| Expressions of Epidermal Growth Factor Receptor in the Epithelium and Cultured Keratinocyte of Aural Cholesteatoma. |
| Jin Hwan Kim, Hyung Jong Kim, Ji Young Park |
1Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. hjk1000@www.hallym.or.kr
2Department of Clinical Pathology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. |
| 중이진주종 상피 및 배양된 각질세포에서 상피성장인자수용체의 발현에 관한 연구 |
| 김진환1 · 김형종1 · 박지영2 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;임상병리과학교실2; |
|
|
|
|
|
| 주제어:
중이진주종ㆍ상피성장인자수용체ㆍ세포배양ㆍ유세포계측검색. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Aural cholesteatoma is characterized by the presence of keratinizing squamous epithelium in the middle ear cleft. Bone destruction of adjucent structures is mainly responsible for serious intracranial complications in this disease. Recently, expressions of epidermal growth factor (EGF) and its receptor were reported to be increased in cholesteatoma epithelium, compared with normal skin epidermis. In the present study the role of epidermal growth factor receptor (EGFR) in proliferation and progression of middle ear cholesteatoma was investigated.
MATERIALS AND METHODS:
The degree of EGFR expression was measured using immunohistochemical staining with image analysis and flow cytometric method. These results were compared with those in normal skin epidermis.
RESULTS:
EGFR was weakly expressed in the basal layer of cholesteatoma epithelium and normal skin epidermis. However its expression was more intense in suprabasal layer of cholesteatoma epithelium than in normal skin epidermis. By flowcytometric method, an increase of EGFR expression was detected in cholesteatoma keratinocyte (106.5+/-19.8) than in normal skin keratinocyte (60.8+/-11.1).
CONCLUSION:
In conclusion, an increase of EGFR expression in cholesteatoma suggests that EGFR plays a role in epithelial cell proliferation and progression of cholesteatoma. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍEGFRㆍCell cultureㆍImmunohistochemistryㆍFlow cytometry |
서론
중이진주종은 병리조직학적으로 각화성 편평상피(keratinizing squamous epithelium)가 비정상적으로 중이강내 존재하는 것으로 정의된다. 이 질환은 골조직을 포함한 주위 구조물을 파괴하는 임상적 특징 때문에 많은 연구자들에 의해서 병변의 발생 및 골파괴의 병리기전을 규명하려는 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 중이진주종의 발생기전으로는 태생기때 남아 있던 편평상피에서 발생했다는 선천성설(congenital theory),1) 천공된 고막, 혹은 상고실의 함몰을 통해 유입된 외이도나 고막의 상피에서 발생하였다는 상피 이동설(migration theory),2) 그리고 중이점막이 각화성 편평상피로 화생하였다는 화생설(metaplasia theory)3) 등이 제기되었는데, 이들 모두 각화성 편평상피가 성장특성의 변화를 일으켜 과증식을 함으로써 진주종을 형성한다는 점에서는 일치된 의견을 보이고 있다.
최근에는 면역학, 분자생물학 및 유전학의 발달에 따라 진주종 상피의 증식능의 발현을 규명하려는 연구가 활발히 진행되어 진주종 상피의 과증식 상태와 여러 성장인자 및 그 수용체와의 관계가 밝혀지고 있다. 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하 EGFR)는 170,000 dalton의 인당단백으로 상피성장인자(epidermal growth factor, 이하 EGF)가 EGFR에 결합하게 되면, EGFR의 자가인산화가 일어나고 여러 표적 단백질들의 인산화등 일련의 생화학적 반응으로 이어져 결과적으로 DNA의 생성과 세포의 증식이 일어나게 된다.4) 또한 EGFR의 cytoplasmic portion과 υ-erb-B transforming oncogene 사이에 sequencing homology가 있음이 밝혀짐에 따라 4) EGFR이 정상 및 비정상 세포의 성장을 조절하는데 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있고, 진주종 상피의 과증식 또한 EGFR과 깊은 연관이 있을 것으로 생각된다.5)
본 연구의 목적은 면역조직화학적 방법을 통해 진주종 조직의 상피와 정상 후이개부 피부조직의 상피에서 EGFR의 발현부위와 발현정도를 비교하고, 진주종 조직과 정상 후이개부 피부조직의 각질세포를 세포배양한 후 유세포계측검색(flow cytometric analysis)을 통해 EGFR의 발현을 정량적으로 비교하여 진주종의 발생 및 증식의 기전에 있어 EGFR의 역할을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
한림대학교 의과대학부속 강동성심병원 이비인후과에서 수술시 채취한 중이진주종 조직중 표본상태가 좋은 35례와 대조군으로 10례의 정상 후이개부 피부조직을 대상으로 하였다. 그중 진주종 조직 30례와 정상 후이개부 피부조직 5례는 조직고정 및 파라핀포매 후 EGFR에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였고, 진주종 조직 5례와 정상 후이개부 피부조직 5례는 표본채취 즉시 각질세포를 세포배양하여 유세포계측검색을 시행하였다.
