In vivo Effect of Systemic pam-idronate Disodium on bo_ne Resorption in Experimental Cholesteatoma.

Kim, Hyung Jong; Kim, Jin Hwan; Hu, Jin; Yoon, Tae Hyun; Jun, Byung Hun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(9); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(9): 1111-1117.

In vivo Effect of Systemic pam-idronate Disodium on bo_ne Resorption in Experimental Cholesteatoma.

Hyung Jong Kim, Jin Hwan Kim, Jin Hu, Tae Hyun Yoon, Byung Hun Jun

¹Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. hjk1000@www.hallym.or.kr
²Department of Otorhinolaryngology,College of Medicine, Ulsan University, Seoul, Korea.
³Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Inje University,Seoul, Korea.

Pamidronate Disodium의 전신적 투여가 실험적 진주종에 의한골 흡수에 미치는 <i>in vivo</i> 효과

김형종¹ · 김진환¹ · 허 진¹ · 윤태현² · 전병훈³

한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;울산대학교 의과대학 이비인후과학교실2;인제대학교 의과대학 이비인후과학교실3;

주제어: Pamidronate disodiumㆍ실험적 진주종ㆍ골흡수.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Bone resorption of adjacent structures in aural cholesteatoma is mostly responsible for serious complication of the disease. Recent researches have been aimed at preventing bone resorption with tools of non-surgical therapy. The effect of pam-idronate disodium on systemic bone resorption is mainly attributed by its function against osteoclast recruitment and activation. In this study, we investigated the effect of systemic pam-idronate disodium on localized osteoclastic bone resorption in experimental cholesteatoma. MATERIAL AND METHODS: Experimental cholesteatomas were induced in 40 mongolian gerbils. pam-idronate disodium (Aredia(R), Ciba-Geigy Limited)were injected subcutaneously once a week in 20 gerbils (treated group)and none were injected in the other 20 gerbils (untreated group). pam-idronate disodium were injected with a dose of 2 mg/kg in 10 of the treated group (low dose group) and with a dose of 4 mg/kg in the remainder (high dose group). Gerbils were sacrificed at 12 weeks (3 month group) or 17 weeks (4 month group) after the injection. Harvested temporal bones were examined by light microscope and transmission electron microscope.
RESULTS:
The clinical stage of cholesteatoma tended to be more advanced in the untreated group than in the treated group although it was not statistically significant. Scores of osteoclast number per total bone length in millimeter were lower in the treated group than in the untreated, although the percentage of surface occupied by osteoclasts per total bone surface were not different between the groups.
CONCLUSION:
These results will provide fundamental data for further studies on the prevention and treatment of osteoclastic bone resorption in aural cholesteatoma.

