질환의 약물치료로 전신적 약제 뿐 아니라 국소적 약제가 많이 이용되고 있다. 비분무제나 흡입제 등 국소 약제의 세균 감염 방지를 위해 여러 종류의 보존제가 사용되고 있다. 이들 보존제는 약물의 주 약리작용의 변화를 주지 않는 범위내에서 사용되어야 하며 생체내에 부작용을 일으키지 않아야 한다. 이중 benzalkonium chloride(BZC)는 비분무제, 안점액, 화장품 등에 많이 사용되는 보존제로 일상생활에서 많이 접촉하는 물질이다. 보고자에 따라 저농도의 BZC는 보존제로 안전성에 따라 논란이 많은 상태이나, 여러 임상과 실험에서 BZC의 자극에 의해 접촉성 피부염, 결막염, 비염 등 여러 병변을 유발한다는 보고도 있다.
이에 저자들은 비분무제의 보존제로 흔히 사용되고 있는 BZC의 장기사용시 관찰되는 비점막 변화를 알아보고 그 영향과 정도를 파악하여 BZC의 안전성과 장기간 사용 가능성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
출생 4∼5주된 체중이 120∼150 g이 되는 흰쥐(Spraque-Dawley) 40마리를 사용하였다. 이 쥐들은 실험동물용으로 사육된, 균에 노출되지 않은 동물로 멸균된 cage에서 멸균된 음료와 사료로 본 대학 동물연구실에서 사육되었다. 실험시작전 3일간 하루 2차례, 30분씩 동물을 관찰하였으며 재채기, 코부빔증세, 비분비물 등이 관찰되지 않는 동물을 이용하였다.
BZC(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA)를 이용하여 비분무제의 보존제로 흔히 사용되는 0.01 w/v% BZC용액과 접촉성 피부염을 일으킬 수 있다고 보고된 0.1 w/v% BZC용액을 만들고 이들 용액에 치료제인 trimacinolon acetate 분말(한국 롱프랑, 서울, 한국)을 각각 첨가하여 0.15 w/v% triamcinolon acetate 혼합용액을 만들었다. 동물을 4군으로 나누어 1군은 저농도의 BZC용액을 투여하였고, 2군은 저농도 BZC용액에 스테로이드를 혼합한 용액을 투여하였고, 3군은 고농도의 BZC용액을 투여하였으며, 4군은 고농도 BZC용액에 스테로이드를 혼합한 용액을 투여하였다. 대조군은 생리식염수를 사용하였다. 각각의 용액을 오전 9시, 오후 5시에 7 μl씩 양측 외비공을 통해 비강에 micropipet을 이용하여 투여하였고, 투여 후 10분간 재채기, 코부빔(nasal rubbing with forelegs), 콧바람소리(nasal wheezing), 비분비물(nasal discharge) 등 증상변화를 관찰하였다. 각 군의 동물을 1주, 2주, 4주에 Ketamine과 Rompun으로 마취한후 복강을 가르고 신혈관을 절단하여 방혈로 희생하였다. 비강을 포함한 두부를 적출하여 10% 포르말린에 24시간 고정하였고, 흐르는 물에 수세한후 10% EDTA-0.1 M cacodylate buffer(pH 7.4)에 2주간 탈회시켰다. 탈회 후 24시간동안 흐르는 물에 수세하였고, 대구치를 포함하게 안구 전방에서 수직으로 두부를 절단하여 파라핀에 포매하였으며, 5∼6 μm두께로 표본을 만들어 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색법을 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 비중격 점막의 조직변화를 관찰하였고, 증식한 상피층의 두께를 기저막에서부터 비강쪽 자유연까지 제일 긴 높이로 측정하였다. 조직을 세포배열이 일정한 표본을 얻을때까지 여러 각도로 절단하였으며 세포배열이 가장 일정한 표본에서 상피층 두께 변화가 가장 심한 부위를 400배로 사진 촬영하여 버어니어 캘리퍼스(Mitutoyo, Japan)로 측정한 후 실제 상피층 두께를 산출하였다.
