| Immunohistochemical Study between Extracellular Matrix Protein Tenascin and T Lymphocytes Distribution in Cholesteatoma. |
| Yong Gi Kim, Young Gyun Park, Sung Hyun Kim, Nam Yong Doh, Bong Nam Choi, Doh Young Lee, Sung Chul Lim |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chosun University, Kwangju, Korea. kyg33@chollian.net
2Department of Pathology, College of Medicine, Chosun University, Kwangju, Korea. |
| 중이 진주종에서 세포외 기질단백 Tenascin과 T 림프구 분포의 상관관계에 대한 연구 |
| 김용기1 · 박영균1 · 김성현1 · 도남용1 · 최봉남1 · 이도용1 · 임성철2 |
| 조선대학교 의과대학 이비인후과학교실1;병리학교실2; |
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| 주제어:
Tenascinㆍ진주종ㆍ림프구. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Components of extracellular matrix protein play a crucial role in morphogenesis and epithelial cell differentiation. Protein is highly conserved during evolution and is expressed in a variety of tissues, and the amount of T and B lymphocytes are significantly higher in cholesteatomatous tissue than in the external auditory canal skin. We examined the spatiotemporal expression and distribution of extracelluar matrix protein tenascin and lymphocytes of cholesteatomatous tissue and normal external auditory canal skin.
MATERIAL AND METHODS: The biopsy specimens of cholesteatomatous tissue and external auditory canal skin were obtained during middle ear surgery. Monoclonal mouse antibodies against tenascin, CD4 helper cell and CD8 cytotoxic/suppressor T cells were used.
RESULTS:
The results are as follows: 1) The expression of tenascin was significantly increased in cholesteatomatous tissue compared to that in normal external auditory canal skin. 2) As the expression of T lymphocytes increased, the expression of tenascin increased significantly (p<0.05, r=0.832). 3) As the expression of Langerhans' cells increased, the expression of tenascin increased significantly (p<0.05, r=0.788).
CONCLUSION:
These results suggest that the change in the composition of the extracelluar matrix protein and lymphocyte in cholesteatomatous tissue may play an important role in the pathogenesis of cholesteatomatous otitis media. |
| Keywords:
TenascinㆍCholesteatomaㆍLymphocyte |
서론
진주종성 중이염은 중이와 중이 주위 조직의 골 흡수 및 골 파괴를 일으키는 질환으로 발생기전 및 병리학적 현상에 대한 연구가 계속되고 있다. 진주종성 중이염은 조직학적으로 골 파괴를 동반하는 진주종 조직과 만성 육아조직으로 구성된 조직학적 특징을 가지며, 림프구의 증가와 분포양상의 변화로 인한 복합적인 면역반응의 결과로 발생된다.1-3) 진주종 조직에서는 랑게르한스 세포의 유입을 포함하는 면역현상이 활발하게 일어나고 그 분포양상이 외이도 피부와 다르다고 알려져 있으며, 랑게르한스 세포, T 림프구 및 B 림프구의 유입이 진주종성 중이염의 자연경과에 있어 만성적 염증을 유지할 뿐만 아니라 중이 진주종에서 이차적 현상으로 흔히 발견되는 주위 골 조직의 파괴와 관계가 있다고 한다.3)
Tenascin은 최근에 발견된 세포외 기질단백으로 여러 종류의 종양성 병변에서 발현의 증가를 보이며, 상피와 간엽세포의 상호작용 부위에서 성장과 분화에 관여하고 있다고 알려져 있다.4) Schilling 등5)은 진주종에서 tenascin의 발현의 증가를 보고하였고, Hemesath 등6)은 T 림프구가 tenascin의 분포에 영향을 미친다는 보고를 하였다. 특히 세포외 기질에서 tenascin 등의 유착물질이 T 림프구의 활성화 과정에 중요하다는 보고가 있다.6) 따라서 저자들은 진주종의 세포외 기질의 구성과 림프구 및 랑게르한스 세포분포의 상관관계를 관찰함으로서 진주종의 발생기전을 규명하고자 하였다.
재료 및 방법
재료
진주종성 중이염으로 수술 받은 환자 26례(26귀)의 수술시 채취한 진주종조직과 대조군으로 동일 환자의 외이도 피부를 채취하여 파라핀 포매조직 및 동결절편으로 보관하였다. 면역조직화학적 검사에 사용된 1차 항체는 monoclonal mouse antihuman antibody를 사용하였고, 항원으로서 범 T 세포는 CD45RO, clone UCHL1(DAKO), 조력 T 림프구는 CD4, Helper T cells, clone MEM-115 (SANBIO), 억제 T 림프구는 CD8, Cytotoxic/suppressor T cells, Clone BL-Ts 8/2(SANBIO)에 대한 항체를 사용하였고, 랑게르한스 세포는 S-100 protein(Zymed)에 대한 항체를 그리고, Tenascin은 clone T2H5(NeoMarkers)에 대한 항체를 사용하였으며, 2차항체는 LSAB(labelled streptavidin biotin) kit(DAKO)에 있는 anti mouse immunoglobulin Ab를 사용하였고, 발색제는 AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) kit(DAKO)를 사용하였다.