방법
면역조직화학적 관찰
수술시 채취한 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 넣어 24시간 고정 시킨 후 탈수하여 파라핀에 포매하였으며, 이 조직을 4 μm 두께의 연속 절편으로 만들어 한 절편으로 hematoxylin-eosin염색을 시행하여 광학현미경하에 관찰한 후 표본상태가 양호한 것을 대상으로 선택하였고, 이미 만들어진 연속 절편중 다른 절편으로 labelled streptoavidine biotin kit(DAKO LSAB Kit, DAKO Corp., Copenhagen, Denmark)를 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
항체 및 시약
항EGFR 항체는 사람의 EGFR 단백서열의 세포외영역(extracellular domain)의 12개의 합성 다당체를 이용하여 토끼에서 생성한 다크론성 항체(Ab-4, Oncogene Science, Inc., Uniondale, NY, USA)를 1：10으로 희석하여 사용하였다.
면역조직화학적 염색
조직이 부착된 슬라이드를 56℃ 오븐에서 30분간 처리하고, xylene으로 10분간 4회 탈파라핀화 시킨 뒤 100%, 95%, 80%, 70%의 에탄올에 각 5분씩 처리한 후 증류수로 함수시켰다. 조직내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제시키기 위하여 과산화수소와 무수알코올이 1：9의 비율로 혼합된 용액(autoblocker)에 10분간 반응시키고 phosphate buffered saline(10 mM, pH7.4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, 이하 PBS)으로 3회 세척하였다. 조직내의 비특이적 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 조직을 정상 염소 혈청에 30분간 처리한 후 1차 항체인 항EGFR 항체로 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. PBS로 씻어 낸 뒤 biotin과 결합된 2차 항체를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 다음 streptavidinperoxidase(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)를 30분간 실온에서 반응시키고 PBS로 세척한 후 peroxidase의 기질액인 hydrogen peroxide와 발색제인 AEC(3-amino-9-ethyl carbarzole, Zymed Labora-tories Inc., San Francisco, CA, USA)에 10분간 반응시킨 뒤 wet mounting을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
면역조직화학적 염색의 판정
각각의 면역조직화학적 방법으로 염색한 조직표본에서 정상 후이개부 피부조직의 상피와 진주종 조직의 상피를 아래층을 형성하는 기저층(basal layer)과 그 윗 부분의 세포층인 기저층 상부(suprabasal layer)로 구분하여 관찰하였으며, 세포막을 따라 갈색 과립상으로 보이는 경우를 양성으로 판정하였다. 1차항체 대신 PBS만 도말시킨 표본을 음성대조군으로하여, 세포막 주위에만 미세한 연한 갈색으로 염색된 경우를 약양성(＋)으로, 400배 시야를 거의 채우는 정도로 염색된 경우를 중등도 양성(＋＋)으로, 그리고 400배 시야를 완전히 넘어서는 정도로 염색된 경우를 강양성(＋＋＋)으로 판정하였으며 우선 100배 현미경 시야에서 염색이 잘 된 부위를 확인한 후 400배 현미경 시야에서 10회 판독하여 평균치를 구하였다. 판정은 임상양상을 알지 못하는 병리 전문의가 주관적으로 시행하였다. 또한 이와는 별개로 좀더 정량적인 판정을 위해 image analysis를 시행하여 각각의 염색정도를 density score로 나타내었다. Image analysis는 black & white densitometry를 이용하여 한 시야에서 가장 밝은 부위를 0, 가장 어두운 부위를 200으로 설정한 후 정상 후이개부 피부조직 상피와 진주종 조직 상피의 기저층과 기저층 상부의 200배 현미경시야에서 염색이 잘된 각각 다섯부위를 선정, density 정도를 측정하여 평균치를 구하였다. 이를 위해 Olympus사의 videomicrographs와 Imascan Chroma-P의 video-board 및 Image-Pro Plus(Version 1.3)의 software program을 사용하였다.
