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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(2): 159-163. |
| Cytokine Gene Expression Associated with Bone Destruction in Cholesteatoma Tissues. |
| Chul Won Park, Young Ho Jang, Yean Hee Yu, Myung Ju Ahn |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea. hyent@chollian.net
2Department of Internal Medicine, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea. |
| 진주종 조직에서 골파괴와 연관된 Cytokine 유전자 발현 |
| 박철원1 · 장영호1 · 유연희1 · 안명주2 |
| 한양대학교 의과대학 이비인후과학교실1;내과학교실2; |
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| 주제어:
진주종ㆍ사인토가인. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cholesteatoma is composed of hyperproliferative keratinizing epithelium in the middle ear cavity. Although the mechanism of bone destruction by cholesteatoma has not been fully elucidated, it has been reported that activation of several cytokines followed by osteoclast activation might have a major effect on bone resorption in cholesteatoma. Among the several cytokines, it has been suggested that the overexpression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interleukin-1alpha (IL-1alpha) and interleukin-6 (IL-6) in the cholesteatomatous tissue is correlated with bone destruction, and transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and interleukin-4 (IL-4) are associated with osteoclast inhibitory activity. To determine the potential role of several cytokines in the pathogenesis of cholesteatoma and its bone destruction, we investigated mRNA expression of four cytokines in the cholesteatomatous tissue.
MAERIALS AND METHODS: We investigated mRNA expression of cytokines in 20 cholesteatomatous tissues as well as in the normal postaural skins using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction).
RESULTS:
1) Out of 20 cholesteatomatous tissues, six were mRNA expressions of IL-1alpha, four of IL-6, ten of TGF-beta1 mRNA, but no expressions of IL-4. There was no gene expression except six cases for TGF-beta1 in the normal postaural skin. 2) Three cases that expressed IL-1alpha, IL-6, and TGF-beta1 showed severe bone destruction, whereas no bone destruction was noted in 5 cases that expressed only TGF-beta1. 3) There was no significant correlation between the duration of disease and the individual cytokine expression.
CONCLUSION:
These findings suggest that IL-1alpha and IL-6 may play a major role in the proliferation and growth of cholesteatoma as well as the excitatory effect for bone destruction by cholesteatoma, and TGF-beta1 might have a protective effect for bone destruction. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍCytokinesㆍRT-PCR |
서론
진주종은 중이강내의 각질화 상피세포의 과다증식으로 생기며 이로 인해 진주종이 골 파괴를 일으킬 수 있어 다양한 임상양상 및 합병증을 야기한다. 이러한 진주종의 임상적 특성은 이미 알려져 있으나 진주종의 기원, 증식, 골 파괴의 기전에 대해 명확히 알려지지 않았으며 최근 이에 대한 관심이 증가되어 왔다. 이중에서도 진주종성 중이염에 의한 골 파괴로 심각한 합병증을 초래하는 기전에 대해 활발한 연구가 진행되고 있으나 아직 확실한 것은 없는 실정이다. 지금까지 연구되어온 골 파괴 기전은 골 자체에 압력으로 인한 괴사, 각종 분해 효소에 의한 골 흡수, 만성 골수염, 수소이온농도의 변화, 그리고 여러 cytokines의 활성에 의한 골 흡수 등이 복합적으로 작용하고 있다.1-3) 이중 다양한 cytokines의 상호작용에 의한 파골 세포의 활성화로 인한 골 흡수가 주요한 작용을 하리라 생각되고 있다. 파골 세포를 활성화시키는 cytokine으로는 IL-1, IL-6, IL-8, TNF 등이 있으며 억제하는 cytokine으로는 TGF-β, IL-4, IFN-r(interferon-r)등이 알려져 있다.3)
이에 저자들은 수술중 얻은 진주종 조직을 이용하여 파골 세포를 활성화시키는 IL-1α, IL-6와 억제시키는 IL-4, TGF-β1를 RT-PCR 방법을 통해 유전자 발현 정도를 보았으며 이를 진주종의 골 파괴 정도, 유병기간 등의 임상양상과 비교하여 여러 cytokines의 파골 세포에 대한 상호관계를 보았다.
