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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(8): 971-975. |
| Expression of Receptor Tyrosine Kinases in the Guinea Pig Cochlea. |
| Byung Don Lee, Young Jin Park, Hyuck Soon Chang, Hee Young Ahn, Ju Won Kang |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Soonchunhyang University, Seoul, Korea. bdlee12@hosp.sch.ac.kr |
| 기니픽 와우에서 성장인자 수용체의 분포 |
| 이병돈 · 박영진 · 안희영 · 장혁순 · 강주원 |
| 순천향대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
성장인자 수용체ㆍ세포의 정보전달계ㆍ와우의 재생. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Damage in the auditory sensory epithelia is irreversible and the resulting hearing loss is permanent in mammals. Nevertheless, mammals like birds can recover their auditory function anatomically and physiologically after the sensorineural hearing loss. One of the functions of a receptor tyrosine kinase is to controll the cellular metabolisms like motility, growth, differentiation, regeneration, and ion transport via various pathways. There are no reports on the distribution of receptor tyrosine kinases in the guinea pig cochlea. The purpose of this study is to evaluate the expression of the fibroblast growth factor receptor (FGFR) and transforming growth factor receptor (TGFR-beta, type II ) in the cochlear sensory epithelia of guinea pigs.
MATERIALS AND METHODS:
We investigated the immunoreactivity and functional roles of the receptor tyrosine kinases-FGFR and TGFR-beta (type II) - by using surface preparation technique in the cochlea of the Preyer's positive, pigmented guinea pig.
RESULTS:
The results showed that receptor tyrosine kinases were expressed in the cytoplasm of Deiter's and Hensen's cells to FGFR and TGFR-beta (type II), and the stereocillia of inner and outer hair cells to FGFR by surface preparation technique.
CONCLUSION:
The findings suggest that receptor tyrosine kinases are involved in the cellular growth, differentiation and regeneration in the cochlear supporting cells, and ion transport in the hair cells of the mammals. We found that receptor tyrone kinases are not related to outer hair cells participating in the PLCgamma1-IP3 second messenger system. |
| Keywords:
Receptor tyrosine kinaseㆍSignal transductionㆍAuditory regeneration |
서론
포유류에서 와우 유모세포는 태생기에 발달이 완성되어 일생을 통하여 재생이 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 특히 음향, 염증, 약제 혹은 노화로 인한 유모세포의 비가역적 손상은 영구적인 감각 신경성 난청을 유발하게 된다. 1981년 Corwin 1)이 어류에서 손상받은 유모세포의 재생을 시사한 이래, 어류와 파충류 등에서도 유모세포가 완전히 재생된다는 보고 2)가 있었고 1987년 Cruz 등 3)은 조류에서 이독성 약제 투여 후 유모세포의 재생을 확인하였다. 포유류의 경우에는 최근까지도 유모세포의 재생이 일어나지 않는다고 생각하였으나 1993년 Lefebvre 등 4)이 포유류에서도 Retinoic acid 투여 후 유모세포가 조직학적으로나 생리학적으로 재생된다고 하여 손상된 청력의 치료 가능성을 시사하였다. 그리고 그 재생된 세포의 기원 및 분자 생물학적 기전이 확실치 않으나, 기원이 지주세포일 가능성이 높다고 알려져 있다. 이에 저자들은 유색 기니픽 와우에서 세포의 운동, 성장, 분화, 재생 및 이온 수송 등의 정보 전달계 및 대사에 관여하는 성장인자 수용체(Receptor Tyrosine Kinases, 이하 RTKs) 5)의 발현 양상을 알아보고 포유류 와우 유모세포의 재생에 관한 연구의 기초로 삼고자 하였다.