각질세포의 배양
수술시 채취한 표본을 무균조작 bench(clean bench)로 옮긴 후 penicillin-streptomycin(100 unit/ml)과 amphotericin-B(2.5 μg/ml)가 함유되고 칼슘과 마그네슘이 없는 pH 7.4의 phosphate buffered saline(PBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 5차례 세척하고, 직경 5 mm의 petri dish에서 enzyme의 침투가 잘 되도록 2 mm 2 크기의 소절편으로 잘게 자른 후 0.4% dispase(neutral protease, Boehringer Mannheim, Germany)에 넣고 37℃, 5.0% CO 2 항온기에서 1시간동안 처리하였다. 조직을 꺼내 fine forceps를 이용하여 epidermis와 dermis를 분리시킨 뒤 epidermis만을 3 ml의 0.125% trypsin-0.02% etylenediamine-tetracetic acid(Gibco BRL Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA, 이하 trypsin-EDTA)용액에 넣어 다시 37℃, 5.0% CO 2 항온기에서 10분간 처리하였다. 단세포로 만들어 주기 위하여 pipetting을 수 회 실시후 10% fetal bovine serum(Gibco BRL Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA, 이하 FBS) 1 ml를 첨가하여 trypsin을 중화시킨 후 다시 pipetting을 수 회 시행하였다. 4℃, 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액은 제거하고 각질세포 증식촉진인자(human keratinocyte growth supplement, Cascade Biologics Inc., Portland, Oregon, USA, 이하 HKGS)가 함유된 무혈청 배양액인 Medium 154(Cascade Biologics Inc., Portland, Oregon, USA, 이하 M154) 10 ml에 넣어 그중 1 ml를 parafilm위에서 trypan-blue 염색을 시행하여 hematocytometer로 세포의 갯수를 확인한 후 다시 4℃, 1400 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 1 ml의 M154를 넣어 25 cm 2 culture flask(Nunc, Copenhagen, Denmark)에 부유하여 37℃, 5.0% CO2 항온기에서 배양하였다. 배양액은 이틀 간격으로 교환하였으며 배양 후 일주일째 각질세포가 단층으로 flask의 전면을 덮도록 자란 것을 확인한 후 trypsin-EDTA용액을 처리하여 배양된 세포를 flask로 부터 분리시키고, 다시 세포 수를 확인하여 세포 수가 5×10 6/ml 이상인 경우 유세포계측검색을 시행하였다.
유세포계측검색(flow cytometric analysis)
항체 및 시약
항EGFR 항체로는 인간의 EGFR 단백서열의 세포외영역(extracellular domain)에 antigenic site를 가지는 mouse에서 생성한 항체에 fluorescein isothiocyanate(이하 FITC)를 conjugation시킨 FITC conjugated monoclonal anti-EGFR antibody(Biodesign, Inc., San Diego, USA, 이하 EGFR1)를 사용하였다.
유세포계측검색
Trypsin-EDTA용액에 처리된 배양된 세포의 부유액을 4℃, 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액은 제거하고, pH 7.4의 PBS를 첨가한 뒤 37℃, 5.0% CO2 항온기에서 20분간 shaking 이나 rotation 시켜 세포의 부유액을 만들었다. single cell로 만들기 위하여 pipetting을 수회 실시하고 PBS로 2차례 세척 후 35 μm nylon mesh로 여과시키고 1400 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 침사를 receptor의 internalization을 방지하기위한 0.1%(weight/volume) sodium azide가 함유된 pH 7.4의 PBS에 재부유시킨 후 부유액 100 μl를 얻어 FITC conjugated monoclonal EGFR1(1 μg/μl) 10 μl를 첨가하여 4℃에서 40분간 반응시켰다. 다시 PBS로 3차례 세척하고 PBS 1 ml에 부유하여 유세포분석기에서 분석하였다. 유세포분석기는 FACScan(Becton-Dickinson Immunocytometry System, Cockeysville, MD, USA)을 사용하였으며 laser원으로는 488 nm의 파장에서 excitation시킨 Argon을 이용하였고 FITC를 확인하기 위해 580/80의 band filter가 사용되었다.
