| Platelet Activating Factor Induced Maxillary Sinusitis in Rabbits. |
| Pil Seob Jeong, Chung Ku Rhee, Sea Yuong Jeon |
1Department of Otolaryngology-H & N Surgery, College of Medicine, Dankook University, Cheonan, Korea. psjeong@anseo.dankook.ac.kr
2Department of Otolaryngology-H & N Surgery, College of Medicine, Gyeongsang National University, Chinju, Korea. |
| 혈소판활성인자에 의해 유발된 실험적 상악동염 |
| 정필섭1 · 이정구1 · 전시영2 |
| 단국대학교 의과대학 이비인후과학교실1;경상대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| 주제어:
부비동염ㆍ혈소판활성인자ㆍ염증매개체. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Platelet activating factor (PAF) has been known to implicate one of potent inflammatory mediators and is reported to be involved in many pathologic processes, especially in inflammation and allergy. PAF has induced cytotoxic effects on the human paranasal sinus mucosa in vitro, showing ciliary inhibition, ciliostasis and cellular damage to the mucosal epithelium, in both dose and time dependent manners. However, the exact role of PAF in the pathogenesis of sinusitis is not yet known.
OBJECTIVE: The purpose of this study was to provide a new model of acute sinusitis by application of PAF into the maxillary sinus in rabbits.
MATERIALS AND METHODS:
Rabbits were divided into 2 groups.
Experimental groups were applied with 16 ng/ml of PAF into the maxillary sinus percutaneously. Control groups were applied with normal saline using the same technique as in the experimental groups. The presence of purulent secretion was observed in the nostril of rabbits, and the culture and smears of the secretions were performed. All of the mucosae were taken from the inferomedial wall of each sinus for light microscopy.
RESULTS:
Mucoid and purulent discharges were observed in rabbits of the experimental groups at 5 and 7 days after the application of PAF, respectively. Pasteurella multocida was found in the sinus content of experimental groups at 5 and 7 days. The prominent epithelial disruption and the infiltration of the inflammatory cells (predominantly eosinophils) into the epithelium and lamina propria were observed at 7 days in PAF-applied group.
CONCLUSION:
In this study, PAF induced sinusitis without occlusion of the natural ostium of the maxillary sinus in rabbits, therby providing another animal model of sinusitis for the understanding of the pathogenesis of sinusitis caused by inflammatory mediators. |
| Keywords:
SinusitisㆍPlatelet activating factorㆍInflammatory mediator |
서론
부비동염의 발병기전을 연구하기 위해서는 실험적 부비동염의 유발이 필수적이다. 현재까지 실험적 부비동염에 대한 동물실험은 Hilding1)이 가토 상악동의 자연공 부근에 비-상악동창을 만들어서 화농성 상악동염을 유발시킨 것을 시작으로, Maeyama2)가 2.5%의 난백알부민으로 감작시킨 가토의 상악동내에 포도상구균을 주입하여 발생한 부비동염의 병리조직학적 변화를 관찰하였으며, Kumlien과 Schiratzki3)는 가토의 부비동내에 이물(cotton wool)과 폐렴구균을 동시에 주입하여 부비동염을 유발시켰으며, Min 등4)은 상악동 자연공을 골편으로 폐쇄한 후 동시에 폐렴구균을 주입하여 급성 상악동염을 유발시켰다. 송과 성5)이 자연공에 대한 조작없이 대장균의 내독소를 상악동에 직접 주사하여 급성부비동염을 일으켰으며, 정 등6)은 중비도를 통해 자연공에 Merocel(을 삽입한 후 자연공을 폐쇄하여 부비동염을 유발시켰다. 이러한 기존의 방법들은 부비동염의 유발에 있어서 자연공의 폐쇄와 세균 주입이 필수적 이었다. 그러나 이 방법들은 자연공을 인위적으로 폐쇄하여야 하고 세균을 주입하여야 하므로 상악동을 노출할 때 이로 인한 상악동 자체의 손상 및 이차적 염증을 유발할 가능성이 있고 또한 세균을 상악동내에 주입하는 것은 부비동염 발병에 있어 자연적이지 못하여 실제 부비동염의 치유과정을 이해하는데 한계가 있다.
