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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(12): 1513-1520. |
| Expression of Fos Protein in Brainstem Vestibular Nuclei of Rat-II. Sinusoidal Acceleration Stimulation-. |
| Han Kyu Suh, Jeong Su Woo, Ho Jeong Park, Dong Hee Yoo, Eun Soo Lee, Hyun Ho Lim, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. kughent@nuri.net |
| 흰쥐 뇌간 전정핵에서 Fos 단백의 발현 - II. 진자양가속(Sinusidal Acceleration)자극에 따른 발현 양상 - |
| 서한규 · 우정수 · 박호정 · 유동희 · 이은수 · 임현호 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
진자양가속ㆍ전정핵ㆍFos 단백. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Fos, the protein product of c-fos gene, has been known to be rapidly expressed in neurons following various external and internal stimuli and this protein expression has been used as a neural activation marker in many fields. This experiment was performed to examine the afferent pathway of the lateral semicircular canals following sinusoidal acceleration.
MATERIALS & METHODS: To stimulate the lateral semicircular canals, animals received rotary stimulation for 90 minutes with 2.0Hz sinusoidal acceleration. Thirty minutes after stimulation, the subjects were sacrificed and their brainstems were processed for immunohistochemistry to detect Fos expression.
RESULTS:
Fos proteins were strongly expressed in the superior, dorsal medial vestibular and inferior vestibular nuclei. However, there was no expression in the lateral and ventral portion of medial vestibular nuclei.
CONCLUSION:
This finding suggested that the afferent pathway from peripheral vestibular end-organ can be successfully mapped by detection of Fos expression and Fos is an useful neural activity marker in the vestibular system. |
| Keywords:
Sinusoial accelerationㆍFosㆍVestibular nuclei |
서론
신경 세포가 외부 자극을 경시납스 신호(transsynaptic signal)를 통하여 감지하면 신경세포에서는 유전자가 발현되어 반응에 필요한 단백질을 합성하여 신경 세포가 외부 반응에 적절히 대처하도록 하는 완급반응이 일어난다.1)2) 이렇게 자극에 대한 반응을 위하여 발현되는 유전자 중 반응의 초기에 발현되는 유전자들을 immediate early genes(IEGs)이라 한다.3)
IEGs에 속한 여러 가계(family) 중 전구 종양 유전자의 일종인 c-fos의 단백산물인 Fos 단백이 가장 초기에 발현된다는 사실이 알려지면서 이 유전자에 의하여 생성된 Fos 단백을 신경 활성의 표지자로 이용하여 말초 자극의 중추 투사 경로를 이해하려는 연구가 많이 진행되고 있다.4) 특히 전기 자극 후에 실험 동물의 뇌조직에서 c-fos가 발현되었다는 Morgan 등5)의 보고 후 Fos 단백의 발현 양상은 중추 신경계의 신경 전달 체계를 연구하는 신경활성을 나타내는 생물학적 표지자로 많이 이용되고 있으며,6-8) 동시에 여러 발현 장소를 관찰할 수 있어 반사궁 연구에도 이용되고 있다.9)10)
저자들은 지난 보고11)에서 구심성 주변축 회전자극을 흰쥐에 가하여 이석기관을 자극한 후 Fos 단백의 발현을 이용하여 말초 이석기관의 자극이 뇌간의 전정신경핵에 투사되는 양상을 관찰하였다. 실험 결과 다른 방법으로 관찰한 구심성 중추투사의 경로와 일치하는 결과를 얻을 수 있었으나 추적물을 사용하여 얻은 방법보다 투사경로를 입체적으로 관찰하는데 단점이 있었다. 따라서 본 실험에서는 수평 반규관에서 뇌간으로 중추투사되는 경로를 입체적으로 관찰하기 위하여 실험 동물의 뇌간을 장축에 대하여 종단(coronal section)과 횡단(sagittal section) 두 면으로 절단하여 Fos 단백의 발현 경로를 관찰하여 현재까지 밝혀진 중추 투사 경로와 비교하여 Fos 단백의 발현이 전정 신경계의 신경 활성 표지자로 유용한지 알아보았다.