유세포계측검색의 판정
유세포계측검색의 판정을 위하여 음성대조군으로는 FITC conjugated anti EGFR antibody 대신 mouse의 IgG 2b에 FITC를 conjugation시킨 isotype(IgG 2b, Biodesign, Inc., San Diego, USA)을 사용하였고, 양성대조군로는 사람의 자궁경부암 세포주인 HeLa cell line을 계대배양한 후 EGFR에 대한 유세포계측검색을 시행하였다. 모든 분석에서 각 sample당 세포 10000개를 취하여 이들 세포의 fluorescence intensity의 평균을 구하였다.
결과
면역조직화학적 방법을 이용한 정상 후이개부 피부조직 상피와 진주종 조직의 상피에서의 EGFR의 발현(Table 1)
기저층에서는 정상 후이개부 피부조직 상피(Fig. 1)와 진주종 조직 상피(Fig. 2) 모두에서 EGFR이 음성 혹은 약양성으로 염색되는 경우가 많았으며 image analysis를 통한 density score에서도 약간의 차이는 있었으나 통계학적인 의미는 없었다(p>0.05).
기저층 상부에서는 기저층에 비하여 정상 후이개부 피부조직 상피와 진주종 조직 상피 모두에서 EGFR이 중등도 양성 및 강양성으로 염색되는 경우가 많았고 density score는 정상 후이개부 피부조직 상피의 기저층 상부에서 39.7±26.9, 진주종 조직 상피의 기저층 상부에서 52.2±28.7로 진주종 조직 상피의 기저층 상부에서 정상 후이개부 피부조직 상피에서보다 EGFR의 density score가 높게 나타났으나 통계학적인 의미는 없었다(p>0.05).
배양된 각질세포의 관찰
후이개부 피부조직의 각질세포와 진주종 조직의 각질세포를 배양한 결과 후이개부 피부조직의 각질세포가 진주종 조직의 각질세포에 비하여 어둡고, 과립상을 보이는 반면(Fig. 3), 진주종 조직의 각질세포는 창백한 양상을 나타내는(Fig. 4) 형태학상의 차이를 보였다. FACScan의 light scattering을 이용하여 형태를 비교한 결과 후이개부 피부조직의 각질세포가 진주종 조직의 각질세포에 비하여 세포의 크기가 더 크고 세포내 과립이 더 많이 존재하는 것이 관찰되었다(Fig. 5). 또한 배양 시작후 같은 조건에서 일어나는 집락(colony)의 형성은 후이개 피부조직의 각질세포는 배양 3일째부터 형성되는데 비하여, 진주종 조직의 각질세포의 경우는 약 7일째부터 나타나거나 집락이 형성되지 않는 경우도 많았다. 세포의 성장 및 배양 속도는 후이개부 피부조직의 각질세포가 배양용기에 가득 자랄때까지 약 2주일이 소요되는데 비하여 진주종 조직의 각질세포는 3주일 이상 소요되는 경우가 대부분이었다. 이와는 달리 사람의 자궁경부암 세포주인 HeLa cell line의 세포는 크기가 작고 세포내 과립도 적었으며 배양 3일 후에 배양용기 가득이 집락이 형성되었다.
유세포계측검색을 이용한 배양된 정상 후이개부 피부조직의 각질세포와 진주종 조직의 각질세포에서의 EGFR의 발현(Fig. 6)
유세포계측검색을 시행한 결과 정상 후이개부 피부조직의 각질세포에서의 EGFR에 대한 fluorescence intensity는 평균 60.8±11.1, 진주종 조직의 각질세포에서의 fluorescence intensity는 평균 106.5±19.8로 정상 후이개부 피부조직의 각질세포에서보다 진주종 조직의 각질세포에서의 fluorescence intensity가 높게 나타났다(Fig. 7). 음성대조군에서는 거의 형광이 나타나지 않았으며 양성대조군인 HeLa cell에서의 fluorescence intensity는 922.5±45.2이었다.
고찰
중이진주종의 발생기전 및 골파괴의 기전에 대한 최근의 연구결과 여러가지 성장인자(growth factor)들이 관여하는 것으로 보고되고 있으며, 진주종 상피에서 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 6) EGF, 5) EGFR, 5) TGF-α(transforming growth factor-alpha), 7) TGF-β(trans-forming growth factor-beta), 8) Ki-67 9) 및 IL-1(interleukin-1)10)등의 cytokine의 발현을 관찰함으로써 진주종 상피의 세포증식을 통한 중이진주종의 발생 및 진행을 설명하고 있다.