방법
면역조직화학적 염색방법
10% 중성 포르말린에 고정 후, 파라핀 포매된 조직은 4~5 μm두께의 절편으로 제작하여 Hematoxyline-Eosin염색을 실시하였고, 면역조직화학적으로 UCHL1, Tenascin, S-100 단백에 대한 염색은 DAKO사의 LSAB(labelled streptavidin biotin) kit와 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole) kit를 이용하여 ABC(avidin-biotinimmunoperoxidase complex)법으로 시행하였으며 hematoxylin으로 20초간 대조염색을 실시하였다. CD4 및 CD8에 대한 염색은 신선조직을 이용한 동결절편을 아세톤에 10분간 고정 후 위와 같은 시약을 이용하여 ABC법으로 시행하여 면역 구의 아형 및 이들의 침윤정도를 정량적 및 정성적으로 비교 분석하였다. 한편 tenascin은 항원성을 살리기 위하여 인산완충 생리식염수에 넣어 전자레인지(97℃)에 10분간 처치한 후 실온에 20분간 방치시킨 후 위와 같은 방법으로 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
면역조직화학적 염색에 대한 양성 대조군으로 UCHL1, CD4, CD8은 부검에서 얻은 태아의 흉선 조직을 이용하였으며, Tenascin 및 S-100 단백은 검체중 기저막이 잘 확보된 대조군의 외이도 피부에서 기저막 직하부에 정상적으로 존재하는 tenascin과 상피층의 랑게르한스 세포를 각각 자체 대조물로 이용하였다. 그리고 음성 대조군은 각 실험군별 염색시 일차항체 대신 정상 염소 혈청을 반응시켜 염색과정을 진행하였다.
판독
조력 T 림프구, 억제 T 림프구는 진피에 침윤되는 세포로 400배 배율에서 무작위로 선택한 10개 시야에서 진피의 고배율 시야내의 1 mm 2 내의 모든 세포를 세고, 랑게르한스 세포는 표피에 존재하는 세포이므로 표피에서 시야의 1 mm 길이내의 상피내의 모든 세포 수를 세어 평균 개수를 구하여 대조군과 비교하였다. 진피는 광범위하여 1 mm 2를 기본단위로 하였으나 상피는 얇고 길이가 길기 때문에 각 예마다 두께가 일정치 않아 1 mm폭을 기준으로 세포수를 세었다.
T 림프구는 침윤된 전체 림프구의 5%이하인 경우를 (＋/-), 5~10%를 (＋), 10~20%를 (＋＋), 20% 이상을(＋＋＋)로 판독하였다.
랑게르한스 세포는 외이도 피부와 비교하여 없는 경우를 (-), 적은 경우를 (＋), 외이도 피부와 같은 경우를 (＋＋), 더 많은 경우를 (＋＋＋)로 하였으며, 조력 T 림프구와 억제 T 림프구는 대조군의 세포수와 비교하여 반 정량적인 비교분석을 하였는데, 변화가 없는 경우를 (-), 50%이하의 증가를 보인 경우를 (＋), 50~100%의 증가를 보인 경우를 (＋＋), 100%이상의 증가를 보인 경우를 (＋＋＋)로 임의분류하였다.
Tenascin은 상피하 기질내에서의 발현되지 않은 경우를 (-), 희미하거나 불연속적인 경우를 (＋), 연속적인 경우를(＋＋), 넓고, 강하고 연속적인 경우를 (＋＋＋)로 판독하였다.
통계처리
통계처리에는 chi-square 검사 및 회귀분석을 시행하였다.
결과
정상 외이도 피부와 진주종에서 tenascin의 발현양상
진주종 조직에서 tenascin의 발현은 양성발현을 보인 경우가 80.8%,(＋＋)이상 강하게 발현된 경우가 69.3%였고(Fig. 1),정상 외이도 피부에서는 음성의 경우가 69.3%로 거의 대부분을 차지하였다(Fig. 2). Tenascin은 대조군에 비해 진주종조직에서 유의하게 발현이 증가하였다(Table 1, p< 0.05).