대상 및 방법
조직채취
한양대학병원 이비인후과학 교실에서 만성 진주종성 중이염으로 진단 받고 수술 받은 환자 32례를 대상으로 수술시에 진주종 조직을 얻어 eppendorf tube에 넣은 즉시 액화질소용기에 보관하여 운반후 영하 70도 냉동고에 보관하였다.
Total RNA의 추출
Total RNA를 추출하기 위해 약 100 mg의 조직을 멸균된 eppendorf tube에 옮긴 후 RNA의 손실을 막기 위해 RN-ase inhibitor인 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 구성된 solution D(guanidin thiocyanate, DEPC-dH2O, sodium citrate, sarcosyl)를 첨가하고 homogenizer로 균질화시켰다. RNA를 침전시키기 위해 균질화된 조직에 2 M sodium acetate(pH 4)를 넣고 단백질을 제거하기 위해 phenol과 chloroform을 혼합시켰다. 여기서 얻은 재료를 10,000 g(gravity), 4℃에서 20분간 원심 분리한 후 상층부위를 새 tube에 옮기고 핵산침전이 잘 되도록 isopropanol을 첨가하여 영하 20도에서 1시간 이상 침전시킨 후에 다시 isopropanol을 첨가하고 원심 분리하였다. 75% ethanol을 첨가하고 원심 분리하여 깨끗이 정제 후에 얻어진 RNA pellet을 1시간 동안 건조 후 50 ul의 DEPC-dH2O에 부유시켰다. 추출된 RNA pellet을 증류수로 100배 희석하여 spectrophotometer로 RNA 농도를 측정하였다.
역전사(Reverse transcription)
Messenger RNA(mRNA)에서 complementary DNA (cDNA)를 합성하는 reverse transcription을 위해 추출된 RNA 2 ug에 8 ul dH2O를 혼합후 70℃에 10분간 보온하였다. dNTP, RNASIN(RNase inhibitor), MMVL-RT(reverse transcriptase), DTT(dithiothreitol), random hexamer, 5×RT(reverse transcriptase) buffer를 혼합후 37℃에서 90분간 보온후 95℃에서 10분간 반응시켜 mRNA를 cDNA로 역전사시켰다.
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction：PCR)
cDNA를 PCR로 증폭시키는 과정으로 reverse transcription과정에서 얻은 cDNA 5 ul에 각각 50 pmol의 primer, 1.25 U Taq polymerase, 10×PCR buffer, 200 uM dNTP, 1.5 mM MgCl 2, 35 ul dH2O를 혼합하여 반응시켰는데 primer로는 IL-1α, IL-4, IL-6, 그리고 TGF-β1에 각각 특이한 sense primer와 antisense primer(Table 1)5)를 사용하였고, 반응조건은 변성반응(denaturation)을 위해 95℃에서 1분, 결합반응(annealing)을 위해 65℃에서 30초, 연장반응(extension)을 위해 72℃에서 1분으로 하였고 모두 35 cycle을 시행하였다.
전기영동(Electrophoresis)
PCR로 증폭된 cDNA를 전기영동 시키는 과정은 2% agarose gel에 5 ul/ml ethidium bromide 염색을 한 후 10 ul의 PCR 반응물과 2 ul gelloading buffer를 넣고 0.5×TBE(Tri-Borate-EDTA) buffer에서 100 voltage로 30분간 시행하여 각각의 band를 관찰하였다.
실험반응의 정확성을 확인하기 위해 β-actin primer를 이용하여 RT-PCR을 시행후 산물을 관찰하였고 Sequenase kit(USB, Amersham, Cleveland, OH)를 이용하여 Sanger 방법으로 RT-PCR 산물을 확인하였으며 음성 대조군으로는 cDNA대신 dH2O를 사용하였다.
환자의 임상상
진주종의 파괴 정도를 보기 위해 환자 병록지를 조사하여 유병기간, 수술소견상 골 파괴 정도를 검토하여 각각의 cytokines의 발현 유무와 비교 분석하였다. 골 파괴 정도는 수술소견에서 주관적으로 결정하였으며 고실개(scutum) 미란, 이소골 미란이 경미하면 진주종 소견으로 분류하였고 고실개(tegmen) 파괴, 이소골이 대부분 결손된 경우등은 골미란으로 분류하였으며 이소골의 완전결손, 골미로파괴, 외이도 후벽 파괴, 안면신경관 파괴가 생긴 경우등은 골파괴로 분류하였다.