Cohen11)이 신경성장인자를 연구하는 과정에서 생쥐의 악하선에서 처음으로 분리하여 보고한 EGF는 정상세포의 증식과 분화에 관여하는 분자량 6045 dalton의 일종의 폴리펩타이드단백으로 세포막위에 있는 수용체인 EGFR과 결합함으로써 그 신호를 세포내로 전달하여 세포의 이온교환과 함께 형태학적인 변화를 일으킨다.12) EGF의 수용체인 EGFR은 170,000 dalton의 당단백으로 세포표면에 위치하며, 그 구조는1) 성장인자와 결합하는 extracellular domain,2) 세포막을 관통하는 짧은 hydrophobic domain,3) 수용체와 결합된 신호의 세포내로의 전달을 맡는 intracellular domain으로 구성되어 있다.4) EGFR의 extracellular domain에 신호가 결합되면 수용체 분자의 입체적 구조의 변화가 초래되며 intracellular domain의 기능인 tyrosine kinase가 활성화되고, 세포내의 inositol triphosphate, cAMP, diacrylglycerol 및 calcium 등의 second massenger가 관여하게 된다. 이어서 protein kinase C, phospholipase C, G protein, adenyl cyclase등의 연속적인 활성으로 ion균형의 변화, 세포골격의 재배열, 막지질의 변화, 단백합성능력의 변화 등 일련의 생화학적 반응으로 이어져 결과적으로 DNA 생성과 세포의 증식이 일어나게 되는 것으로 알려져 있다.4) 또한 EGFR은 세포의 분화와 호르몬 분비에 관여하며, 변환성장인자-α (transforming growth factor-α )의 수용체로도 작용한다.13) EGFR은 주로 활성화된 상피세포에서 관찰되며 폐나 피부, 후두의 편평세포암, 유방의 선암 등에서 발현이 증가되고, 방광암에서는 조기 재발을 의미할 수 있는 지표가 된다.14) EGF와 EGFR의 결합에 있어 낮은 농도의 EGF(0.6~1.0 ng/ml)에서는 세포성장을 촉진시키지만 높은 농도(10 ng/ml 이상)에서는 세포성장을 억제시키는데, 이는 EGFR의 tyrosine kinase를 과도하게 활성화시켜 억제경로(inhibitory pathway)를 활성화 시키기 때문이거나 또는 수용체의 종류가 두가지로 나뉘어 있어 한 종류는 성장을 촉진시키는 EGF에 대한 친화도가 높은 수용체이고, 또 다른 종류는 성장을 억제시키는 친화도가 낮은 수용체인데 EGF의 농도가 높아지면 EGF에 낮은 친화도를 가지는 수용체와도 결합하기 때문으로 추정하기도 한다.15) 한편 과발현된 EGFR은 EGF없이도 수용체의 활성도를 일정하게 유지하는 데 그 이유는 EGFR의 세포막외 부분을 제외한 세포막 및 세포막내 부분이 Avian erythroblastosis virus의 υ-erb-B 암유전자의 단백산물과 유사한 구조를 가지는 sequencing homology가 있어 이 부위가 tyrosine kinase에 영향을 미쳐 그 활성도를 지속시 킴으로써 EGFR이 정상 및 비정상 세포의 증식을 촉진하는 역할을 한다는 연구도 있다.16) EGFR의 검출은 여러 가지 방법으로 가능하나 대표적으로는 면역조직화학적 염색을 통한 EGFR의 발현정도와 부위를 알아내는 방법, 외부에서 특별한 표지가 되어 있는 특정 RNA 서열을 첨가하여 EGFR의 염기서열에 보족적인 RNA가닥을 찾는 northern blot, EGFR의 mRNA를 complementary DNA(cDNA)로 reverse transcription(RT)시킨 후 polymerase chain reaction(PCR)방법으로 증폭시켜 gene의 발현을 조사하는 RT-PCR, EGFR-probe를 이용하여 세포내의 EGFR의 mRNA의 존재를 검출하는 in situ hybridization 및 형광물질이 접합된 EGFR antibody가 세포의 EGFR에 부착되어 발생하는 광적인 신호를 측정하는 유세포계측검색 등의 방법이 있다.