결과
증상변화
재채기와 코부빔은 투약 5일후부터 보존제의 농도와 스테로이드 포함여부와 관계없이 거의 전 동물에서 관찰되었다. 비 분비물이 관찰되는 동물은 없었으며, 콧바람소리는 스테로이드 사용여부와 관계없이 고농도 2주, 4주군에서 관찰되었다. 대조군은 특이한 증세를 보이지 않았다(Table 1).
조직학적 변화
주 조직학적 변화는 부종성 변화, 염증세포의 침투와 배상세포, 점액샘의 증식이었다. 1주간 투약한 경우 BZC 단독군과 스테로이드 혼합군 모두에서 염증세포의 증식과 배상세포의 증식이 관찰되었다. 대조군은 정상 호흡상피 소견을 보였다(Fig. 1). 저농도 BZC 단독군에서 저농도 스테로이드 혼합군에 비해 염증세포의 침투가 보다 심하였으며, 양군 모두 배상세포의 증식이 관찰되었다(Fig. 2). 고농도 BZC 단독군은 저농도 BZC 단독군보다 심한 상피내 점액샘의 증식과 염증세포의 침투를 보였으며 스테로이드 혼합군에서도 유사한 양상을 보였다(Fig. 3). 투여기간이 길어질수록 저농도 고농도군 모두에서 점액샘의 증식은 왕성하게 일어났으며 보다 풍부한 분비물의 축적과 다세포샘이 형성되었고 염증세포의 침윤과 점막의 부종성 변화가 심하였다. 농도와 관계없이 스테로이드 혼합군에서도 점액샘의 증식과 염증세포의 침윤이 관찰되었으나 BZC단독군에 비해 미약한 양상을 보였다(Figs. 4 and 5).
상피두께를 측정한 결과 BZC단독군은 투여기간이 길수록 증가하는 양상을 보였으나, 스테로이드 혼합군은 2주간 투여할 때까지 증가하였으나 4주군에서는 2주군에 비해 감소하는 양상을 보였다(Table 2).
상피층의 두께측정은 조직을 여러 각도로 절단하여 가장 세포배열이 일정한 표본에서 측정하였으며 병변의 정도를 알아보는 척도로 사용하였으나, 과도한 점액샘의 증식으로 인해 세포배열이 일정하지 않은 경우가 많아서 통계처리는 하지않았다.
고찰
비강, 부비동 및 호흡기 질환의 치료를 위해 다양한 약제들이 전신적 혹은 국소적으로 사용되고 있다. 특히 이비인후과 영역도 비분무제가 널리 사용되고 있다. 비분무제에는 주작용 약물이외에도 등장화제, 점도조절제, 보존제, 현탁제, 용제, pH 조절제 등의 다양한 첨가제들이 포함되어 있으며 이들 첨가제는 인체에 무해한 것으로 알려져 있다. 그러나, 임상적으로 비분무제를 사용한 이후 발생하는 부작용에 대한 보고가 있으며, 이는 보존제에 의해 발생되는 경우가 많다.1-5) 현재까지 널리 사용되고 있는 보존제는 BZC, potassium sorbate, chlorbutol, chlorocresol, sodium metabisulfite, propyl-p-hydroxybenzoate 등이 있으며 이중 BZC가 가장 흔히 사용되고 있다. BZC은 강력한 정균제인 quanternary ammoium compound 중에 하나로 정균제와 소독제로 흔히 사용되는 물질로6) 세균 뿐만 아니라 포유동물의 세포에도 독작용이 있다.3)
