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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(5): 620-625. |
| Expression of Cyclin D1 Protein and Ki-67 Index in Advanced Squamous Cell Carcinomas of Head and Neck and Correlation with Response to Chemotherapy and Radiotherapy. |
| Sang Hyun Kim, Byung Yoon Choi, Dong Jo Hwang |
| Department Otolaryngology, National Medical Center, Seoul, Korea. skimnmc@chollian.dacom.co.kr |
| 진행성 두경부편평세포암종에서 Cyclin D1과 Ki-67의 발현과 화학요법 및 방사선 치료반응과의 연관성 |
| 김상현 · 최병윤 · 황동조 |
| 국립의료원 이비인후과 |
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| 주제어:
진행성 두경부 편평 세포암ㆍ화학요법ㆍCyclin D1ㆍKi-67. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Although several oncogenes have been implicated in cellular resistance to ionising radiation or anticancer drug, there is little known about clinical information relating oncogene expression with clinical response to chemoradiotherapy. Correlation between expression of cyclin D1 and Ki-67 and clinical response to chemotherapy and radiotherapy in advanced squamous cell carcinomas was investigated.
DESIGN: Retrospective study.
MATERIALS AND METHODS:
Formalin-fixed, paraffin-embedded tumor materials of 36 patients with advanced SCC of head and neck (clinical stage III, IV) were analyzed by immunohistochemical method with cyclin D1 and MIB-1 monoclonal antibodies. All patients were treated with induction chemotherapy and 22 patients were followed by radiotherapy.
RESULTS:
Overexpression of cyclin D1 protein was found in 33% (12/36). The expressed range of Ki-67 was from 0% to 80.1%. Expression of cyclin D1 protein was higher in the non-response group than in the response group to chemotherapy, but was not correlated with radiotherapy response. The Ki-67 index was not associated with tumor response to chemotherapy and radiotherapy.
CONCLUSIONS: These data suggest that overexpression of cyclin D1 would be a marker for the chemotherapy response, although not for the radiotherapy response, whereas Ki-67 index may not be associated with tumor response to the chemotherapy and not to the radiotherapy in advanced squamous cell carcinomas of head and neck. |
| Keywords:
Cyclin D1ㆍKi-67ㆍChemotherapyㆍRadiotherapyㆍHead and Neck Squamous cell carcinoma |
서론
두경부 종양이 국소적으로 제한된 경우(임상병기 Ⅰ, Ⅱ)에는 수술이나 방사선치료 등의 국소적 요법으로 대개 치료가 가능하지만, 광범위한 병변을 가지고 있는 경우(임상병기 Ⅲ, Ⅳ)는 국소적 요법에도 불구하고 2년후 50%에서 재발하고 5년 생존율이 10∼50%로 예후가 좋지 않다.7) Northern California Oncology Group7)은 진행성 두경부 편평세포암 환자에서 항암치료에 완전관해를 보인 군은 방사선치료만 시행한 후 재발율과 2년 생존율이, 항암치료에 부분적인 혹은 무반응을 보여 수술과 방사선치료를 시행한 군보다 더 좋은 결과를 보고하였다. 따라서 진행성 두경부 편평세포암에 대한 치료방침을 결정하는데에는 항암치료 혹은 방사선치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 지표가 필요하다.
현재까지 암유전인자의 발현정도에 따른 항암화학요법치료 혹은 방사선치료에 대한 반응정도를 비교한 임상적 자료는 거의 없는 실정이며 생체외에서 인간의 암세포주를 이용하여 항암화학요법의 약제에 대한 내성과 암유전인자들(c-myc, ras, cyclin D1, c-raf-1)와의 연관성을 보기위한 노력은 10년 전부터 계속되어 왔다. 이에 저자들은 본원에서 진행성 두경부 편평세포암으로 진단받고 항암화학요법과 방사선치료을 시행한 36명의 환자의 파라핀 포매조직을 이용하여 cyclin D1 단백의 발현여부와 Ki-67 표지지수를 면역조직화학염색을 이용하여 측정함으로써 이러한 인자들로부터 치료반응경과를 예측할 수 있는지를 알아보았다.