대상 및 방법
이개반사 양성 반응을 갖는 300∼350 gram의 유색 기니픽을 사용하였다. 30% chloral hydrate(2 mg/Kg)를 복강내 주사하여 마취시키고 흉강을 연 후, 0.1 M phosphate buffered solution(pH 7.5, 이하 PBS)과 4% paraformaldehyde를 각각 100 ml를 좌심실을 통해 관류 고정하였다. 단두 후 otic capsule을 열고 등골을 적출하고 정원창과 와우의 apical turn의 골편을 제거하여 24시간 동안 4% paraformaldehyde로 와우를 재고정하였다. 와우 고정 후 면역조직화학 염색을 위해 실체 줌현미경과 드릴을 사용하여 와우의 외측벽과 혈관조를 박리하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 8% bovine serum albumin(이하 BSA)으로 2시간 반응시킨 후, 일차 항체는 다클론성 IgG rabbit anti-chicken 섬유아세포 성장인자 수용체 항체(rabbit polyclonal IgG, Anti-chicken FGF Receptor, residues 119-114 of the deduced cDNA sequence of the extracellular domain of the chicken FGF receptor, Upstate Biotechnology. Inc., U.S.A) 및 rabbit anti-human 형질변환인자 수용체 항체(rabbit polyclonal IgG, Anti-Human TGF-β Receptor, type II, the first 28 N-Terminal residues of the mature human TGF-β receptor, Upstate Biotechnology. Inc., U.S.A)를 각각 1%의 BSA로 1：50과 1：5로 희석하여 4℃에서 12시간 배양하였고, 이차 항체는 일차 항체에 상응하는 Vectastain Elite ABC kit(Vector Laboratories, U.S.A)로 상온에서 반응시킨 후, DAB(Dako Corp.)로 3∼5분 발색시켰으며, 각 반응마다 PBS로 5분간씩 3회 총 15분 동안 세척하였다. 염색된 와우를 실체 줌현미경하에서 개막을 분리하고 와우 감각상피 조직을 한 회전씩 잘라낸 후 AquaPoly/mount(Polysciences. Inc., Warrington)에 12시간 상온 고정 후, 현미경으로 관찰하였다. 대조 염색은 일차 항체를 생략하고 상기의 과정을 반복하였다.
결과
유색 기니픽에서 면역조직화학적 염색에 의한 중간 회전부위에서 와우 감각상피의 표면조직을 관찰한 바, 내,외유모세포의 부동섬모에서 섬유아세포 성장인자 수용체 항체에 대한 강한 면역반응을(Fig. 2), 지주세포인 Deiter씨 및 Hensen씨 세포의 세포질에서는 섬유아세포 성장인자 수용체 항체(Fig. 3) 및 형질변환인자 수용체 항체(Figs. 4 and 5)에 대한 강한 면역반응을 보였으나 내, 외유모세포에서는 면역반응을 보이지 않았다.
고찰
본 연구는 성장인자 수용체 항체를 이용하여 포유류인 기니픽 와우에서 감각상피세포의 면역조직화학 반응을 보는 것으로 인간을 비롯한 포유류와 조류는 출생전에 내이의 감각상피세포가 완성되나 어류나 파충류의 경우에는 일생동안 재생능력이 있다는 것으로 보고되었다.2) 최근까지 대부분의 와우 감각상피의 재생에 대한 연구는 조류인 닭에서 행하여 진 바, 저자들은 포유류인 기니픽을 대상으로 세포 대사에 중요한 역할을 담당하는 RTKs의 발현 양상을 보고 향 후 내이 손상 후의 조직학적 및 청각학적 회복이 가능한 지를 알고자 함에 있다.