본 연구에서는 중이강내 각화성 편평상피세포의 과증식을 병리조직학적 특징으로 하는 중이진주종의 발생기전에 있어 EGFR의 역할을 알아보기 위해 먼저 정상 후이개부 피부조직의 상피와 진주종 조직의 상피에 있어 EGFR의 발현 부위와 발현 정도를 면역조직화학적 방법을 통해 비교하였다. 정상 후이개부 피부조직의 상피와 진주종 조직의 상피 모두에서 EGFR의 발현이 관찰되었으나 염색 강도는 약했으며, 두 상피간의 염색정도의 주관적 판정 결과에도 의미있는 차이가 없었다. 좀더 객관적인 판정을 위해 시행한 image analysis 결과는 진주종 조직 상피의 기저층 상부에서 후이개부 피부조직 상피의 기저층 상부에서보다 density score가 높게 나타났으나 역시 통계학적인 의미는 없게 나타나 주관적 판정결과와 차이가 없었다.
면역조직화학적 염색방법은 조직의 부위별 및 세포별 EGFR의 분포를 알 수 있고 반정량적 분석이 가능하면서도 비교적 간단한 방법인 반면 결과를 판독하는데는 관찰자마다 차이가 있을 수 있는 단점을 가진다. 또한 EGF와 결합하는 EGFR의 세포막외 부분이 포르말린고정 및 파라핀 포매과정에서 변성을 일으키는 경우가 있다는 연구결과17)도 있어 본 연구에서는 조직을 채취한 후 각질세포를 배양하여 포르말린고정 및 파라핀 포매과정없이 객관적이고 정량적인 분석이 가능한 유세포계측검색을 함께 시행하였다.
본 연구에서 각질세포의 배양 결과 정상 후이개부 피부조직의 각질세포와 진주종 조직의 각질세포간의 형태학적인 차이 및 세포의 성장과 배양 속도의 차이가 관찰되었으며 이는 다시 유세포계측검색시 사용한 FACScan의 light scattering의 결과에서도 확인되었다. 이와같은 차이의 원인은 진주종 조직의 각질세포가 후이개부 피부조직의 각질세포와는 달리 운동성을 가지며 이러한 성질을 띠는 방향으로 후이개부 피부조직의 각질세포와는 다르게 분화되었기 때문이거나 진주종 조직의 각질세포와 후이개부 피부조직의 각질세포의 분화 및 증식이 서로 다른 상피층에서 일어나기 때문으로 생각할 수 있다. 이는 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)에 대한 면역조직화학적 검사를 시행한 결과 정상 피부조직의 상피에서는 PCNA가 기저세포층에 주로 분포되어 있으며 진주종 조직의 상피에서는 유주세포층(stratum spinosum)에 주로 분포되어 있다는 연구결과 18)에서도 확인되어, 결국 진주종 조직의 상피에서 주로 세포분열이 일어나는 곳은 유주세포층이고 배양시 자라는 각질세포도 대부분 기저세포층이 아닌 유주세포층에 존재하는 세포일 가능성을 암시한다. 본 연구의 면역조직화학적 염색 결과에서도 EGFR의 발현정도가 진주종 조직 상피의 기저층 및 기저층 상부에 따라 다르게 나타났으며 기저층 상부에서 더 강하게 염색되어 위의 가능성을 더욱 뒷받침 하고있다. 또한 이상의 결과를 종합하여 볼 때 중이 진주종에서의 각질세포의 과증식이 정상 각질세포의 증식과는 다른 병적상태임을 시사한다. 이러한 각질세포의 형태학적인 차이 및 성장속도의 차이, 그리고 EGFR의 발현 부위의 차이는 또다른 앞으로의 연구과제로 남아있다.
본 연구에서 유세포계측검색의 결과는 EGFR의 fluorescence intensity가 진주종 조직의 각질세포에서 평균 106.5±19.8, 후이개부 피부조직의 각질세포에서 평균 60.8±11.1로 진주종 조직의 각질세포에서 fluorescence intensity가 더 높게 나타났다. 이는 다른 과다증식상피질환에서 연구된 EGFR의 발현 증가의 결과와 일치된 소견으로19) 중이진주종에서 각질세포의 과증식에 EGFR이 관여한다는 사실을 강하게 뒷받침한다.
