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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(7): 846-850. |
| Detection of Haemophilus Influenzae and Streptococcus Pneumoniae by Polymerase Chain Reaction (PCR) in Chronic Otitis Media with Effusion (OME). |
| Young Chul Choi, Yong Soo Park, Sang Won Yeo, Sa Yong Chae, Dae Gun Jung, Sung Won Kim |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, School of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. ent39825@unitel Co.kr |
| 소아의 삼출성 중이염에서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용한 Haemophilus Influenzae와 Streptococcus Pneumoniae의 검출 |
| 최영철 · 박용수 · 여상원 · 채세용 · 정대건 · 김성원 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
삼출성 중이염ㆍ중합효소 연쇄반응ㆍ폐렴연쇄상구균ㆍ헤모필루스 인플루엔지균. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Otitis media with effusion (OME) is one of the major causes of hearing loss in childhood. The pathogenesis still remains unclear, although it is closely related to bacterial infections. Thus, it is necessary to develop a sensitive and specific method to detect of bacteria in OME in order to examine the relationship between bacterial infection and the pathogenesis of OME. To determine if the polymerase chain reaction (PCR) can detect bacterial DNA in pediatric middle ear effusions that are sterile by standard cultural methods.
MATERIALS AND METHODS:
total of 52 middle ear effusions were collected from pediatric patients during myringotomy and the ventilation tube insertion. All patients had failed multiple courses of antimicrobial therapy. PCR and the conventional culture method were applied to detect Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae in the middle ear effusions.
RESULTS:
Of the 52 specimens of OME, 3 (6%) tested positive by culture for Staphylococcus aureus, 1 (2%) for Gram positive bacilli. H. influenzae and S. pneumoniae were not detected by culture in all samples. But 32 (61.5%) were positive for H. influenzae and 7 (13%) for S. pneumoniae by PCR. The positive rate was significantly greater with PCR than with the culture method.
CONCLUSION:
The PCR assay is useful to detect middle ear pathogens of OME, even in the "sterile" fluids by the conventional bacterial culture. PCR positive specimens from the middle ear pediatric patients are suggestive of bacterial infections. |
| Keywords:
Polymerase Chain ReactionㆍOtitis Media with EffusionㆍHaemophilus influenzaeㆍStreptococcus pneumoniae |
서론
삼출성 중이염은 최근에 그 빈도가 높아지고 있으며 유소아의 가장 흔한 청력 장애의 원인이 되고 있으나, 청력 손실을 일으키는 주 원인으로서 정확한 기전과 병인에 대해서는 명확하게 밝혀져 있지 않다.1)2) Senturia등3)이 상당수의 중이 삼출액에서 세균이 검출됨을 보고한 후, 세균 감염이 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있으며 중요 원인균으로 H. influenzae, S. pneumoniae등이 보고되고 있으나, 급성 중이염과는 달리 세균 배양 검사에서는 각각 2∼15%와 3∼6% 정도만 배양되는 것으로 알려져 있어 세균 감염과 삼출성 중이염 사이의 병인론을 밝히는데 보다 민감성 및 특이성이 높은 검출 방법이 필요 하게 되었다.4-6)
이에 저자들은 삼출성 중이염 환아의 중이내 저류액을 채취하여 세균 배양 검사와 중합효소 연쇄반응을 시행하여 두 방법 사이에서의 병원균 검출의 유용성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
1994년 10월부터 1997년 8월까지 가톨릭 대학교 의과대학 부속 성모자애병원 이비인후과에 내원한 환아중 만성 삼출성 중이염 진단으로 약 3개월간 약물 치료를 받았으나 치료에 효과가 없는 1세에서 8세(평균 75개월) 환아 52명을 대상으로 전신마취하에 고막천자를 시행하고 Juhn Tym-Taps(Xomed Treace Products, Jacksonville, FL)로 중이내 저류액을 채취하여 실험 재료로 사용하였다. 채집된 저류액은 면봉 배양하고 나머지 액은 -60℃ 냉동고에 보관하였다.
방법
세균 배양
일반 세균 배양에 쓰이는 blood agar 배지 및 MacConkey agar 배지를 사용하였고 H. influenzae와 S. pneumoniae 배양을 위해 각각 chocolate agar 배지 및 sheep’s blood agar와 chocolate agar 배지를 사용하였다.