Keywords: Pamidronate disodiumㆍCholesteatomaㆍbone resorptionㆍOsteoclast

서론 중이 진주종은 우리 나라 인구의 약 0.5%의 유병률을 보이는 비교적 흔한 만성 질환으로1) 주변 조직을 파괴하며 심각한 합병증을 초래할 수 있어 반드시 수술적 방법으로 제거하여야 하는 질환 중 하나이다. 대부분의 중이 진주종에 의한 합병증은 주변 골 조직의 파괴에 기인하므로 이 과정을 차단할 수 있으면 병변을 수술적 방법으로 제거하지 않더라도 심각한 합병증으로 부터 위협받지 않는 상태를 유지할 수 있을 것이다. 그러나 아직까지 중이진주종에서 임상적으로 사용되어 골 흡수 억제 효과가 증명된 약제는 알려진 것이 없다. 진주종에서 골 파괴를 일으키는 주 원인인 골 흡수(bone resorption) 기전에 관해서는 크게 나누어 물리적 압력에 의하여 골 괴사를 초래한다는 가설과 상피하조직에서 분비되는 cytokine 등 체액에 의해 발생한다는 가설로써 설명하고 있다. 그 중 후자는 단핵구나 각질세포에서 생성된 cytokines에 의하여 파골 세포(osteoclast)의 활동이 활발해지고 이에 따라 국소에서 분비된 프로스타글란딘이 골 흡수를 초래한다는 가설이다. 따라서 특정 cytokines이나 프로스타글란딘의 약리 과정을 차단하는 물질을 사용하면 중이진주종에 의한 골 흡수를 예방할 수 있다는 가정을 할 수 있다. 프로스타글란딘 E2는 arachidonic acid 합성경로 중 cyclo-oxygenase 경로에서 합성되는 내인성 물질이며, 골 흡수를 일으키는 진주종조직 및 염증육아조직에서 증가된다고 알려져 있다. 또한, 중이진주종에서 실험적으로 cyclooxygenase 억제제인 indomethacin을 사용하였을 때 골 흡수가 in vivo2) 및 in vitro3)에서 억제되었다는 보고가 있었다. 그러나 cyclo-oxygenase 억제제는 장기간 임상적으로 사용할 때 부작용을 초래하기 때문에 실용성에는 한계가 있다. Bisphosphonates는 골 기질과 결합하여 골 재형성(bone remodeling)에 관여하는 특성으로 실제로 임상에서 골다공증 예방 및 치료제로서 사용되고 있고 이 약제의 골 흡수 억제작용은 in vivo와 in vitro 의 연구에서 증명되어 있다.4)5) pam-idronate disodium(이하 pam-idronate)은 bisphosphonate 계열 중 하나로 이독성이 가장 미약한 것으로 증명된 바 있다.6) 본 연구에서는 pam-idronate를 전신적으로 투여하였을 때 실험적으로 유발한 중이진주종의 국소부위에서 골 흡수가 억제되는지 여부와 정도를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 실험동물로는 60∼90일 된 mongolian gerbils(body wt 50∼60g, male) 40마리를 사용하여 Kim과 Chole의 방법7)으로 우측 귀의 외이도를 폐쇄하여 진주종을 유발시켰고, 좌측 귀는 대조군으로서 관찰하였다. 그 중 20마리는 진주종 유발 후 아무 처치 없이 12주 또는 17주에 희생시켜 조직을 채취하였고, 10마리는 진주종 형성이 뚜렷해지는 유발 후 3주부터 1주일 간격으로 저 농도(2mg/Kg)의 pamidronate disodium(Aredia(, Ciba-Geigy Limited, 이하 pamidronate)을 피하 주사하였고, 10마리는 동일한 시간계획에 의하여 고농도(4 mg/Kg)의 pamidronate를 피하 주사한 후 각 군을 진주종 유발 후 12주 또는 17주에 희생시켜 측두골 조직을 en bloc 채취하였다. 희생시킨 다섯 동물 당 네 마리는 광학현미경 표본을 제작하였고, 한 마리는 투과전자현미경 표본을 제작하였다(Fig. 1). 광학현미경표본 제작방법은 10% phosphate buffered formalin 용액으로 심장 관류한 후 1.35N HCl＋0.003M chelating agent(Cal-X( , Fisher Scientific Product) 용액으로 탈회하였고, 연속 알코올로 탈수한 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직은 4 μm의 횡단면으로 절단하여 와우 축에 평행되게 절편을 얻었고, Hematoxylin & Eosin 염색하여 광학현미경하에 검색하였다. 전자현미경표본은 2% glutaraldehyde 와 2.5% paraformaldehyde의 혼합용액(0.1M cacodylate buffer at 7.4)으로 심장관류 고정한 후 0.1M EDTA in 5% glutaraldehyde 용액으로 2주간 탈회하여 2% OsO4로 2시간동안 후고정하였고, 아세톤으로 탈수한 후 Epon-Araldite(r)((Electron Microscopic Science)에 포매하여 제작하였다. 