실험동물 및 방법
실험동물 처리
실험 동물은 체중 150에서 200 gm 사이의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 실험동물 20마리에 진자양 자극을 주어 양측 수평반규관이 동시에 자극을 받게하였다. 이때 우측 수평반규관의 진자양 자극에 대한 뇌간 전정핵에서의 반응을 선택적으로 알아보기 위하여 좌측에 미로절제술을 시행하였다.
좌측 미로절제술을 위하여 체중 100 gm 당 0.7 ml의 우레탄을 복강 내에 주사하여 마취한 후 수술현미경하에서 등골을 제거하여 난원창을 확인하고 끝이 뾰쪽한 후크와 흡입기를 이용하여 전정내의 말초 전정 수용기를 제거하여 좌측 미로절제술을 시행한 후 추가로 전정독성이 강한 sodium arsanilic acid(Sigma Chemical, St Louis, MO)를 적신 젤폼을 전정 내에 넣어 화학적 미로절제술을 추가로 시행하고 하루 뒤에 진자양가속 회전자극을 주었다.
대조군으로는 진자양 자극을 주지 않고 희생시킨 뒤 면역 반응을 관찰한 정상 대조군과 면역반응시 일차항체와 반응시키지 않은 음성대조군을 사용하였다.진자양가속 자극 실험 동물에 진자양가속 자극을 줄때는 체중 100 gm 당 0.5 ml의 우레탄을 복강 내에 주사하여 경미하게 마취시킨 뒤 회전판의 축상(on-axis)에 실험동물의 두경부를 위치시키고 두부의 전반부를 약 20° 정도 앞으로 굴전시켜 수평반규관이 수평상태를 유지하도록 고정시켰다. 회전자극은 45 도의 회전각도로 6마리는 1.0 Hz의 속도로, 6마리는 1.5 Hz, 그리고 8마리는 2.0 Hz 속도로 90분간 주어 외측반규관을 자극하였다.
회전 자극을 위한 회전기는 회전판과, 회전판을 돌리는 모터, 회전수를 조정하는 계측기(tachometer), 그리고 회전수를 감지하는 감지기로 구성되어 있고 실험동물은 양쪽 외이도와 턱, 두경부를 고정시켰다.
모든 실험은 빛이 완전히 차단된 곳에서 시행하였고 회전기의 소음은 60 dB 이하였다.
동결절편 및 면역조직화학 염색
실험동물은 90분간 회전자극을 주고 30분 후에 심관류하여 희생시키고 뇌조직을 얻은 뒤 4% paraformaldehyde로 2일간 후고정하고 30% sucrose 용액에 추가로 2일간 담그어 놓아 cytoprotection을 하였다. 뇌간의 전정신경핵이 관찰되는 부위를 냉동절편기를 이용하여 뇌간 장축에 대하여 횡단과 종단으로 40 μm 두께로 동결 절편을 만들고 제작된 절편들은 내인성 peroxidase의 반응을 억제하기 위하여 0.3% H2O2/phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 10분 동안 상온에서 처리하고, 다시 PBS로 10분씩 세차례 행군 뒤 2% bovine serum albumin(BSA/PBS)에 한시간 동안 실온에서 처리한 다음 다시 PBS(pH 7.4)로 10분씩 세차례 행군 뒤 일차항체(polyclonal anti-c-fos antibody, Cambridge사, Cheshire, UK)를 1：2,000의 농도로 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다.
하룻밤동안 반응을 한 절편은 PBS로 10분씩 세차례 행군 뒤 이차항체(biotin-labeled anti-sheep IgG)로 실온에서 한시간 동안 반응 시킨 뒤 PBS로 10분씩 세차례 행구고 streptoavidin-peroxidase conjugate(Vector, Ann Arbor, MI)에 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 DAB(0.05 % 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride/0.006% H2O2/0.05 M PBS, pH 7.4)용액에 약 5분 담구어 발색반응을 시키고 광학현미경하에서 면역조직화학적 염색 반응성을 관찰하였다. 위의 모든 과정은 PBS용액내에서 floating시켜 실행하였다.