세포의 정보 전달계(cellular signal transduction system)는 세포외 분자를 세포 내로 전달하는데 세포막의 매개체인 G 단백질과의 결합에 의하거나, 폴리펩티드인 성장인자(Tyrosine kinase, 이하 TK)등이 그의 특수한 수용체에 부착하여 세포의 성장, 분화, 대사 및 항상성을 조절한다.5)
TK는 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor, EGF), 인슐린양 성장인자(Insulin like growth factor, IGF), 혈소판유래 성장인자(Platelet growth factor, PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor, 이하 FGF) 등으로 구성되어 있으며 조직의 재생과 유지에 기본적인 역할을 담당하고 있다.5)
RTKs에는 상피세포 성장인자 수용체(Epideraml growth factor receptor, EGFR), 인슐린 수용체(Insulin receptor, IR), 인슐린양 성장인자 수용체(Insulin like growth factor receptor, IGFR), 혈소판유래 성장인자 수용체(Platelet growth factor receptor, PDGFR) 및 섬유아세포 성장인자 수용체(Fibroblast growth factor receptor, FGFR) 등이 있으며 각 수용체는 여러 종류의 아형이 존재한다. RTKs의 구조는 크게 세포외 영역, 세포막 통과 영역, 그리고 세포내 영역 등 3부분으로 구성되어 있는데, 이 중 TK의 촉매 기능을 가지는 카르복시 말단을 함유하는 세포내 영역은 세포내 표적 단백질에 생물학적 신호를 전달하여 세포의 성장, 유사 분열, 형질 변환 및 분화를 일으키며 때로는 억제하기도 한다.5)
TK-RTKs 복합체로 ligands-stimulated RTKs는 카르복시 말단부위의 tyrosine 잔기에 자기인산화(autophos-phorylation)가 일어나는데 Phospholipase Cg(PLCg)의 SH-2 영역에 부착하여 활성화된 후, IP 3와 Ca 2+의 유리, Diacylglycerl의 생성, Protein kinase C(PKC)의 활성화로 이루어지는 2∼3분 이내의 ‘rapid response’와 그외의 여러 경로를 거쳐 수시간의 반응을 필요로 하는 ‘delayed response’로 나뉘어진다. 6) ‘rapid response’는 Na +/H + 교환 및 Ca 2+이온의 유입을 유도하며, 직접 혹은 Ca 2+ ATPase를 통한 Na + / K +-ATPase의 활성화 및 adenylate cyclase를 통한 Na + / Cl -/ K +의 co-transport, 그리고 H +/HCO3 - 수송 등의 이온 활성화와 이로 인한 세포 골격의 변화를 유발시켜 세포의 운동에 참여를 하는 반응이며7) ‘delayed response’는 polyamine의 합성, 해당작용, 리보솜 단백질 S6의 인산화, 단백질, RNA 및 DNA의 합성에 관계하는 반응으로 signalling cascade를 활성화시키게 되며 이때 TK가 세포의 생존에 양성 신호와 분화의 조절에 참여한다.8)
본 연구에 사용된 RTKs로는 FGFR과 TGF-βR(type II)가 항체로 사용되었는데 각각의 TK와 그의 RTKs에 대해 간단히 요약하면, 첫째, 대부분의 조직에서 세포의 증식과 분화를 촉진시키는 대표적 유사분열 물질인 FGF는 7개의 아형이 존재한다. 산성 섬유아세포 성장인자(acidic fibroblast growth factor, aFGF, FGF-1)는 뇌와 망막에서, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF, FGF-2)는 중배엽과 신경 외배엽 조직에서 분리되었는데 염기성이 30~100배의 보다 강력한 기능을 가지고 있다. 