고막 윤에 근접한 외이도 골부를 포함한 부분을 시계 톱으로 절단 분리하여 Reichert ultratome으로 90nm의 절편으로 만들었고, copper grids에 올려놓고 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 투과전자현미경(JEOL(r), JEM-1200EXII) 하에 관찰하였다. 진주종 조직에서 pamidronate에 의한 진주종의 성장과 골 흡수 억제 정도를 검정하기 위해 각 군에서 진주종의 병기(stage)7-9), 각질형성(keratin formation), 상피의 과성장(hyperplasia), 골 파괴 정도(bone resorption), 신생골 형성(new bone formation)을 비교하였다. 또한, 병리조직절편을 비디오카메라(Olympus( U-VPT)가 부착된 광학현미경(Olympus( BX50)과 image analyzer 프로그램(Optimas Pro(, version 6.5)을 사용하여 파골 세포의 활성도를 측정함으로써 각 군간에 골 흡수 정도를 비교하였다. 파골 세포의 활성도로서 osteoclast number/total bone length in millimeter(NOc/TL)는 진주종의 중앙부를 지나는 횡단면에서 4 μm 두께로 연속된 5장의 조직 절편을 얻어 H&E 염색한 후 측정된 외이도의 단위 길이(mm) 당 파골 세포의 수의 평균으로서 하였고, osteocl-ast surface/total bone surface(Ocs/BS)는 연속된 5개의 조직절편에서 각각 측정한 외이도 골부의 길이와 골 부를 덮고 있는 파골 세포의 길이를 평균한 값의 비율로 하였다. 이 결과를 실험적 진주종군과 정상 대조군간에 비교하였고, 약제를 투여한 군(치료군)과 투여하지 않은 군(비치료군), 3개월 군과 4개월 군, 그리고 저농도 투여 군과 고농도 투여 군간에 유의한 차이가 있는지 통계학적으로 검정하였다(p<0.05). 결과 Mongolian gerbil의 외이도 결찰 방법에 의해서 진주종 병변이 일관성 있게 형성되었고(Fig. 2A), 고막의 외이도측 편평상피가 기저막을 뚫고 상피하조직으로 유두양으로 침입하는 것이 흔히 관찰되었으며, 기저세포 과증식에 의해서 고막 천공 혹은 중이강으로 이동되는 부분을 관찰할 수 있었다(Fig. 2B). 진주종의 성장에 미치는 pamidronate의 효과 진주종의 병기는 3개월 군보다 4개월 군에서 높았고, 치료 군보다 비치료 군에서 병기가 높은 경향을 보였으나 통계학적으로 유의하지는 않았다(Fig. 3). 병리조직학적 검색상 상피의 과성장과 골 파괴 정도 및 신생골 형성은 병기와 비례하여 3개월 군보다 4개월 군에서 높았으나 치료 군과 비치료 군간 그리고 저용량치료 군과 고용량치료 군간의 차이는 발견되지 않았다(Table 1). 진주종에서 파골 세포의 활성 억제에 미치는 pamidro-nate의 효과 파골 세포는 진주종 상피하조직에서 골 흡수가 일어난 erosion pit(Howship’s lacuna)에서 발견되고 골 표면과 사이에 ruffled border가 있는 다핵성 세포이다(Fig. 4). 파골 세포의 활성도 즉, osteoclast number/total bone length in millimeter(NOc/TL) 및 osteoclast surface/total bone surface(Ocs/BS)는 진주종군에서 정상 대조군보다 높게 관찰되었다. 또한, pamidronate로 치료한 진주종 군과 치료하지 않은 진주종 군간에 NOc/TL이 치료한 군에서 유의하게 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 같은 군간에 Ocs/BS의 차이는 보이지 않았고 3개월 군과 4개월 군간에 또는 저용량 투여군과 고용량 투여군간에 NOc/TL 및 Ocs/BS 각각 모두에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 5). 고찰 Bisphosphonates의 골 흡수 억제기전은 cyclooxygenase 억제제와는 달리 골 기질의hydroxyapatite 결정과 직접 결합함으로써 mineralization을 억제한다고 알려져 있고, 파골 세포에 직접 작용하여 프로스타글란딘 생성을 억제하는 역할에 관해서도 보고되었다.4)5)전신적 bisphosphonates 투여에 의한 국소 부위에서의 골 흡수 억제작용은 타 연구자에 의해 이미 증명되어 있어4) 중이진주종과 같은 국소적 골 파괴 질환에서도 이 물질을 임상적으로 적용할 수 있을지 여부에 관심이 집중되고 있다. pamidronate는 현재 임상에서 전신적 골다공증의 치료제로써 사용되고 있는 bisphosphonates 계열 중의 하나로 전신적 투여시 demineralization에 의한 자연 골절의 가능성 때문에 임상적 사용에 다소 제한이 있다. 