1980년이후 비분무제내에 포함된 점막수축제, 보존제 등에 의한 약물성 비염에 관심이 높아진 이후, 1989년 Batt등은 개구리 구개 섬모운동에 BZC등의 보존제가 독성작용을 보인다고 보고하였고,7) 1996년 Graf 등은 BZC가 포함된 비분무제를 사람에게 사용하여 장기간 사용할 경우 비점막에 부종성 병변을 유발한다고 보고한 바 있다.8) 1997년 Berg 등은 BZC가 포함된 스테로이드 용액과 포함되지 않은 스테로이드 용액을 흰쥐 비점막에 투여하여 BZC를 포함한 군에서 비점막상피의 편평상피성 변화를 일으킨다고 보고하였고,9) 1997년 Kuboyama는 흰쥐의 비점막에 여러 농도의 BZC용액을 투여하여 고농도의 BZC용액일수록 자극에 의해 부종성 변화, 염증세포의 침투, 상피성 표피탈락 등이 일어난다고 하였다.6)
저자들은 본 연구에서 BZC의 농도차와 스테로이드 포함여부에 따라 발생하는 증상의 변화와 비점막의 조직학적 변화를 보고자 하였다. 비점막 상피는 편평상피, 이행상피, 호흡상피, 후각상피 등 여러 상피로 이루어져있으며, 편평상피를 제외한 이행상피, 호흡상피, 후각상피들은 화학적 자극에 다양하게 반응한다.10) 또한 대구치 부위의 호흡상피의 변화가 가장 심하다.6) 본 연구에서의 조직학적 변화도 대구치 부위의 비강내 전방부에서 조직학적 변화가 가장 심하였고, 비인강부위로 갈수록 미비한 변화를 보였다. 이는 자극물질이 비인강부위로 갈수록 비 분비물에 의해 희석되거나 비활성화되던지 혹은 점액섬모 기전에 의해 제거되었다고 생각되어진다.9) 가장 심한 조직학적 변화를 보인 대구치 부위의 호흡상피는 전군에서 염증세포의 침윤이 두드러진 부종성 병변을 보였으며 상피내 점액샘의 증식을 보였다. 1주간 투여한 저농도군에서는 단세포샘이 증가된 양상을 보였다. 이 단세포샘은 세포 첨부(apical end)에 창백한 물질이 관찰되었으며 핵은 기저부(basal end)로 밀려있는 소견을 보였고 세포질은 호염기성으로 염색되는 양상을 보였고, 포유류 호흡상피에 관찰된 단세포샘인 점으로 배상세포가 증식된 것임을 알 수 있었다.11) 투여기간이 길어질수록 관찰되는 샘(gland)의 양상은 상피내의 다세포샘이었다. 이들 샘의 중심부는 창백한 물질로 차 있었으며 핵은 납짝한 형태로 원심부로 밀려있었다. 이들은 시트(secretory sheet)와 단순 대롱샘(simple tubular gland)의 중간형태로 일반적으로 점액성 물질을 분비한다.12)
비점막은 화학적 자극에 의해 호흡상피의 변화, 기저막 두께의 변화, 샘의 증식, 감각세포의 증식 등을 보이지만 그 발생기전은 명확하지 않다. Meggs는 화학자극원이 감각세포와 화학적 매게물(chemical mediator)에 의해 염증반응이 일어나고, 순차적으로 상피조직의 변화와 자극원에 재 노출되어 염증반응이 심해지는 양성 피드 백(positive feed back) 모델을 제시하였으나13) 발생기전에 대한 연구가 미진한 상태이다. 본 연구에서는 기존의 연구에서 발생된 편평화생과 세포탈락은 관찰되지 않았다. 저자들은 BZC의 화학적 자극에 의해 배상세포의 증식이 이루어졌으며 이 배상세포의 과형성에 의해 상피내 다세포 점액샘이 발생되고, 이러한 반복적인 자극으로 혈관이 확장되고 혈관투과성이 증가하여 부종과 코막힘이 발생되게 된다고 생각하며,8) 샘조직의 발달로 많은 점액성분이 분비되고 섬모운동의 장애가 발생하여 분비물의 정체가 이루어진다14)고 생각한다. 그러나, 정확한 발생기전에 대한 앞으로의 연구가 필요하다고 생각한다.