유세포계측검색을 이용한 세포막 수용체의 정량은 각 세포의 형광과 빛의 산란 측정에 의거하며 형광물질이 접합된 개개의 입자들이 유체역학적으로 nozzle을 통과할 때 laser beam을 주사하여 발생되는 광적인 신호를 측정하는 방법20)으로서 염색과정이 비교적 간단하고, 적은 양의 조직으로도 검사가 가능하며, 생체표본에서 단 몇분만에 수천 내지 수십만개의 세포에 대한 신속한 검색이 가능하고, 결과가 숫자로 표현되기 때문에 객관성이나 재현성이 높다는 등의 장점을 가지고 있다. 또한 단크론 항체의 이용으로 세포 내부 혹은 세포 표면에 존재하는 특정 항원에 특이하게 반응하는 항체에 직접 형광물질을 부착한 상태에서 염색하거나(직접법), 세포에 존재하는 항원에 결합한 항체에 대하여 특이하게 반응하는 형광물질이 부착된 항체(간접법)를 사용하여 세포의 어떤 항원이라도 그 존재유무를 빠르고 정확하게 알 수 있게 되었다. 그러나 유세포계측검색을 이용하여 측정하려는 모든 세포는 반드시 단세포 부유액(single cell suspension)으로 되어 있어야만 분석이 가능하며 정확한 검사가 이루어지기 위해서는 일정한 수 이상의 세포가 부유액속에 포함되어야 한다. 본 연구에서는 수술시 얻은 진주종 조직의 각질세포의 수가 유세포계측검색을 시행하기에 부족하였기 때문에 세포배양 후에 유세포계측검색을 시행할 수 있었다. 또한 유세포계측검색은 단세포 부유액을 만들기 위한 조직의 처리방법에 따라서 여러 가지 다른 결과들이 나올 수 있어 조직을 취급하는 방법이 표준화되고 숙련되어야하며 특히, 고형검체는 세포의 찌꺼기들에 의해서 판독이 어려울 수도 있으므로 특별한 조직처리방법이 필요하다. 고형검체의 분쇄방법으로는 기구를 이용한 기계적(mechanical) 방법과 collagenase등 효소를 이용한 화학적(chemical) 방법이 있는데, 섬유화가 심하지 않은 조직은 조직의 절단 및 원심분리 등의 기계적 분쇄법 만으로도 상당수의 검색가능한 세포를 얻을 수 있으나 상피 각질세포의 경우에는 화학적 분쇄방법이 필수적이다. 본 연구에서는 배양된 세포를 분리하기 위하여 trypsin으로 처리하는 화학적 분쇄방법을 이용하였다. 유세포계측검색의 또다른 단점은 고형검체의 세포를 부유액 상태로 분리시켜 검사를 시행하므로 검사결과를 발현부위 및 전체적인 조직내 발현 특성과 연관시킬 수 없다는 점이다. 따라서 앞으로의 다른 성장인자 및 cytokine 등의 발현에 대한 비교연구를 위해서는 본 연구에서와 마찬가지로 전체적인 조직내 발현부위를 비교할 수 있는 면역조직화학적방법과 함께 발현 정도를 정량화 할 수 있는 유세포계측검색 등이 병행되어져야 할 것으로 생각된다.
결론
본 연구에서는 각질세포의 과증식을 특징으로 가지는 중이진주종에서 EGFR의 발현양상을 면역조직화학적 염색 및 세포배양후 유세포계측검색을 이용하여 정상 후이개부 피부조직과 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
첫째, 면역조직화학적 염색을 통한 연구결과 정상 후이개부 피부조직 상피의 기저층 상부보다 진주종 조직 상피의 기저층 상부에서 EGFR의 발현이 증가되었으나 통계적인 의미는 없었다.
둘째, 각질세포의 배양결과 후이개부 피부조직의 각질세포와 진주종 조직의 각질세포간에 형태학적인 차이 및 성장속도의 차이가 관찰되었으며 이러한 차이를 나타나게 한 원인은 앞으로 지속적으로 연구되어야할 과제이다.
세째, 배양된 세포의 유세포계측검색에서는 fluorescence intensity가 진주종 조직의 각질세포에서 정상 후이개부 피부조직의 각질세포보다 높게 나타났다.
네째, 진주종 조직의 각질세포에서 정상 후이개부 피부조직의 각질세포보다 EGFR이 강하게 발현된 것은 진주종 조직의 각질세포의 과다증식성향을 반영한 것으로 생각된다.