대상 및 방법
대상
연구에 이용된 조직은 1989년 1월부텨 1995년 12월까지 국립의료원 이비인후과에서 진행성 두경부 편평세포암(임상병기 Ⅲ, Ⅳ)으로 진단받은 36례의 파라핀 포매조직을 이용하였다. 성별은 남자 28례, 여자 8례 그리고 평균연령은 55세였으며, 평균추적기간은 21개월(5∼102개월)이었다(Table 1). 치료방법은 36례에서 일차적으로 2회 이상의 항암화학요법을 시행하였으며 이들 환자중 22례에서 방사선 치료를 시행하였으며 나머지 14례는 전신상태가 악화되거나 환자가 거절하여 방사선 치료를 하지 못하였다. 항암화학요법의 약제는 5-FU와 cisplatin이 사용되었으며 cisplatin 100 mg/m 2를 제1일에 정주하고 5-FU 1,000 mg/m 2을 24시간 지속하여 120시간동안 정맥투여하였으며, 3∼4주간격으로 반복하였다. 방사선치료는 Co 60 1.25 MeV을 사용하였고 원발병소와 경부림프절에 총용량 55 Gy에서 72 Gy까지 시행하였으며 항암화학요법과 방사선치료의 결과는 완전관해, 부분관해, 그리고 무반응으로 분류하였다(Table 2).
방법
파라핀 포매 조직을 5 μm 두께로 절편하고 통상의 탈파라핀 및 탈수과정을 거친 후 박절 한 표본을 구연산 완충액(citrate buffer, pH 6.0)에 넣고 전자오븐(microwave oven)에서 Ki-67은 5분간, cyclin D1은 15분간 전처치한 후 실온에서 냉각시켰다. 메탄올과 과산화수소액으로 내인성 과산화효소를 억제시킨 후 1：100으로 희석한 cyclin D1(Oncogene, Sandiego, USA), 1：30으로 희석한 Ki-67에 대한 MIB1 단클론항체(BioGenex, San Ramon, USA)를 사용하였다. LSAB＋kit(DAKO, USA)를 이차항체로 이용하였으며, 3,3’-diamionbenzidine terahydrochloride(DAB)으로 발색시키고, Mayer’s hematoxylin에 20초간 대조염색한 후 glycerin로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
결과 판독
Ki-67 발현정도를 판정하기 위하여 저배율(×100)에서 병소를 대표하는 부위를 택하고 고배율(×400)에서 주변 결체조직과 뚜렷이 구별되는 핵염색상을 보이는 세포를 양성으로 판정하고 500개 이상의 종양세포를 세어 양성 세포의 수를 백분율로 구하여 이를 Ki-67 표지지수로 하였다(Fig. 1). Cyclin D1 양성반응은 세포질에 염색되지 않으며 핵에 분명하게 갈색으로 염색되는 것으로 하였으며 400 배율로 관찰하여 10%이상을 양성으로 하였다(Fig. 2). 통계처리는 Log-Rank test, Wilcoxon test, Chi-squre test, T-test를 시행하였으며, 유의수준은 95%로 하였다.
결과
Cyclin D1 단백의 과발현은 12례(33%)에서 보였으며, Ki-67 표지지수는 0%에서 80.1%까지 다양하며 평균은 36.5±27.5%이다(Table 3). 각각의 cyclin D1 발현정도와 Ki-67 표지지수에 따른 원발부위, 병기, 림프절 전이 여부, 그리고 병리학적 분화도 사이에 통계적인 유의성은 없었으며 cyclin D1 단백의 표현과 Ki-67 표지지수와의 상관관계도 통계적으로 유의한 차이는 없었다. Cyclin D1단백의 발현정도에 따라 두 군으로 나누어 5년 생존률을 비교한 결과 cyclin D1 과발현이 있는 군에서 25%, 과발현 아닌 군에서 28%로 통계학적으로 유의한 차이가 없었으며, Ki-67 표지지수에서 평균치를 기준으로 두 군으로 나누어 생존률을 비교한 결과 36이상인 군에서 25%, 36이하인 군에서 29%로 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. Cyclin D1 단백의 발현유무에 따른 항암화학요법의 치료의 반응를 비교한 결과 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(p＝0.035). 즉, cyclin D1 단백의 과발현이 있는 군에서 항암화학요법의 치료에 대한 반응이 떨어지고 cyclin D1 단백의 과발현이 없는 군에서 항암화학요법의 치료에 대한 반응이 증가하였다(Table 4). Cyclin D1 단백의 발현유무에 따른 유도화학요법후 방사선치료에 대한 반응을 비교한 결과 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(Table 5). 항암화학요법의 치료반응 유무에 따라 두 군을 나누어 Ki-67 표지지수를 비교하였으나 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(p＝0.578). 항암화학요법치료 후 방사선치료의 반응 유무에 따라 두 군으로 나누어 Ki-67 표지지수를 구한 결과 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(p＝0.428).