현재까지 부비동염의 발병기전에 있어 염증매개체들의 작용기전이 아직 정확히 규명되어 있지 않다. 점액섬모계(mucociliary system)는 호흡기의 중요한 방어기전이다. 호흡기의 중요한 방어기전인 점액섬모계에 최근 여러가지 염증매개체가 관여한다고 밝혀져 있다.7)
혈소판활성인자는 염증과 알레르기에 관여하는 강력한 염증매개체이다. 혈소판활성인자는 사람의 부비동 점막에 세포독성을 유발하여 시간과 농도에 비례하여 섬모억제, 섬모정체(ciliostasis), 그리고 점막상피의 세포손상을 나타낸다.8) 또한 혈소판활성인자는 호산구에 대한 강력한 화학주성인자로 작용하며, 기도 호산구증(airway eosinophilia)을 유발하며,9)10) 혈소판활성인자를 국소적 또는 전신적으로 투여하였을때 혈소판활성인자는 호흡상피의 염증성 변화를 유발한다.11)
염증매개체에 의해 유발된 실험적 부비동염의 모델이 아직 보고된 바가 없다. 혈소판활성인자와 같은 염증매개체에 의한 실험적 부비동염의 모델은 기존의 실험적 부비동염 모델에서 인위적으로 시행한 자연공 폐쇄 및 균 주입 없이 부비동염을 유발함으로서 부비동염의 발병기전에 있어 염증매개체의 역할을 규명하고, 나아가 부비동염의 치료방법을 개선하는데 필요한 기초자료를 제공한다고 사료된다.
본 연구의 목적은 혈소판활성인자에 의해 유발된 실험적 상악동염의 모델을 제시하고자 함이며 이를 위하여 저자는 혈소판활성인자를 가토 상악동내에 경피적으로 주입한 후 1, 3, 5, 7일째에 외비공의 분비물 유무와 상악동을 개방하여 점막병변의 육안적 소견, 병리조직소견 및 균주배양소견 등으로 상악동염의 발병여부를 확인하였다.
연구대상 및 방법
연구대상
실험동물로는 체중 2.0∼3.0 kg의 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 백색 가토 32마리를 사용하였으며, 이들을 대조군 8마리와 실험군 24마리로 나누어 실험기간중에는 단국대학교 의과대학 동물사육장에서 토끼류 표준실험사료로 동일한 조건하에서 사육하였다.
연구방법
혈소판활성인자에 의한 상악동염 유발
실험군은 24마리의 가토를 6마리씩 4개의 아군으로 나눈 후, 한쪽 상악동에 비배부의 털을 제거하고 1% povidone iodine으로 소독한 뒤 혈소판활성인자(L-α-phosphatidylcholine, β-acetyl-γ-O-alkyl, chloroform solution -2 mg/ml, Approx. 99%, Sigma, St. Louis, Missouri) 16 μg/ml 용액 1 ml를 상악동에 경피적으로 천자주입하였다. 시간대별로(1일, 3일, 5일, 7일) 비강의 분비물을 관찰하고, 상악동을 개방하여 상악동내 분비물의 유무를 관찰하였다. 상악동내 점막을 채취하여 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
대조군은 8마리의 가토를 2마리씩 4개의 아군으로 나눈 후, 한쪽 상악동에 생리식염수 1 ml를 경피적으로 상악동에 천자주입한 것을 사용하였다.
상악동 점막의 병리표본 제작
광학현미경 관찰용 표본제작
적출한 상악동 내측벽을 10% 포르말린에 24시간 고정한 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 4∼5 μm의 두께로 박절하여 인접한 2개의 절편을 얻고 이 2개의 절편을 100 μm 간격으로 3군데에서 얻어 모두 6개의 절편중 연속된 2개의 절편을 선정하여 hematoxylin-eosin으로 염색하였다.
병리조직학적 검색
상악동 점막의 병변을 섬모소실, 염증세포의 침윤, 상피세포 탈락, 점막하 조직의 부종 및 혈관 또는 분비선의 증식 등의 항목으로 구분하여 검색을 실시하였다.