그의 기능으로는 다른 TK와 마찬가지로 DNA 합성에 관여하거나, 아미노산 및 당질의 흡수를 촉진하여 세포 재생을 자극하고 분화를 유도하거나 억제시키기도 하는데, bFGF는 나선신경절 세포의 발달을 촉진한다.9) 특히 염기성의 기능은 세포 성장을 증가시키고 플라즈미노겐 활성 물질 및 콜라게나아제의 유도를 증가시키며 빠른 신생 혈관화, 섬유화 및 천공된 고막을 치유를 유도한다.10) FGF에 부착하는 FGFR은 1형에서 4형까지 4종류가 있다. 둘째로, 세포의 증식, 분화 및 화학 주성을 촉진하고 억제하는 형질변환인자(Transforming growth factor, TGF)는 a와 b의 2가지 아형으로 나뉘어 진다. TGF-α는 EGF와 40%에서 동일 구조를 가지며 같은 수용체를 공유한다. 오늘날 발견된 상피세포 성장의 가장 강력한 자연적 억제제인 TGF-β는 1983년 Assoian 등11)이 인간의 혈소판에서 추출한 단백질로 TGF-α와는 구조 및 생물학적 특성이 다르다. TGF-β의 아형으로는 β1에서 β5까지 5종류가 있으며 이 펩티드는 서로 60~80%의 동일 구조를 가진다. 12) TGF-β의 정보 전달 기전에 대해서는 아직 완전히 알려져 있지 않지만 in vitro에서 DNA 복제, 세포분열, 세포부착 등으로 세포의 성장을 자극 또는 억제하는 기능이 있으며 분화를 촉진하거나 차단하기도 하면서 세포의 기능을 조절한다. 이때 세포 주기의 G1기를 연장시키거나 중지시키는 기능을 가지고 있으며, 이는 인산화를 억제시키므로써 일어나게 된다.13) 또 TGF-β1은 EGF 결합이나 EGF와 관련된 성장 반응인 세포형질막의 H +/Na + antiport, c-fos와 c-myc의 발현, PKC의 활성화 및 리보솜 S6의 인산화의 과정없이 EGF에 의해 유발되는 증식을 억제한다.14) 태생기와 성장 조직에서 광범위하게 분포하는 TGF-βR의 종류에는 I형, Ⅱ형, Betaglycan(Ⅲ형) 및 GH3 단백질 등이 있으며, I형과 II형은 정보 전달, Betaglycan은 TGF-β의 저장과 이동의 기능을 가지고 있으나 GH3 단백질은 아직 기능이 알려져 있지 않다. TGF-βR의 세포에 대한 정보 전달은 TGF-β와 마찬가지로 잘 알려져 있지 않지만, 혈관 내피세포에서 cAMP의 증가, 해당 작용의 활성화, 아미노산의 흡수, 세포내 Calcium 치와 phosphatidyl inositol의 교체에 작용한다.15)
이미 알려진 위의 일반적 TK-RTKs의 세포 대사가 과연 와우의 감각상피계와 외측벽의 모든 세포에서 일어나는지 보고된 바 없으며 그의 중요성 또한 검증되지 않은 실정이므로, 본 연구에서는 성장인자 수용체에 대한 정상 기니픽에서 그의 발현 양상과 함께, 본 저자들의 와우 감각상피세포에서 PLC 아형에 대한 연구16)에서 PLCγ1이 내, 외유모세포에서는 염색되지 않았음을 보고하였기에 성장인자 수용체와 PLC-IP3 second messenger system과의 상관관계에 대한 기초를 삼고자 한다.
조류와 포유류의 와우 유모세포는 발생기 첫 2 /3 기간이나 생후에 바로 완성되고 한번 외상을 받으면 비가역적 변화를 일으켜 영구적인 손상이 남게 된다. 그러나 어류와 파충류의 경우, 일생을 통해 유모세포가 생성 및 증가되고 자가 치유 과정을 가지고 있으며 지주세포는 태생 후에도 계속해서 증식되고 손상된 세포 역시 재생이 된다고 증명되었다.1)2) 조류의 경우 1987년 Cruz 등3)이 닭에서 이독성 약제 투여 후 기저유두(basilar papillae)의 유모세포가 재생됨을 처음 보고하였고 새로운 유모세포의 기원은 지주세포일 가능성이 높다고 하였다. 이를 뒷받침하는 연구로는 [3H]thymidine과 5-bromo-2’-deoxyuridine(BrdU)을 이용하여 재생 과정의 DNA 합성이 지주세포에서 일어남을 관찰하였다.17) 어린 닭에서 소음 자극이나 아미노그리코사이드 투여 후 유모세포의 부동섬모가 완전 소실된 후 새로운 부동섬모가 생성됨을 증명하여 유모세포의 재생이 일어남을 암시하였으나, 노화 조류에서는 부동섬모의 재생이 일어나지 않아 재생과정이 나이와 관계가 있음을 시사하였다.17) 손상된 청각기능은 1982년 Saunders와 Tilney18)가 처음 보고한 이래, 유발반응역치를 이용하여 1985년 Cousillas와 Rebillard19)가 병아리를 대상으로 청각기능의 회복됨을 증명하였다.