고찰
Cyclin D1 과발현은 암발생 및 암의 악성도와 관계가 있는 암유전자로 인정되고 있으며 식도암, 유방암, 두경부 편평세포암, 폐암 등에서 발견되고 있다. 두경부 편평세포암종에서 cyclin D1의 과발현과 임상예후와 연관성을 여러 연구에서 보고하였는데, Michalides등11)은 cyclin D1 과발현이 47례중 30례(64%)에서 있었으며 이는 낮은 생존율과 연관성이 있으나 임상적병기와는 연관성이 없다고 보고하였다. 이는 cyclin D1이 임상적 병기와 관계없는 독립적인 예후 인자로 보았다. Muller등10)은 FGF4와 bcl-1유전자의 동반 증폭이 두경부 편평세포암의 57%에서 있었으며 이는 경부림프절 전이나 임상적으로 진행된 병기와 상관관계가 있다고 보고하였다. Bereson1)은 23례의 두경부암에서 8례에서 bcl-1의 증폭이 있었으며 이들 중 미분화 암세포에서 cyclin D1 증폭을 보고하였다. 그러나 Leonard등8)은 두경부 편평세포암에서 과발현과 생존율과 연관성은 없다고 하였으며 Davidson등4)도 cyclin D1의 증폭이 두경부 편평세포암의 22%에서 있었으나 임상병기나 병리학적 인자와는 연관이 없다 하였다. 저자들의 연구에서는 36례중 12례(33%)에서 유전자 과발현이 있었으며, 이 과발현은 원발부위, 임상적 병기, 경부림프절 전이유무, 병리학적 분화도, 그리고 생존율과 상관관계는 없었다.
면역조직학적 염색에 의한 Ki-67 표지지수에 대해서도 여러종양들에서 연구되어 왔다. 대부분의 연구에서 Ki-67 표지지수가 높은 환자군에서 예후가 좋지 않은 것으로 보고 되고 있으나,6)16) Ogawa등12)에 의하면 방사선치료전의 Ki-67 표지지수는 임상적 병기, 병리학적 분화도, 방사선 치료의 결과와 연관이 없는 것으로 보고하였다. Yang등15)에 의하면 cyclin D1 과발현이 있는 군보다 없는 군에서 Ki-67 표지 지수가 더 높게 나와, cyclin D1과 Ki-67 표지지수와 연관이 없음을 보고하였다. 저자들의 연구에서도 Ki-67 표지지수는 임상적 병기, 병리학적 분화도, 항암화학요법의 치료반응, 방사선 치료의 반응, 생존율, 그리고 cyclin D1 발현과 연관성이 없었다.