T 림프구의 분포와 tenascin의 발현의 상관관계
T 림프구의 분포와 tenascin의 발현양상을 비교한 결과 조력 T 림프구의 분포가 높을경우 tenascin의 발현이 증가하였다(Fig. 3)(Table 2, p<0.05, r＝0.832). 조력 T 림프구와 tenascin발현양상에서는 조력 T 림프구가 많을경우 tenascin의 발현이 의미있게 증가되어 통계적으로 유의하였으나(Table 3, p<0.05, r＝0.730), 억제 T 림프구에서는 유의한 상관관계를 보이지 않았다.
랑게르한스 세포의 발현과 tenascin의 발현의 상관관계
랑게르한스 세포의 분포와 tenascin의 발현양상을 비교한 결과 랑게르한스 세포의 분포가 많을경우 tenascin의 발현이 유의하게 증가하였다(Fig. 4)(Table 4, p<0.05, r＝0.788).
고찰
랑게르한스 세포는 피부조직에서 표피세포의 약 3~5%을 차지하며, 주로 기저상층에 분포하지만, 진주종 조직에서는 기저층에서 많은 분포를 보이며 일반적으로 골수에서 기원하여 접촉 과민반응 등 면역반응에 의하여 대식세포와 같이 항원을 T 림프구에 제시하는 것으로 알려져 있다.3)7) 랑게르한스 세포는 T 림프구와의 상호작용을 통해 여러 가지 lymphokine을 매개하여 림프구를 활성화시키고, 국소적인 염증을 가속화시키며 이 과정에서 인근 골 조직으로부터 무기질을 유리할 수 있는 여러 효소나 화학적 매개물질이 분비됨으로써 진주종에서의 주위 골조직 파괴 현상을 유발하는데 관계하리라 보인다.8)
Park 등1)은 진주종기질의 상피하 조직에서 염증세포의 침윤을 관찰하여 주된 염증세포는 림프구라고 하였으며, Sung 등 3)은 진주종에서 T 림프구가 상피하층과 표피의 기저층에 분포하고 있으며 진주종조직에 이러한 림프구의 유입은 진주종의 경과에 영향을 미친다고 보고하였다.
진주종 조직에서 많은 T 림프구와 랑게르한스 세포의 분포는 만성적인 면역반응을 유지할 뿐만 아니라 이차적인 현상으로서 진주종에서 흔히 발견되는 주위 골조직의 파괴기전에 관여할 것으로 생각되었다.
진주종은 세포외 기질의 구성에 많은 변화를 보여주는데, 특히 세포와 기질간의 조절이 잘못되어 나타난다고 하였다.9) 최근 진주종에서 이러한 골조직 파괴에 관여하는 것으로 생각되는 화학적 매개 물질중 세포외 기질에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 진주종에서 상피성장인자 수용체(EGFR) 당단백의 증가와, 세포외 기질을 분해시키는 여러 효소가 진주종에 많음을 보고하여 세포외 기질과 진주종과의 관계를 보여주고 있다.10)11)
세포외 기질단백은 사이토카인과 성장인자의 중요한 저장소로서 생리학적 반응을 조절하고 배형성, 발암, 창상치유 등에 영향을 미치며, 또한 세포막의 유착부위에 부착시 세포의 외부와 내부간에 신호가 전달되어 세포구조의 조직화와 안정성에 중요한 역할을 하게된다.4) 또한 세포표면에 있는 세포 유착분자와 세포외 분자는 세포의 이동에 중요한 역할을 하며, 종양세포의 이동도 촉진할 수 있고, 증식능력의 변화로 많은 상피종양 및 암종에서 종양의 침입성을 증가시킬 수 있다고 생각되고 있다.4) 이러한 세포외 기질단백의 대표적인 것으로 fibronectin, collagen, fibrinogen, laminin, tenascin, thrombospondin 있는데 이들 중 현재까지 많이 연구된 세포외 기질인 fibronectin, laminin 등은 기저막과 혈장에 면역과 염증반응이 있을 때 잘 나타나며 T 림프구의 활성화를 돕는다.6)12)13) 현재까지 진주종에서 세포외 기질단백에 대한 연구로 tenascin의 과다발현에 대한 보고와,5) 진주종의 세포외 기질의 심한 변화에 대한 관찰14)이 있다. 특히 이들은 조각난 기저막, integrin발현의 변화를 관찰하고 이것이 병변의 증식성의 표현이라고 하였으며, 그러므로 진주종은 증식과정의 세포와 기질과의 상호관계가 잘못 조절되는 것을 병인이라고 하였다.4)5) Lang 등9)은 형질전환인자 베타(transforming growth factor β)가 진주종조직에서 증가됨을 보고하고 이들이 tenascin, fibronectin, collagen의 합성을 촉진한다고 하였으며 이는 진주종발생의 과도한 증식과정과 관련되었다고 하였다.