결과
진자양 자극을 주지 않았던 정상대조군과 음성대조군 실험동물의 뇌간 전정핵에서는 Fos 단백의 발현이 없었고(Figs. 1, 2) 1.0 Hz와 1.5 Hz 속도의 자극을 90분간 준 12 마리의 실험 동물 중 1.5 Hz의 자극을 받은 동물 2마리에서 미약한 발현이 관찰되었으나 2.0 Hz의 회전 자극을 받은 동물에서는 8마리 중 7마리에서 우측 전정핵에서 Fos 단백의 발현이 관찰되었다.
종단 절편에서 Fos 단백의 발현양상
미로절제술을 시행한 좌측 뇌간의 전정신경핵에서는 Fos 단백이 발현되지 않았으나 내전정신경핵의 내측에 위치한 nucleus prepositus hypoglossi에서는 양측 모두 적은 수의 Fos 단백이 관찰되었다(Fig. 3).
상전정신경핵에서 Fos 단백의 발현은 신경핵의 전부위에 걸쳐 나타나는 것을 관찰할 수 있엇고(Figs. 3-5) 꼬리 방향으로 내려 오면서 상전정신경핵과 내전정신경핵의 등쪽(dorsal part of medial vestibular nucleus)에서는 Fos 단백의 발현이 관찰되었으나 배쪽 내전정신경핵(ventral part of medial vestibular nucleus)에서는 단백의 발현이 관찰되지 않았다(Fig. 5). 등쪽 내전정신경핵에서 관찰된 Fos 단백의 발현은 제4뇌실과 접하는 가장 상부에서 하전정신경핵과 접하는 꼬리 부분 전장에 걸쳐 나타났다(Figs. 3-5).
세 반규관의 구심성 신경다발이 모두 경유하는 것으로 알려진 간질핵(interstitial nucleus)에서는 Fos 단백이 발현되었으나(Fig. 6) 이석기관에서 오는 구심성 경로인 y-신경핵에서는 Fos 단백의 발현이 없었다. 거대세포가 많이 존재하는 외전정신경핵에서는 Fos 단백의 발현이 관찰되지 않았으나 하전정신경핵에서는 등쪽에서 배쪽을 향하여 신경핵의 전장에 걸쳐 퍼져 있는 Fos 단백의 발현을 관찰할 수 있었다.
횡단 절편에서 Fos 단백의 발현양상
종단 절편의 결과와 동일하게 미로절제술을 시행한 좌측 전정핵에서도 Fos 단백의 발현이 없었으나 말초 감각기가 정상인 우측 뇌간에서는 상, 내, 하전정신경핵에서 Fos 단백의 발현을 관찰할 수 있었다. 특히 등쪽 내전정신경핵과 하전정신경핵에서는 전장에 걸쳐 Fos 단백의 발현을 관찰할 수 있었으나 배쪽 내전정신경핵과 외전정신경핵에서는 Fos의 발현이 나타나지 않았다(Figs. 7-9). 이석기관의 구심성 경로인 y-신경핵에서는 단백의 발현이 관찰되지 않았다.
고안
말초 감각기에서 수용된 자극에 중추로 투사되는 경로를 확인하는 실험방법으로 가장 흔히 사용되는 추적물을 이용한 실험에서는 신경섬유의 종말부와 함께 섬유 전체가 염색되어 투사 방향과 주행을 알 수 있으나 Fos 단백의 발현만을 관찰한 경우에는 이러한 투사방향이나 주행에 대하여 알 수 없었고 Fos 단백이 발현된 신경세포가 말초 감각기에서 투사된 구심성 신경의 종말(termination)부인지 확인할 수 없는 단점이 있었다. 또한 Fos 단백이 발현된 전정신경세포의 수가 Gacek12)과 Lee, Park13)이 발표한 추적물을 이용한 결과에 비하여 매우 적은 세포에서만 관찰되었다. 미로절제술을 시행한 좌측의 commissural pathway는 구심성 경로가 차단되어 우측 전정핵에 영향을 미치지 못하나 우측 commissural pathway에 의한 좌측 전정핵에서의 Fos 발현이 예상되었으나 관찰되는 Fos 단백의 발현이 없었다. 이 사실은 정확한 이유는 알 수 없지만 Bullitt6)의 가정에 의하면 c-fos를 발현시키기 위하여 자극시간을 장시간 주었기 때문에 전정신경의 가소성에 의하여 적은 수의 신경만 반응하거나 아니면 특정 신경세포가 오히려 자극 역치가 낮아 쉽게 c-fos가 발현된 것으로 추정할 수 있다고 하였다. 또한 특별한 신경전달물질을 가진 신경세포나 특정 신경전달물의 수용체를 지닌 신경세포에서만 c-fos가 발현되기 때문에 자극 받은 전체 신경핵 중 일부에서만 Fos 단백이 발현되었을 가능성이 있다고 생각되었다.