포유류의 경우에는, 1993년전 까지만 해도 유모세포의 재생은 일어나지 않는다고 생각하였으나 1993년 Lefebvre 등4)이 새끼 쥐에서 이독성을 일으킨 후 retinoic acid를 투여하여 유모세포의 재생을 촉진하였다고 보고하여 포유류에서도 유모세포가 재생된다는 설을 처음 제기하였는데, 이러한 사실은 포유류에서 유모세포의 재생을 유발시키는 분자를 발견한다면 농 치료에 획기적인 전기를 마련하는 것을 의미하는 것이라고 하겠다.
본 저자들의 연구 결과에서 나타난 FGFR과 TGFR-βR(type II)에 대한 와우 감각상피세포 중에서 내, 외유모세포가 아닌 지주세포인 Deiter씨 및 Hensen씨 세포에서 강양성 반응을 보인 것으로 보아 성장인자는 지주세포를 통해 세포의 분화, 증식, 재생 및 억제를 유지, 조절한다는 이론을 뒷받침한다고 생각된다. 그러나 본 연구의 FGFR의 경우, 유모세포의 부동섬모에서 강한 양성반응을 보인 것이 Lee와 Cotanche 등20)이 정상 닭에서 부동섬모의 기저부에서 양성 반응을 확인한 것이나 Corwin 등17)의 이론인 부동섬모 역시 와우의 재생에 참여하는 것인지는 앞으로 다른 종류의 성장인자 수용체 항체를 이용하여 그의 발현양상과, 인위적으로 와우에 손상을 준 후, 재생과정에 대한 조직학적 및 청각학적 연구를 통해 증명해야 될 것으로 생각하며, 부동섬모가 유모세포의 흥분기에 K+ 이온이 내림프액에서 유모세포로 유입이 되는 장소이기에 TK의 역할중의 하나가 이온 수송에 있으므로 부동섬모에서도 양성 면역반응을 일으키지 않았나 생각된다. 그리고 성장인자 수용체 항체가 내, 외유모세포에는 염색반응을 보이지 않았다는 사실은 ‘rapid response’의 반응으로 지주세포에서도 이온 수송을 담당하여 세포의 모양을 변화시켜 내, 외유모세포에 PLCγ1의 경로를 통한 간접적인 기계적 운동능을 전달하는 기능도 동시에 가지고 있다는 사실에 주목할 필요가 있다고 생각한다. 또한 앞으로 와우 외측벽에서의 발현 양상을 보아 내림프액의 생성에 있어서 각 세포들 사이에서의 정보 전달계에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
결론
포유류인 정상 유색 기니픽에서 면역조직화학적 염색을 통하여 세포막에 존재하는 RTKs(섬유아세포 성장인자 수용체 및 형질변환인자 수용체)의 발현을 관찰한 바, 와우 감각상피중에서 내, 외유모세포의 부동섬모, 지주세포인 Deiter씨와 Hensen씨 세포에서 양성 반응이 발현됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 조류에서 손상된 와우의 회복이 지주세포에서 유래된다는 실험적 사실이 포유류에서도 적용될 수 있음을 시사되며, 그의 기전이 명확하지 않으나, 지주세포를 통한 이온 수송으로 인하여 와우의 내, 외유모세포에 이차적인 세포 운동능을 유발시키는 작용을 함과 동시에, 정보 전달계를 통한 손상된 와우 감각상피세포의 분화, 성장 및 대사를 유도한다고 사료된다. 하지만 와우 감각상피세포의 재생에 있어서 내, 외유모세포의 부동섬모의 역할과 정보 전달계의 기전에 대해서는 향 후 연구가 있어야 된다고 생각된다.
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