스테로이드 혼합군은 BZC 단독군과 동일한 증상의 변화를 보였고, 상피내 점액샘의 증식, 염증세포의 침투, 부종성 병변의 발생도 전군에서 관찰되었다. 그러나, 조직학적 변화는 BZC 단독군에 비해 경미한 양상을 보였고, 상피층의 두께는 2주간 투여할 때는 증가하는 양상을 보였으나 4주간 투여할 때는 오히려 감소하는 양상을 보였다. 이는 스테로이드의 치료효과로 생각되나, 대조군에 비하여 증상과 조직학적 병변을 보이므로 스테로이드 분무제내에 포함된 BZC의 유해성을 알 수 있었다.
결론
BZC는 현재 여러 분야에서 보존제로 많이 사용되고 있으나 저자들은 본 연구로 비점막에 안전하다고 알려진 농도의 BZC도 호흡상피에 유해하며 스테로이드의 포함여부와 상관없이 호흡상피의 병변을 유발한다고 생각하여, 상용화 되어있는 국소치료제에 포함된 BZC의 대체 보존제의 개발 혹은 보존제를 사용하지 않는 비분무제의 개발이 필요하다고 생각한다.
REFERENCES
1) Beasley CR, Rafferty P, Holgate ST. Bronchoconstrictor properties of preservatives in ipratropium bromide (Atrovent) nebuliser solution. Br Med J (Clin Res Ed) 1987;294:1197-8.
2) Stanley PJ, Griffin WM, Wilson R, Greenstone MA, Mackay IS, Cole PJ. Effect of betamethasone and betamethasone with neomycin nasal drops on human nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax 1985;40:607-12.
3) van de Donk HJ, Zuidema J, Merkus FWHM. The effects of nasal drops on the ciliary beat frequency of chicken embryo tracheas. Rhinology 1981;19:215-30.
4) Schwartz HJ, Chester EH. Bronchospastic responses to aerosolized metabisulfite in asthmatic subjects: Potential mechanisms and clinical implications. J Allergy Clin Immunol 1984;74:511-3.
5) Lotvall JO, Skoogh BE, Lemen RJ, Elwood W, Barnes PJ, Chung KF. Bronchoconstriction induced by inhaled sodium metabisulfite in the guinea pig. Effect of capsaicin pretreatment and of neutral endopeptidase inhibition. Am Rev Respir Dis 1990;142:1390-5.
6) Kuboyama Y, Suzuki K, Hara T. Nasal lesions induced by intranasal administration of benzaikonium chloride in rats. J Toxicol Sci 1997;22:153-60.
7) Batts AH, Marriot C, Martin GP, Bond SW. The effect of some preservatives used in nasal preparations on the mucus and ciliary components of mucociliary clearance. J Pharm Pharmacol 1990;42:145-51.
8) Graf P, Hallen H. Effect on the nasal mucosa of long-term treatment with oxymetazoline, benzalkonium chloride, and placebo nasal sprays. Laryngo-scope 1996;106:605-9.
9) Berg OH, Lie K, Steinsvag SK. The effects of topical nasal steroids on rat respiratory mucosa in vivo, with special reference to benzalkonium chloride. Allergy 1997;52:627-32.
10) Mery S, Larson JL, Butterworth BE, Wolf DC, Harden R, Morgan KT. Nasal toxicity of chloroform in male F-344 rats and female B6C3F1 mice following a 1-week inhalation exposure. Toxicol Appl Pharmacol 1994;125:214-27.
11) Chung JW. The epithelium. In: Chung JW, editor. Tissue biology. 1st ed. Seoul: SooMoon Publishing;1998. p.85-121.
12) Fawcett DW. Gland and secretion. In: Bloom W, Fawcett DW, editors. Textbook of histology. 10th ed. Philadelphia: W.B.Sunders Company;1986. p.83-110.
13) Meggs WJ. Hypothesis for induction and propagation of chemical sensitivity based on biopsy studies. Environ Health Perspect 1997;105:473-8.
14) Ballenger JJ. Acquired ultrastructural alterations of respiratory cilia and clinical disease. A review. Ann Otol Rhinol Laryngol 1988;97:253-8.
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