세포내 접근법중 찰과상에 의한 신경 착색법은 착색되는 신경 세포의 수가 많고 중추 투사의 경로를 입체적으로 관찰할 수 있는 장점이 있으나14) 매우 세심한 조작이 필요하고 찰과상을 입은 정도에 비례하여 착색되는 신경 세포의 수가 결정되며 손상을 입은 말초 감각기의 구심성 신경 전달로에만 착색이 되므로 정상적인 자극에 의한 생리적 현상과는 차이가 있을 수 있다. 본 연구에서는 실험 동물의 뇌간을 장축에 대하여 수직, 수평으로 절단하여 뇌간 전정신경핵에서 발현되는 Fos 단백의 발현을 입체적으로 관찰하였기 때문에 비교적 투사경로를 이해하는데 도움이 되었으며 자극 후 관찰된 Fos 단백의 발현 위치가 여러 실험 방법에 의하여 알려진 구심성신경의 종말부와 일치하여 발현 됨을 알 수 있었다.
이와 Honrubia14)의 보고에서는 친칠라의 수평팽대 능선에 찰과상을 입힌 후 추적물인 HRP(horse raddish peroxidase)를 주입하여 관찰한 결과 상전정 신경핵의 중앙 및 꼬리 부위에서 많은 신경세포로 투사되는 것을 관찰하였으나 외측에는 투사되는 신경이 관찰되지 않았으며, 하신경핵에서는 머리 부위에서만 신경섬유의 투사를 관찰하였다고 보고하였다. 내측 전정신경핵에서는 꼬리쪽에서 구심성 전정신경이 투사되어 있었으나 배쪽 내측에 존재한다고 하였으나 본 실험에서 관찰된 Fos의 발현 부위는 내측 전정신경핵의 등쪽 부위는 전 신경핵의 상하축으로 전장에 걸쳐 고루 분포되어 있었으나 배쪽에서는 관찰되지 않아 본 연구의 결과와는 다른 결과를 보고 하였다. Lee 등13-15)은 일련의 보고에서 수평팽대 능선의 각기 다른 부위에 찰과상을 입혀 중추 투사를 추적한 결과 소뇌편엽(flocculus)쪽에서 투사된 구심성 신경은 내전정신경핵의 등쪽 외측으로 투사하고, 난원창쪽에서 투사된 신경은 배쪽 외측으로 투사된다고 보고하였다.
Gacek12)은 상전정신경의 신경절에서 상반규관과 수평반규관의 신경세포가 위치하는 주둥이(rostral)측에서 찰과상을 입혀 추적 관찰한 결과 상행신경섬유는 상전정신경핵의 중앙부에서 대부분 종말되며 일부는 신경핵의 외측과 꼬리 부분에서 종말한다고 보고하였으며, 하행신경섬유의 대부분은 외전정신경핵에서는 종말 없이 경유하여 내전정신경핵으로 들어가 등쪽에서 종말하는데 특히 제1형 유모세포를 지배하는 굵은 신경은 신경핵의 중앙부에 위치하는 큰 신경에, 제 2형 유모세포를 지배하는 가는 신경들은 신경핵의 변연부에 존재하는 작은 신경세포에 종말하며, 하행신경섬유의 분지들은 등쪽에 종말한다고 하였다.
신경활성의 표지자로서 Fos을 이용한 본 실험의 결과와 다른 추적물을 이용한 찰과상 실험결과의 차이점은 배쪽 내전정신경핵에서의 중추투사의 유무로 요약된다. Park과 Lee 등15)의 보고에 따르면 팽대능선의 주변부 중 전정창쪽에 찰과상을 입힌 후 추적물이 내전정신경핵의 배쪽으로 투사되는 것을 관찰할 수 있었다고 하였으나 본 실험의 결과 배쪽 내전정신경핵에서는 Fos 단백의 발현이 관찰되지 않았다.