결과
32례의 진주종 조직중 RNA 추출후 spectrophotometer를 이용한 RNA농도가 0.2 μl/mg이상 20개의 조직에서 RT-PCR을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 실험의 정확성을 위해 실시한 β-actin의 발현은 진주종 조직 및 정상 후이개 조직 모두에서 661 bp에서 band가 관찰되었고, dH2O를 사용한 실험 대조군에서는 band가 관찰되지 않았다.
2) 20례의 진주종 조직중 IL-1α(420 bp), IL-4(276 bp), IL-6(628 bp), 그리고 TGF-β1(661 bp) band는 각각 6, 0, 4, 10례에서 관찰되었으며 20례의 정상 후이개 피부조직에서는 단지 TGF-β1만이 6례에서 관찰되었다(Table 2, Figs. 1 and 2).
3) 같은 진주종에서 발현된 cytokine에 따른 분류를 해보았을때 IL-1α, IL-6, 및 TGF-β1가 모두 발현된 3례에서는 골 파괴 정도가 광범위하였고 TGF-β 1만 발현된 5례에서는 골 파괴 소견이 없거나 골미란 정도만 있었다(Table 3).
4) 진주종의 유병기간과 IL-1α, IL-4, IL-6, 그리고 TGF-β1의 발현사이에는 연관성을 찾을 수 없었다(Table 4).
고찰
진주종은 다양한 임상증상 및 합병증을 일으켜 치료가 어려운데 이는 진주종이 중이강의 해부학적 구조물을 파괴하기 때문이다. 이런 진주종성 중이염에 의한 골 파괴로 심각한 합병증을 초래하는 기전에 대해 활발한 연구가 진행되고 있으나 아직 확실한 것은 없는 실정이다.
지금까지 연구된 바에 의하면 Moriyama 등5)은 상피세포와 간질세포간의 반응으로 진주종이 골 파괴를 일으킨다고 하였고, Bernstein6)은 중이염에 대한 일차 방어로 면역반응이 관여할 것이라 하였다. 그러나 최근에는 여러 cytokines들의 상호작용에 의한 파골 세포의 활성화가 골 흡수를 일으키는데 주요한 작용을 하리라 생각되고 있다.
진주종의 골 흡수와 관계되는 다양한 cytokines중에서 TNF-α, TNF-β 1, IL-1α와 epithelial growth factor(EGF)는 섬유아세포, 파골 세포, 염증세포를 자극하여 조직파괴와 개형(remodeling)을 야기한다.1)2)7) Kim 등8)은 진주종상피조직에서 면역조직화학적 방법을 통해 IL-1α, IL-1, IL-6, IL-8가 모두 발현됨을 보고하였고 Yoon 등9)은 진주종 상피세포 배양을 통해 진주종의 골파괴 현상이 IL-1α, IL-8에 의해 매개됨을 보고하였다. IL-1α는 각질화 상피세포의 증식능을 증가시키며9) 진주종 조직 내에서 높게 관찰된다.7)10) 따라서 IL-1α의 상승은 진주종의 골 흡수를 일으키는 것으로 알려져 있다.10) IL-6는 상피세포, 림프구, 섬유아세포 및 대식세포 등의 다양한 세포들로부터 형성되며 표적세포의 성질에 따라 다양한 효과를 나타낸다. 진주종 조직내의 IL-6는 주로 대식세포와 섬유아세포등의 간질세포에서 형성되며 진주종조직에서 정상피부조직보다 IL-6가 높게 발현되는 것은 이런 간질세포뿐만 아니라 각질화 상피세포에서 발현이 높게 나타나기 때문이다.11) 또한 IL-6는 IL-1α, TNF-α를 공동으로 서로를 자극하여 발현이 증가되며12) 혈액전구세포로부터 파골 세포 형성을 자극한다.13) 본 연구에서도 IL-1α와 IL-6가 같이 발현된 3례에서 골 파괴가 심하였다. 정상 피부에서는 외상, 감염, 자외선 조사등의 여러 자극에 의해 IL-1, IL-6등의 cytokines을 생산할수 있으며 보고자마다 발현정도의 차이를 보이고 있는데14-16) 본 연구에서는 전혀 발현되지 않았다. 이는 아마도 실험 방법상의 차이와 실험에 사용한 피부 또는 항체의 차이일것으로 생각된다.