DNA의 추출
보관된 저류액에 500 μl의 proteinase K를 Eppendorf tube에 섞어 37℃에서 하루동안 배양하고 약 9분간 100℃로 끓인 후 실온으로 식혔다. 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol(25：24:1)을 섞어 10,000 rpm으로 10분간 원심 분리를 시행하였다. 원심 분리한 시료에 동량의 chloroform과 isoamylalcohol을 섞어 10분간 다시 원심 분리를 시행하였다. 시료에 2배의 cold alcohol과 0.1배의 3 M sodium acetate를 섞어 -60℃ 냉동고에 2시간 저장 후 Inverter centrifuge with refrigerator에서 4℃, 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 실온에서 건조시키고 50 μl TE buffer(pH 7.2)을 더해 DNA를 분리하였다.
중합효소 연쇄반응
중합효소 연쇄반응을 위하여 다음의 primer를 사용하였다. H. influenzae의 검출을 위해 P6 단백질의 염기 서열 10)을 이용하였으며, S. pneumoniae는 PBP 2B의 염기 서열16)을 사용하였다(Table 1).
50 μl의 반응 혼합물(template DNA 0.5 μl, 1 μM up-stream primer, 1 μM downstream primer, TaKaRa-ExTagTM Buffer 5 μl, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 4 μl 및 증류수)을 만든 후 증발을 방지하기 위하여 1∼2 방울의 미네랄 오일을 얹었다. DNA thermal cycler(Perkin-Elmer Cetus Instrument)를 사용하여 변성(denaturation), 결합(annealing), 중합(polimerization)의 세 단계를 35주기 시행하였다(Table 2). 정제된 influenzal 및 pneumococcal DNA(H. influenzal；AT-CC 9327, S. pneumoniae；YHCC 610, 유한양행)를 양성대조군으로 살균된 증류수를 음성 대조군으로 각각 사용하였다.
중합효소 연쇄반응(PCR)의 산물을 검출하기 위하여 각각 5 μl의 증폭된 검체를 전기영동(8% Polyacrylamide gel electrophoresis을 시행 하였으며 이때 marker로는 Molecular Weight marker(Boehringer Man- nheim, Germany)를 사용하였다.
통계 방법
Chi-square 검증법을 이용하였으며 유의 수준은 95%로 하였다.
결과
삼출성 중이염 환아 52명의 중이내 저류액 세균 배양 검사상 3례에서 Staphylococcus aureus와 1례에서 G(＋) bacilli가 검출 되었으며 H. influenzae와 S. pneumoniae는 검출 되지 않았다. 중합효소 연쇄 반응의 산물을 전기 영동한 결과 H. influenzae는 52례중 32례(61.5%)에서, S. pneumoniae는 7례(13%)에서 DNA band를 확인하였으며 세균 배양 검사와 비교하여 모두 통계적으로 유의하게 높은 검출율을 나타 내었다(p<0.05)(Table 3)(Figs. 1 and 2)
고찰
만성 삼출성 중이염(otitis media with effusion)은 고막의 천공을 나타내지 않고 중이강내에 장액성 또는 점액성의 저류액이 지속되는 질환으로, 항생제 및 수술 방법의 발전에 힘입어 화농성 중이염의 빈도는 감소 추세에 있으나 삼출성 중이염의 경우 오히려 증가하는 경향이 있어 소아 난청 및 언어 장애의 중요한 원인이 되고 있다.2)7)
삼출성 중이염의 정확한 기전이나 병인에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 일반적으로 감염 및 이관 기능의 저하가 삼출성 중이염의 병인에 크게 관련된 것으로 알려져 있는데 이는 상기도 감염, 아데노이드 증식증, 구개열, 기압외상(barotrauma)등과 관계있다.2) 급성 중이염의 재발후 삼출성 중이염으로의 이행 빈도가 높고 상기도 감염후 빈발하는 것으로 보아 세균 감염이 중요한 원인의 하나로 여겨져 왔으나, Senturia등 3)에 의해 점액성 중이내 저류액의 약 25%, 장액성 중이내 저류액의 약 35%에서 배양된 세균이 검출되기 전까지 중이내 저류액은 멸균 상태인 것으로 알려졌었다. 