다섯째, 유세포계측검색 방법은 EGFR과 같은 세포막 수용체의 정량 및 세포의 크기와 형태를 검색하는데 있어 매우 유용한 검사법이다.
이러한 연구결과는 EGFR이 진주종 조직의 상피의 증식을 유발시켜 진주종의 발생 및 증식에 관여하고 있으며 증식된 진주종 상피는 후이개부의 정상 피부상피와는 다른 병적상태의 상피임을 시사하고 있다. 향후 중이 진주종의 병인에 있어 EGFR의 역할을 더욱 확실히 규명하기 위해서는 진주종의 증식에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 성장인자 및 cytokine과 EGFR의 관계에 대한 연구와 진주종의 발생과정에 따른 EGFR의 발현변화에 대한 연구 및 RT-PCR, in situ hybridization 방법 등 다른 방법을 이용한 중이 진주종에서의 EGFR의 발현에 대한 연구가 필요할 것이다.
REFERENCES
1) Derlackid EL, Clemis JD. Congenital cholesteatoma of middle ear and mastoid. Ann Otol Rhinol Laryngol 1965;74:706-11.
2) Buckingham RA. Etiology of a middle ear cholesteatoma, kodachrome study of pathogenesis. Ann Otol Rhinol Laryngol 1968;77:1054-8.
3) Sade J, Babiachi A, Pinkus G. The metaplastic and congenital origin of cholesteatoma. Acta Otolaryngol (Stockh) 1983;96:119-23.
4) Downward Y, Yarden Y, Mayers E, et al. Close similarity of epidermal growth factor receptor and υ-erb-B oncogene protein sequences. Nature 1984;307:521-7.
5) Kojima H, Shiwa M, Kamide Y, et al. Expression and localization of mRNA for epidermal growth factor and epidermal growth factor receptor in human cholesteatoma. Acta Otolaryngol (Stockh) 1994;114:423-9.
6) Yan S, Huang C. Tumor necrosis factor alpha in middle ear cholesteatoma and its effect on keratinocytes in vitro. Ann Otol Rhinol Laryngol 1991;100:157-61.
7) Bujia J, Schilling V, Holly M. Hyperproliferation-associated keratin expression in human middle ear cholesteatoma. Acta Otolaryngol (Stockh) 1993;113:364-8.
8) Yeo SW, Park YS, Kang JH, Suh BD. Expression of transforming growth factor-beta in middle ear cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:719-24.
9) Ergun S, Zheng X, Carlsoo B. Antigen expression of epithelial markers, collagen IV and Ki-67 in middle ear cholesteatoma. Acta Otolaryngol 1994;114:295-302.
10) Marenda SA, Aufdemorte TB. Localization of cytokines in cholesteatoma tissue. Otolaryngol Head Neck Surg 1995;112:359-68.
11) Cohen S. The epidermal growth factor (EGF). Cancer 1983;51:1787-91.
12) Huang T, Yan SD, Huang CC. Colony-stimulating factor in middle ear cholesteatoma. Am J Otolaryngol 1989;10:393-8.
13) Mary FM, James YS, Yun CY. Investigation of urinary transforming growth factor alpha level as tumor markers in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck 1990;13:411-6.
14) Neal DE, Marsch C, Bennet MK, et al. Epidermal growth factor receptor in human bladder tumors. Lancet 1985;48:366-8.
15) Sporn MB, Todaro GJ. Autonomic secretion and malignant transformation of cells. N Engl J Med 1980;303:878-80.
16) Costa S, Stamm H. Predictive value of EGF receptor in breast cancer. Lancet 1988;51:1787-91.
17) Gullick WJ, Hughes CM. Immunohistochemical detection of the epidermal growth factor receptor in paraffin-embedded human tissues. J Pathol 1991;164:285-9.
18) Tsuruhara K, Iwano T, Ushiro K. Proliferative activity of cholesteatoma epithelium. In: Nakano Y, editor. Cholesteatoma and Mastoid Surgery; Amsterdam. Kugler;1993. p.223-6.
19) King LE, Gates RE, Stoscheck CM. EGF/TGF-α receptors and psoriasis. J Invest Dermatol 1990;95:10-2.
20) Raber MM. Clinical application of flow cytometry. Oncology 1988;2:35-9.
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