섬모소실과 상피세포의 탈락은 표본의 5% 미만의 병변시 mild, 5∼20% 일때 moderate로 하였으며, 20% 이상이면 severe로 하였다.12) 염증세포의 침윤은 상피하 조직에 국한되어 드물게 관찰되는 경우를 mild, 상피층 및 상피하 조직의 대부분이 염증세포로 침윤되어 있으면 severe로 하였고, 중간소견을 moderate로 하였다.12) 점막하 조직의 부종, 혈관 또는 분비선의 증식은 정도에 따라 mild와 moderate로 구분하였다.12)
균주배양검사
생리식염수를 상악동내로 주입한 대조군과 혈소판활성인자를 주입한 실험군에서 각각 시간대별로 상악동을 개방한 후 상악동 점막에서 분비물을 채취하여 blood agar 및 MacConkey agar 배지를 이용하여 7℃에서 48시간 배양하여 균주배양검사를 시행하였다.
통계처리방법
대조군과 실험동물군 사이의 상악동염 발생빈도를 비교하기 위하여 X2 test를 이용하여 p-value를 구하였으며 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.
결과
육안적 소견
실험 제 7일까지 총 32마리의 실험동물중 실험기간동안 사망한 예는 없었다.
생리식염수를 주입한 대조군에서는 8마리 전부에서 육안적으로 비공의 분비물을 관찰할 수 없었다. 혈소판활성인자를 주입한 실험군중 1일째에는 육안적으로 비공의 분비물을 관찰할 수 없었으며, 3일째에는 6례중 3례(50%)에서 약간의 장액성 분비물이, 5일째에는 6례중 5례(83.3%)에서 점액성의 분비물이, 7일째에는 6례중 6례(100%) 모두에서 백색농성의 분비물이 관찰되었다.
상악동을 개방하여 상악동내의 분비물 형성을 관찰한 결과, 대조군에서는 7일째까지 분비물을 전혀 관찰할 수 없었나, 실험군에서 혈소판활성인자를 주입한 후 1일째, 3일째에는 상악동내에 분비물을 관찰할 수 없었으나, 5일째에는 6례중 5례에서 점액성의 분비물을, 7일째에는 6례중 6례(100 %) 모두에서 백색농성의 분비물이 관찰되었다(Table 1)(Fig. 1). 육안적으로 관찰한 상악동 자연공은 대조군에서는 종창소견이 관찰되지 않았으나, 실험군 5, 7일째에서 대조군에 비하여 자연공의 종창이 관찰되었다.
광학현미경 관찰소견
생리식염수를 주입한 대조군에서 시간대에 따른 상피세포의 변화와 염증세포의 침윤은 관찰할 수 없었고, 일정한 방향으로 배열된 섬모경계(ciliary border)를 가진 상피층과 상피하 결체조직 및 분비선으로 구성되어 있으며 점액분비세포는 대략 상피층세포 10∼20개당 1개씩의 비율로 드물게 관찰되었다.
혈소판활성인자를 주입한 1일 표본에서는 대조군과 같이 섬모소실 및 상피세포 탈락, 염증세포의 침윤소견은 보이지 않았다(Fig. 2A).
혈소판활성인자를 주입한 3일 표본에서는 6례중 3례에서 경미한 섬모소실을 보였고, 상피세포의 탈락 및 염증세포의 침윤은 6례 전부에서 관찰되지 않았다(Fig. 2B).
혈소판활성인자를 주입한 5일 표본에서는 6례중 5례에서 중증도의 섬모소실을 보였으며, 상피세포의 탈락은 6례중 3례에서 경미한 소견을 보였고, 염증세포의 침윤은 6례중 1례에서 경미하게관찰되었다(Fig. C).
혈소판활성인자를 주입한 7일 표본에서는 6례중 6례 모두에서 중증도 이상의 섬모소실소견, 상피세포의 탈락소견, 염증세포의 침윤을 보였다(Table 2)(Fig. 2D). 점막하 조직의 부종, 혈관 또는 분비선의 증식은 혈소판활성인자를 주입한 3일, 5일, 7일 표본에서 모두 mild 이상의 소견을 보였다.
혈소판활성인자로 유발된 상악동염의 상악동내 균주배양검사 소견
대조군에서는 전례에서 균을 발견할 수 없었으며, 실험군에서는 5일째에는 6례중 5례에서, 7일째에는 6례중 6례 전부에서 Pasteurella multocida가 관찰되었다.