등쪽 내전정신경핵은 동측의 흥분성신경섬유와 반대편 억제성 신경의 지배 받는데 이를 위하여서는 소뇌 피질을 통한 간접 투사와 교차연결신경계(commissural system)을 통한 직접적인 투사를 이용한다. 교차연결신경계는 배쪽 내전정신경핵에서 기원하며 GABA작용성 억제 중간신경원(GABAergic inhibitory interneuron)을 이용하여 반대편의 이차신경원(second order neuron)을 억제하는 기능을 한다고 알려져 있다.16)
배쪽 내전정신경핵은 전정안구반사(vestibulo-ocular reflex)와 전정척수반사(vestibulo-spinal reflex)에 관여하는 구조물로 교차연결신경계와 작용하여 말초전정기관 이외의 말초감각기에서 오는 자극에 의하여 활성화되며 동측 배쪽 내전정신경핵의 이차신경원으로 작용한다.16)
Goldberg와 Fernadez17)는 원숭이에서 반고리관이 자극될 때 방전상태가 회전방향에 따라 서로 다르게 나타나며 이때 규칙적으로 방전되는 신경말단과 불규칙적으로 방전되는 두 가지 유형이 있음을 보고하였다. Honrubia 등18)은 불규칙방전은 주로 굵은 신경섬유에서 일어나며 이 신경의 말단은 팽대부릉의 중앙부에 위치한다고 언급하였다. Fernandez 등19)도 팽대부릉의 위치에 따라 정보수용이 팽대능선 신경섬유의 굵기와 밀접한 관계가 있음을 보고하였다. Baird 등20)의 보고에 의하면 팽대부릉(crista ampularis)의 중앙부와 변연부에는 각기 다른 유모세포를 지배하는 다른 굵기를 갖는 신경섬유가 존재하며 이들은 회전자극에 각기 다른 반응을 하며 각 뇌간의 중추핵에도 서로 고유한 투사영역을 갖고 있으며 따라서 각기 다른 자극에 반응한다고 생각된다.
상기한 여러 보고들을 살펴보면 외측 팽대부릉의 중앙부와 주변부는 서로 굵기가 다른 신경섬유를 포함하고 있으며 이들은 각기 서로 다른 정보를 수용하여 이를 중추신경계로 전달하는 역할을 하고 있음을 알 수 있으며 이들 신경섬유들은 중추신경계의 전정핵에서도 서로 고유한 투사지역을 가지고 있는 것으로 생각된다. 본 연구에서도 배측 내전정신경핵에서 Fos 단백의 발현이 없었던 것도 이런 이유에 기인한다고 생각되며 이에 대하여 향후 더 많은 연구가 보완되면 신경 자극시 발현하는 초기유전자가 신경활성의 표지자로 유용한 도구가 될 수 있을 것으로 생각된다.
결론
실험 동물에 진자양가속자극을 주어 수평반규관을 자극한 뒤 뇌간의 전정핵에서 Fos 단백의 발현을 관찰하여 기존에 알려진 투사 경로와 비교한 결과 구심성 전정신경의 종말부에 일치하여 Fos 단백이 발현되어 Fos 단백의 발현이 신경세포의 활성 여부를 알려주는 표지자로서 기능을 가지는 것을 알 수 있었다. 그러나 추적물을 이용한 검사 결과와 비교한 결과 배측 내전정핵에서 발현이 없었고 구심성 신경의 투사 경로를 알 수 없으며 찰과상 뒤 염색되는 신경다발의 수에 비하여 발현되는 신경세포의 수가 적었던 점이 향후 Fos 단백의 발현을 신경활성을 관찰하는 표지자로 사용하기 위하여 보완되어져야 할 것으로 생각된다. 따라서 감수성이나 특이성을 높이는 방법에 대한 연구와 추적물을 이용한 신경염색의 결과와 차이에 대한 연구가 더 필요하다고 생각된다.
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