전신적 골 흡수 억제제인 bisphosphonates를 생분해성 고분자 가공법을 응용한 국소지향성 약물전달체계를10) 사용하여 국소에서 사용 가능한 형태로 개발할 수 있다면 국소병변에서 골 흡수를 억제하는 효과를 기대하여 볼 수 있을 뿐 아니라 전신적 투여에 따른 부작용도 낮출 수 있어 중이 진주종뿐만 아니라 국소적 골 흡수를 일으키는 모든 질환에서 치료제로써 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 다만, 국소지향성 골 흡수 억제제로써 사용의 전제 조건으로 동 물질을 국소 부위에 투여하였을 때 이독성과 같은 부작용을 일으키지 않음이 증명되어야 하고, 전신적 투여에 의해 혈청 중 일정 농도를 유지하였을 때 국소 병변에서 골 흡수를 비롯한 병변의 억제 효과가 있음이 밝혀져야 한다. 저자들은 이미 여러 계열의 bisphosphonates의 이독성 검사를 통하여 pamidronate가 가장 미약하고 가역적인 변화를 보였음을 밝힌 바 있다.6) Mongolian gerbil에서 외이도 결찰법에 의한 진주종 모델은 사람의 중이 진주종보다는 외이도 진주종과 발생 기전의 유사한 점이 있으나 진주종에 의한 골 파괴에 관한 연구를 위한 가장 적합한 동물 모델로 알려져 있다.7-9) 본 연구에서도 진주종 유발 후 시간에 비례해서 병변이 진행되고 일관성 있게 골 파괴 병변을 보여 연구의 목적에 부합하는 동물 모델이었다고 생각된다. 또한, 병리조직학적으로 고막의 외이도측 편평상피가 기저세포 과증식에 의해서 고막천공을 일으키거나 중이강으로 이동되는 부분이 드물지 않게 관찰되어 중이진주종의 발생기전 중에 상피이동설을 뒷받침하고 있었다. 파골 세포는 염증반응 등에 의해서 골 주변에 일시적으로 나타나는 대식세포이고 국소적 골 흡수에 관여하며 acid phosphatase를 분비한다고 알려져 있다. Chole11)에 의하면 파골 세포가 중이 진주종에 의한 국소적 골 흡수 기전에 중심적 역할을 한다고 하며 이 질환에 의한 골 파괴를 예방하기 위해서는 파골 세포가 어떻게 활성화되고, 어떤 화학주성(chemotaxis) 및 동원(recruitment) 기전이 관여되는지에 대한 이해가 필요하다고 하였다. 한편, Thomsen 등12)은 진주종 주위의 골 주변에서 발견되는 염증세포는 많은 미토콘드리아를 포함하는 조직구라고 하였고, Abramson 등 13)은 단핵구가 진주종에 의해 활성화되지만 골 흡수 현상은 림프구와 주위 결체조직에서 분비되는 cytokines에 직접 영향을 받는다고 하여 중이 진주종의 국소 골 흡수 기전에서 파골세포에 의한 역할은 현재 논란이 있는 상태이다. 그러나, 수술장에서 채취한 사람의 진주종 조직에서는 수술전의 치료로 대부분 염증이 조절된 상태이기 때문에 파골세포가 관찰되지 않은 경우가 많지만, 염증이 조절되지 않은 동물 모델의 진주종에서는 일관되게 파골세포가 관찰할 수 있었다는 점과 파골세포의 관찰을 위해서는 적절한 조직표본 제작법이 필요하다는 점을 들어 중이 진주종에 의한 골 흡수 기전에서 파골세포의 역할을 배제할 수는 없다고 하였다.14) 본 연구에서는 국소적 골 흡수를 정량적으로 비교하는 방법으로 타 연구자에 의해서 이미 확립되어 있는 파골세포의 활성도를 측정하는 방법2-4)을 응용하였으며, 본 연구 결과에서 파골세포의 활성도가 진주종 군에서 정상 대조 군에 비하여 통계적인 의의는 없지만 높게 측정되었고 진행된 진주종일수록 더 높은 경향을 보여 진주종에 의한 국소적 골 흡수를 정량적으로 비교하는 법으로써 파골세포의 활성도를 측정하는 것은 적절하였다고 생각된다. 본 연구 결과에서 pamidronate를 전신적 투여한 군이 동 약제를 투여하지 않은 군에 비하여 진주종의 국소 병변에서 파골세포의 수는 감소하였고, 파골세포의 크기는 차이가 없는 것으로 관찰되었다. 파골세포의 수가 감소하였음은 약제의 효과를 반영한 것이나 파골세포 크기의 차이가 없는 결과는 예상치 못한 것이다. 이것의 이유로서 본 연구에서 관찰기간이 충분히 길지 않아 조직을 채취한 시점이 파골세포의 동원(recruitment)만 일어나고 성숙(maturation)이 진행되기 전이었을 가능성과 사용한 약제의 농도 또는 용량이 충분하지 못하였을 가능성을 배제할 수 없다. 또한, 약제의 치료 기간이나 용량에 따른 차이도 관찰되지 않아 정확한 기전을 설명하기 위해서는 추가 연구를 통해 밝혀야 할 것으로 생각된다. 반면, 부분적으로 약제의 효과가 입증되었고, 동 약제에 의하여 병변의 진행정도(병기)도 억제되는 경향을 보여 국소 투여에 의해서 국소 병변 부위에서 오랫동안 고농도의 약효를 유지할 수 있는 방법을 쓴다면 좀 더 확실한 결과를 얻을 수 있을 것이라고 기대된다. 그러므로 본 연구의 결과는 국소 골 흡수 억제제 pamidronate가 중이진주종 환자에서 치료제로써 사용할 수 있을 것이라는 가능성을 시사하는 결과라고 생각된다. 본 연구의 결과는 중이진주종의 치료에 새로운 방향을 제시할 수 있는 기초 자료가 될 것이며, 좀 더 나은 약물전달체계의 연구를 자극하는 시발점이 될 수 있을 것으로 기대된다. 