고안
혈소판활성인자와 같은 염증매개체로 부비동염을 유발한 실험적 부비동염의 모델은 현재까지 보고되어 있지 않다. 그러나 Rhee 등13)은 친칠라에서 이관을 결찰하지 않고 혈소판활성인자만을 중이강내에 주입하여 삼출성중이염을 유발하였음을 보고하였다. 본 실험에서는 염증매개체중 하나인 혈소판활성인자를 가토의 상악동내 경피적으로 주입하여 자연공의 폐쇄나 세균주입 없이 실험적 부비동염을 유발할 수 있었다.
혈소판활성인자는 히스타민과는 달리 이미 생성된 염증매개체가 아니라 알카리성 pH에서 자극에 대해 여러가지 염증세포들로부터 새로 생성되는 염증매개체이다. 혈소판활성인자를 생성하고 분비하는 세포들에는 호염기구, 혈소판, 중성구, 호산구, 단핵구, 비만세포, 폐포대식세포, 혈관내피세포, 상피세포 등이 있으며,8) 이것은 종(species)에 특이(specific)하다.9) 가토에서 혈소판활성인자의 세포공급원은 혈소판, 중성구, 단핵구, 호염기구 등이다. 혈소판활성인자가 세포로부터 분비되면 이들 염증세포의 대부분을 활성화하여 양성 되먹이기 현상(positive feedback phenomena)을 유발한다.10) 여러가지 염증매개체들중에서 혈소판활성인자를 사용한 이유는 친칠라에서 중이강내에 혈소판활성인자를 주입하면 중이 정화작용이 지연되고,14) 이관을 결찰하지 않고 단지 혈소판활성인자만 중이강에 주입해서 삼출성 중이
염을 유발할 수 있기 때문에,13) 여러 염증매개체들중 역가(potency)가 가장 강력하다고 알려진 혈소판활성인자를 사용하였다. 또한 본 연구에서 부비동염을 유발하기 위하여 혈소판활성인자 16μg/ml을 주입하였는데, 그 이유는 Rhee 등15)이 기니픽 이관에서의 혈소판활성인자에 의한 점액섬모운동 실험에서 16μg/ml에서 점액섬모운동이 가장 지연되었기 때문이다.
기존에 발표된 실험적 부비동염의 모델에서는 자연공의 폐쇄와 세균주입을 동시에 시행하였다. 자연공이 개방된 상태에서는 세균 주입만으로 부비동염이 발생할 가능성은 희박하다고 하였다. 그 이유는 자연공이 개방된 상태에서 점액섬모운동이 정상이라면 부비동내로 침투한 세균은 자연공을 향하여 계속 운동하는 섬모에 의하여 단시간내에 비인강으로 배출되므로 실제 세균이 점막과 접촉하는 시간이 매우 짧아서 점막내로 세균의 침입이 침투도 불가능하여 염증을 일으키지 못하기 때문이다.16) 그러나 Kumlien 등3)의 보고에 의하면 일측 부비동염이 정상 자연공을 갖는 반대측으로 확산되는 경우, 부비동내 이물을 넣어 유발시키는 경우, 그리고 치성 부비동염과 알레르기성 부비동염인 경우 등에는 상악동 개구부가 정상이더라도 부비동염이 유발될 수 있다. 그러므로 자연공의 폐쇄 및 세균의 주입만으로는 부비동염의 병인을 완전히 규명할 수 없다. 본 실험에서도 자연공을 폐쇄하지 않고 혈소판활성인자만을 주입하여 부비동염을 유발할 수 있었는 데 이것은 혈소판활성인자가 체내에서 매우 빨리 대사되어 혈액으로부터 정화되며 혈중에서 혈소판활성인자의 반감기는 약 30초이므로,17) 매우 짧은 시간에 점막에 작용하여 정상적인 점액섬모운동이 파괴되고, 이로 인해 분비물의 정체 및 염증세포의 침윤이 유발되어 지속적인 혈소판활성인자의 분비가 다른 염증세포들에 의해 활성화되어 악순환이 지속된 것으로 추정된다. 또한 분비된 혈소판활성인자는 염증반응을 촉진시키고, 지속하게 함으로써 이로 인해 자연공 폐쇄가 부분적으로 유발되어 부비동염이 더 악화될 것으로 사료된다.