절제가능한 진행성 두경부 편평세포암(임상병기 Ⅲ, Ⅳ)에서 수술과 방사선 치료에도 불구하고 2년 후에 50%에서 재발하고 5년 생존율이 10에서 50%로 예후가 좋지 않다.7) Northern California Oncology Group7)은 진행성 두경부 편평세포암으로 진단된 30명 환자에서 항암치료에 완전반응을 보인 12명은 방사선치료만 시행한 후 재발율과 2년 생존율이, 항암치료에 부분적인 혹은 무반응을 보여 수술과 방사선치료를 시행한 군보다 더 좋은 결과를 보였다. 즉, 선택적인 항암치료와 방사선치료의 병용요법은 진행성 두경부 편평세포암에서 재발과 생존율이 수술적 치료와 비교해서 큰 차이가 없으며 장기보존을 통해서 삶의 질을 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 진행성 두경부편평세포암으로 진단받은 환자에서 항암치료에 대한 반응유무를 알아내서 선별적인 치료를 결정해야 할 것이다. 항암치료제에 대한 내성을 보이는 기전으로는 세포의 약물흡수의 감소, P-glycoprotein에 의해 매개되는 약물유출의 증가, 세포내부에서 해독능력의 증가, 약물대사의 중요효소들에 대한 유전자들의 증폭, DNA손상의 감소와 복구의 증가, 암유전자들의 발현 변화 등으로 다양하다.2)13) 현재까지 암유전인자의 발현정도에 따른 항암화학요법치료 혹은 방사선치료에 대한 반응정도를 비교한 임상적 자료는 거의 없는 실정이며 생체외에서 인간의 암세포주를 이용하여 항암화학요법의 약제에 대한 내성과 암유전인자들(c-myc, ras, cyclin D1, c-raf-1)와의 연관성을 보기위한 노력은 10년 전부터 계속되어 왔다. 두경부암에서 가장 일반적으로 사용되고 있는 복합항암제는 cisplatin과 5-FU이다. Warenius14)는 16개의 실험관내 암세포주을 이용하여 cyclin D1 단백 발현정도을 측정한 후 cisplatin을 이용한 항암제치료와 방사선치료를 시행하여 생존율을 구하였다. 실험결과를 보면 cyclin D1 단백의 발현정도가 증가하면 할수록 cisplatin에 대한 내성정도가 비례적으로 증가하는 것을 발견하였다. 그러나 방사선치료와는 상관관계는 없었다. 그리고 cisplatin에 내성이 있는 세포주는 cyclin D1의 증가 정도와 비례하여 S기 기간도 증가하였다. 결론적으로 세포주기를 길게하여 항암제치료에 손상을 받은 세포가 복구하는 데 더 많은 시간을 할애할 수 있도록 함으로서 cisplatin에 대한 내성을 유발시킨다고 추측할 수 있다. 본 연구에서도 cyclin D1 단백의 과발현이 있는 군에서 과발현이 없는 군에 비해 항암제치료에 대한 관해율이 떨어져 Warenius와 비슷한 결과을 얻었으며 cyclin D1 단백의 발현에 따라 방사선치료의 반응과의 연관관계는 없었다. Cyclin D1은 다른 암유전자와 같이 공동으로 작용하여 형질 변형을 일으킨다. Lovec등9)은 cyclin D1과 Haras와 같이 주입된 쥐의 섬유아세포가 17일 뒤에 섬유육종으로 형질전환을 보고하였다. Filmus5)는 활성화된 ras 유전자가 세포주에서 cyclin D1단백의 과발현을 일으키고 이런 과발현이 세포증식을 야기시키는 것을 입증하였다. Dakis3)는 cyclin D1과 c-myc의 연관관계를 estrogen-inducible Myc system을 이용하여 연구하였다. 이 실험에서 c-myc은 성장인자에 대한 즉각적인 초기유전조절인자로 작용하여 지연적 초기유전조절인자로 작용하는 cyclin D1을 발현시키고 G1기를 S기로 전환시키는 역할을 한다. 결과적으로 cyclin D1 과발현은 c-myc에 의해 야기되고 cisplatin에 대한 내성을 일으킨다. 본 연구에서는 c-myc, ras 암유전인자의 발현을 연구하지 않았지만 cyclin D1 단백의 과발현이 이런 암유전인자들과 연관이 있을 것으로 추측된다.
실제 임상에서 종양들은 상당히 다양한 유전적인 변이성을 가지고 있어 실험실내 세포주에서 하나의 암유전자의 발현이 약물내성을 보인다고 하여 반드시 임상에서 똑같은 관계가 그 특별한 유전자에 나타났다고 할 수는 없지만 실험실내의 결과를 계속적으로 임상결과와 비교해야 할것이다.
결론
저자들은 진행성 두경부 편편세포암으로 진단받고 항암제치료와 방사선치료를 받은 36례를 대상으로 시행한 연구를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
진행성 두경부 편평세포암에서 cyclin D1 단백의 과발현이 있는 군에서 항암화학요법의 치료에 대해 내성을 나타내어 관해율이 cyclin D1 단백의 과발현이 없는 군보다 감소하였다. 그러나 cyclin D1 단백의 발현유무와 방사선치료에 대한 상관관계는 없었다.
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