현재 저자들은 국소지향성 약물전달체계를 응용하여 개발한 pamidronate를 국소 투여한 후 골 흡수 억제효과를 밝히려는 연구를 진행하고 있으며 그 결과의 귀추가 주목된다. 결론 본 연구에서는 실험적 중이진주종에 pamidronate disodium 을 전신적으로 투여하였을 때 병변의 진행이 억제되는 경향을 보였고, 약제 치료 군에서 비치료 군에 비해 부분적으로 파골세포의 활성도가 억제되는 결과를 얻었다. 다음 과제의 목표는 국소지향성 약물전달체계를 응용하여 개발한 약제를 국소투여 후 다시 골 흡수 억제효과를 증명하는 것이다. 본 연구의 결과는 중이진주종에서 새로운 치료법을 개발하는 연구의 시발점이 될 수 있을 것으로 생각한다.
REFERENCES
1) Kim CS, Jung HW, Hong SH, Nam BH, Oh SH, Kim IT, et al. A prevalence study of otitis media and related diseases in Korea in 1991. Korean J Otolaryngol 1993;36:459-65. 2) Adachi K, Chole RA. Indomethacin inhibition of middle ear bone resorption. Arch Otolaryng Head Neck Surg 1991;117:267-9. 3) Jungkeit MC, Chole RA. Ibuprofen inhibits localized bone resorption in the middle ear. Calcif Tissue Int 1991;48:267-71. 4) Adachi K, Chole RA. Inhibition of osteoclast recruitment at a local site by 1-hydroxyethylidene-1,1-bisphosphonate (HEBP). Ann Otol Rhinol Laryngol 1990;99:738-51. 5) Richardson AC, Tinling SP, Chole RA. Risedronate activity in the fetal and neonate mouse. Otolaryngol Head Neck Surg 1993;109:623-33. 6) Kim HJ, Park IS, Lim HJ. Ototoxicity of bisphosphonates in guinea pigs. Korean J Otolaryngol 1998;41:307-12. 7) Kim HJ, Chole RA. Experimental aural cholesteatomas in mongolian gerbils. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998;107:129-34. 8) Park HJ, Chun YM, Park KH. Experimentally induced aural cholesteatoma in the gerbil. Korean J Otolaryngol 1995;38:330-3. 9) Kim CS, Chung JW, Choi SH. Distribution cytokeratins in cholesteatomas according to the induction period of cholesteatoma in gerbil. Korean J Otolaryngol 1997;40:76-81. 10) Yuk SH, Cho SH, Shin BC, Lee HB. A novel semi-interpenetrating networks system as an absorbent material. Eur Polym J 1996;32:101-4. 11) Chole RA. Cellular and subcellular events of bone resorption in human and experimental cholesteatoma: The role of osteoclasts. Ann Otol Rhinol Laryngol 1984;94:76-95. 12) Thomsen J, Bretleau P, Jorgensen B. bo_ne resorption in chronic otitis media. The role of cholesteatoma, a must or an adjunct? Clin Otolaryngol 1981;6:176-86. 13) Abramson M, Huang CC, Shirahata Y. The specificity of bo_ne destruction in cholesteatoma. In: cholesteatoma and mastoid surgery. Amsterdam: Kugler Publication;1982. p.413-7. 14) Chole RA. Osteoclasts in chronic otitis media, cholesteatoma, and otosclerosis Ann Otol Rhinol Laryngol 1988;97:661-6.