자연공 폐쇄로 인한 실험적 부비동염의 유발기간에 대한 연구를 보면 histoacryl로 자연공을 폐쇄하면 5일째에 장액점액성 분비물만 발생하였고 급성 세균성 상악동염은 유발되지 않았으며,16) 상악동 자연공을 Merocel (로 폐쇄시킨 경우 3일째와 1주째 점액농성분비물이 관찰되었으며, 2주, 3주, 및 5주에는 상악동내에 모두 농이 관찰되었다.18) 그러나 본 실험에서는 자연공개구부를 폐쇄하지 않고 혈소판활성인자만을 경피적으로 주입하여 약 일주일만에 6례 모두에서 화농성부비동염이 발생하였다.
농성상악동염이 생긴 가토의 임상소견으로는 일측성 비루, 재채기, 때때로 부종 등의 증상이 있다고 보고되고 있다.3)4) 본 연구에서는 상악동의 임상증상으로 재채기는 관찰할 수 없었으나 농성부비동염이 있는 가토의 경우 외견상 외비공의 털이 누렇게 변색되거나 외비공으로 분비물 및 농이 나오는 것을 볼 수 있었다. 비루는 하얀 점액성 또는 장액성으로서 사람의 화농성 부비동염시에 관찰되는 푸른색의 농성비루는 관찰할 수 없었다. 본 연구에서 생리식염수를 주입한 대조군에서는 전례에서 외비공으로의 분비물을 관찰할 수 없었으며, 혈소판활성인자를 주입한 실험군중 7일째에 6례중 6례(100%) 모두에서 농성 분비물을 관찰할 수 있었다.
급성부비동염의 병리학적인 소견으로는 광학현미경관찰상 상피하 부종, 소정맥(venule)의 확장, 배세포(goblet cell)의 형성, 섬모의 융합 및 탈락, 상피세포의 괴사 및 궤양, 중성구, 임파구, 형질세포, 거식세포 등의 염증세포의 침윤, 편평상피로의 이행 등이 보고되고 있다.2)4) 본 연구에서는 혈소판활성인자를 주입한 실험군에서 섬모소실은 3일째부터 나타나기 시작하여, 5일째에 더 심한 섬모소실의 소견을 보였고, 상피세포의 탈락은 5일째부터 나타나기 시작하여 7일째에 더욱 심하게 나타났다. 배세포(goblet cell)의 증식과 염증세포의 침윤소견은 5일째에 나타났으며, 침윤된 염증세포중 대부분이 호산구였으나 일부에서는 중성구가 관찰되었으며 이것은 혈소판활성인자에 의한 화학주성(chemotaxis)의 효과로 추정된다. 이러한 염증세포는 상피하 조직 뿐만 아니라 상피내로의 침윤과 일부에서는 상악동내로의 침윤을 관찰할 수 있었다.
Hagan19)은 성인 가토의 90%에서 비강에 Pasteurella multocida를 보유하고 있다고 보고하였으며, Weisbroth 등20)은 통상적으로 사용되는 가토의 대부분에서 상기도에 Pasteurella 감염이 있다고 보고하였다. 그러므로 가토에서 수술적인 조작후 높은 감염율을 보이는 이유는 가토에서 흔한 지방병성 비균주인(common endemic nasal pathogen)인 Pasteurella multocida에 의해 부분적으로 유발된다. 본 실험에서 부비동염이 발생한 상악동내에서 분비물에 대한 균배양을 실시한 결과 모두 Pasteurella multocida가 검출되었는데 이는 자연공이 혈소판활성인자에 의해 유발된 점막부종으로 기존에 실험동물이 보유하고 있는 Pasteurella multocida 균에 의한 이차적인 감염일 것으로 추정된다.
결론
가토 상악동내 주입된 혈소판활성인자는 자연공의 폐쇄나 세균의 주입없이 실험적 부비동염을 유발하였다. 혈소판활성인자로 유발된 부비동염은 자연공 폐쇄나 세균주입을 필요로 한 기존의 실험적 부비동염 모델과는 다른 새로운 모델로서 향후 염증매개체에 의한 부비동염의 발병원인에 대한 이해와 그 발병의 예방 및 치료에 기여하리라고 사료된다.
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