IL-4는 이와 반대로 파골전구세포가 파골 세포로 분화되는 것을 방지하여 골 흡수를 방어한다.17) 그러나 본 연구에서는 IL-4가 전혀 발현되지 않아 진주종과의 연관성을 찾을 수 없었다. 골에 있어서의 TGF-β1은 조골세포 증식과 분화 및 골 단백질의 형성을 상승조절(up-regulation)하나, 파골 세포의 수와 활성도는 저하조절(down-regulation)하여 진주종 증식과 성장에 방어 작용을 함으로써 골 흡수를 억제한다.16)18) 또한 염증반응 부위에 형성된 결체조직을 파괴하는 단백질 분해효소의 작용을 억제하여 TGF-β1 작용부위에서 새로운 육아조직이 형성되는 것을 증가시킨다.19) TGF-β1은 염증반응에서 나오는 다른 cytokines들의 활성을 감소시키는데 대표적인 것으로는 TGF-β1이 연골세포에서 IL-1α의 활성도와 수용체(receptor)를 억제한다.20) 그러므로 진주종에서도 TGF-β1이 IL-1α의 수용체를 억제조절(down-regulation)할것으로 생각한다.16) 또한 TGF-β1이 1ng/ml 정도의 낮은 농도에서도 각질형성세포의 성장을 억제하는 보고도 있다.21) 본 연구에서는 골 파괴가 심한 4례 모두에서 TGF-β 1이 IL-1α, IL-6와 같이 발현되었기에 TGF-β1가 골 파괴에 대한 방어작용을 하고 있으나 IL-1α 또는 IL-6의 발현이 더 강하면 골 파괴가 진행된다고 볼 수 있겠다. 또한 정상 세포보다 진주종에서 통계적 유의성은 없으나(p>0.05) TGF-β1이 많이 발현되었고, TGF-β1만 발현돤 5례에서는 골 파괴가 없었거나 심하지 않아 골 파괴를 억제한다고 사료된다. 이상과 같이 진주종은 IL-1α, IL-6 등의 골 흡수를 촉진하는 cytokines와 TGF-β1등의 골 흡수를 억제하는 cytokines의 상호작용에 의해 이루어지며, 어느 한쪽의 발현이 더 강하면 골 흡수가 일어나거나 골 흡수가 억제될 것으로 사료된다.
본 연구에서 나타난 IL-1α, IL-6의 골 파괴 작용과 TGF-β1의 골 흡수 억제작용을 확실히 하고 또한 어느 농도에서부터 서로의 작용이 더 강하게 작용하는지 알기 위해서는 cytokines에 대한 정량적인 검사를 병행하여야 하겠다.
결론
저자들은 진주종에서 IL-1α, IL-4, IL-6, 그리고 TGF-β1의 발현을 비교하여 본 결과, IL-1α과 IL-6는 골 흡수가 많은 진주종에서, TGF-β1은 골 흡수가 적은 진주종에서 발현되었고 IL-4는 진주종에서 발현되지 않았다. 따라서 진주종은 그 성장과정에서 여러 cytokines이 상호작용 및 상반작용 등의 복잡한 상호조직망을 통해, 활성이 더 강한 cytokines에 의해 골 흡수 또는 골 흡수 억제가 일어남을 짐작할 수 있었다. 그러나 이러한 기전을 확실히 밝히기 위해서는 향후 IL-1α, IL-4, IL-6, TGF-β1 및 그 외의 파골 세포와 연관된 여러 cytokines들의 정량적인 분석과 각각의 진주종 상태를 비교하여야 하겠으며 진주종의 골 파괴 기전을 규명함으로써 이 질환의 예방과 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
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