Tenascin의 발현양상을 보면 정상조직에서는 기저막 근처에서 극히 제한되어 나타나나, 상피증식이 심한 과각화성 혹은 이형성 점막에서는 증강되어 두껍고 연속적인 막으로 나타난다.4)15) Schilling 등5)은 후이개 피부에서는 제한적으로 나타났고, 외이도 피부에서는 약간 더 현저하게 나타났으며 진주종에서는 풍부하고, 연속적으로 발현하였다고 하였다. 특히 tenascin의 분포로 악성도의 감별이 가능하다는 보고가 있는데, 이들은 양성 병변에서는 비슷하고 널리 퍼진 양상의 염색을 악성 병변에서는 고르지 못한 양상의 분포를 보인다고 하였다.16) Franchi 등16)은 양성종양에서 강하고 널리 퍼진 양상의 염색상을 보이고, 대조군 염색에서는 발현이 극히 제한되어 나타난다고 하였다. 저자들의 경우에는 대조군인 외이도 피부의 염색에서 tenascin이 매우 약하게 염색되었고, 진주종에서는 강하게 염색되었다.
Schilling 등5)은 강한 tenascin의 발현은 상피증식의 증가를 암시한다고 하였다. 이러한 반응의 기전으로 Hemesath 등6)은 vitro상에서 tyrosine phosphorylation에는 영향이 없고, T 세포의 핵 추출물에서 추출된 DNA 결합 복합체의 하나인 NF-AT1 단백의 전사인자의 발현을 억제하는 것이라고 하였다. 여러 연구에서 진주종은 세포와 기질간의 조절의 이상 때문에 발생하였다는 보고가 많다.5) Ruegg 등17)이 tenascin이 면역억제작용을 보고한 이래 이들 세포외 기질단백에 대한 연구가 계속되었고, 최근에 Hemesath 등6)은 세포외 기질단백등이 T 림프구증식에 어떤 영향을 미칠 것인가에 대한 연구를 여러 조건에서 시행하였으며, 특히 IL2와 CD3가 함께 존재하는 염증반응에서 tenascin은 T 림프구의 증식을 억제한다고 하였다. 또한 tenascin은 phobolester 첨가시나, T- cell receptor ligation등에서는 T 림프구의 증식을 억제하고, 외부의 interleukin 2를 넣으면 증식이 강화된다고 하였다.6) Clark 등18)은 tenascin이 림프구의 유동성에 영향을 미치며, 이는 Ca 의존성이라고 하였으며, O glycoprotease나 neuramidase같은 glycosidase로 림프구 처치 시에는 유착이 억제되지 않았으나, proteinase-K 처치에는 억제되는 것을 보고하였다. 진주종에서 과도한 림프구가 조직내로 들어오는 것을 막는 것이 tenascin의 기능으로 생각되며 진주종 경과에서 오랜 기간, 이루없이 잠재해 있을 수 있는 원인으로도 해석할 수 있다. tenascin같은 세포외 기질단백이 림프구의 조직내 이동이나 성장에 관여하는 것은 염증이 없는 외이도 피부에서는 tenascin발현이 거의 안되나, 진주종같은 염증에서는 그 정도에 따라 림프구와 tenascin이 상호작용을 하여 림프구의 과도한 응집을 막아, 진주종의 지속적인 병인에 관여할 것으로 생각된다. 이는 Gantz 등 8)의 연구와 같이 림프구와 랑게르한스 세포의 면역반응의 결과로 tenascin의 분포가 증가한 것인지는 확실치 않으며, 본 연구에서는 서로간의 강한 상관관계가 나타나 밀접한 관련의 가능성이 있음을 보여주고 있어서 앞으로 이들 외에도 다른 세포외 기질 단백과 여러 단백 효소들에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결론
진주종 조직과 정상 외이도 피부에서 세포외 기질단백의 일종인 tenascin과 랑게르한스 세포 및 T 림프구의 상관관계를 비교 분석한 결과 진주종에서 T 림프구, 랑게르한스 세포 발현의 증가가 세포외 기질 단백의 일종인 tenascin 발현증가와 밀접한 상관관계가 있으며, 진주종 경과에 있어서 tenascin이 과도한 림프구의 증식을 막아 영향을 미칠 것으로 생각되며, 이는 세포외 단백의 구성 변화와 세포와 기질간의 조절 균형의 변화로 진주종의 발생과정에 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
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