그리고 중이 점막의 조직학적 연구 및 중이내 저류액의 세포학적 검사 결과등이 삼출성 중이염의 병인에 대한 세균 감염의 중요성을 뒷받침하고 있다.1)8) H. influenzae, S. pneumoniae와 Moraxella catarrhalis가 주된 원인균으로 알려져 있지만 배양 되는 빈도가 각각 2∼15%, 3∼6%와 1∼7%로 중이내 저류액의 약 60∼80%가 일반적으로 사용되어지는 세균 배양에 음성 반응을 보여 세균 배양의 진단적 가치에 대하여 의문이 제기되어 왔다. 4)5)9) 삼출성 중이염에 있어서 중이내 저류액의 세균 배양 음성 빈도가 높은 이유는 고막 절개 및 통기관 삽입술 전에 다양한 항생제의 사용으로 병원균의 증식이 현격히 감소하며,5) 만성인 경우 병원균 자체가 성장이나 증식이 느려져 결국 세균 배양에 실패하게 되는데 이는 세균 증식 과정을 막는 항생제에 대한 반응이 감소될 뿐만 아니라, 중이내 저류액 속에 있는 분비성 면역글로불린과 항균효소인 lysozyme이 병원균 및 바이러스들의 증식을 억제시키기 때문이라고 보고되고 있다. 6)
중합효소 연쇄반응은 목적으로 하는 DNA를 2종의 primer와 내열성의 DNA polymerase를 사용하여 시험관내에서 DNA 합성 반응을 반복함으로써 목적으로 하는 DNA 단편을 수십만배 증폭시키는 반응으로 미정제된 DNA나 부분 정제된 DNA로부터 목적의 염기 배열을 증폭시킬 수 있다는 특징이 있다.10)
중합효소 연쇄반응은 1986년 Mullis에 의해 개발된 이후로 특정한 유전자의 증폭이 가능하므로 감염성 인자의 검출에 민감하게 반응을 보일 수 있어 각종 유전병의 진단 및 검색등에 사용되어,10) 바이러스성 질환 및 병원균의 증명에 사용되어져 왔다. Ketel등11)이 H. influenzae의 외막 지질단백인 16.6-kDa의 P6 단백질의 염기 서열을 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 뇌수막염 환자의 뇌척수액에서 H. influenzae DNA band를 처음으로 검출해 냈고, Ueyama등12)은 이를 삼출성 중이염 환자의 중이내 저류액에 적용하여 세균 배양과 비교하여 61.5%의 높은 검출률을 나타내었다. 한편 Virolainen등15)과 Jero등4)에 의해 삼출성 중이염 환자의 중이내 저류액에서 S. pneumoniae종의 특이 단백 독소인 pneumolysin의 염기 서열을 이용한 S. pneumoniae의 검출이 이루어 졌다. 본 연구에서는 PBP 2B의 염기 서열을 사용하였고 13%의 양성 반응을 보여 진단적 방법으로서 세균 배양 방법에 대해 우위성을 입증하였다. 소아 삼출성 중이염에서 DNA의 발현은 수술 당시 또는 수술 수일내에 생존가능한 세균이 있음을 시사한다.5) 그리고 Post등9)이 삼출성 중이염에 이환된 chinchilla 모델을 이용하여, 정제되거나 살균된 세균의 DNA는 중이내 저류액에서 3일 이후에는 검출되지 않았으며 항생제로 치료한 세균의 DNA는 21일 이상 검출이 가능했다고 보고하며 중이내 저류액에서 병원균의 DNA가 검출되는 것이 활동성 세균 감염 과정을 설명할 수 있다고 하였다.
이상에서와 같이 중합효소 연쇄반응은 감염성 질환에 대한 진단적 방법으로 병원균 검출에 유용하지만 체액내에 존재하는 heme이나 urea같은 중합효소 억제제 등에 의한 가음성 반응 및 DNA 오염으로 인한 가양성 반응을 나타낼 수 있고 항생제 감수성 검사가 불가능 하며 비용이 많이 드는 등의 문제점 들을 갖고 있다.4)11) 그러므로 최근에는 guanidinum thiocyanate acid extractes와 proteinase K 처치와 같은 병원균 DNA 추출에 대한 분자 생물학적 방법의 개발14)과 Kwok등15)이 제시한 가양성 반응을 줄이는 방법등의 사용으로 검출 과정의 오염을 최소화하여 반응의 민감도 및 특이도를 높히고, 이를 이용한 백신의 개발과 같은 예방에 목적을 둔 면역학적, 역학적 연구가 이루어지고 있다. 12)14)
결론
삼출성 중이염 환아 52례의 중이내 저류액에서 세균 배양과 중합효소 연쇄반응을 이용하여 원인균의 검출을 시도하였으며 세균배양에서는 나타나지 않았던 H. influenzae와 S. pneumoniae가 중합효소 연쇄 반응에서는 각각 61.5%와 13%의 검출율을 나타내었다. 이상의 결과로 중합효소 연쇄반응은 세균 배양검사에서 균이 검출되지 않은 경우에 삼출성 중이염의 원인균을 찾는데 도움이 되며, 세균감염이 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
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