Evaluation of Regenerative Cell Kinetics of Rat Thyroid Gland by Immunohistochemical Staining of Proliferating Cell Nuclear Antigen and Bromodeoxyuridine.

Choi, Young Seok; Shin, See Ok; Yang, Sang Kwon

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(1); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(1): 77-84.

Evaluation of Regenerative Cell Kinetics of Rat Thyroid Gland by Immunohistochemical Staining of Proliferating Cell Nuclear Antigen and Bromodeoxyuridine.

Young Seok Choi, See Ok Shin, Sang Kwon Yang

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Chungbuk National University, Cheongju, Korea.

흰쥐 재생 갑상샘에서 PCNA와 BrdU 표지의 비교

최영석 · 신시옥 · 양상권

충북대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: 갑상샘ㆍ세포분열ㆍPCNAㆍBrdU.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Follicular cells of the thyroid gland has been considered an important factor affecting the thyroid gland regeneration.[(3)H]Thymidine autoradiography and immunohistochemical staining with BrdU have been commonly used and are reliable techniques for examining cell proliferation. However, these methods are not suitable for the routine analysis of cell proliferation kinetics, because they are fraught with problems such as needing fresh tissues and handling radioactive or toxic susbstances used as markers. The purpose of this study is to investigate the utility of immunohistochemical staining with a monoclonal antibody to PCNA during the healing process of a rat thyroid gland. We also compared this method with the immunohistochemical staining using a monoclonal antibody to BrdU.
MATERIALS AND METHODS:
We investigated the proliferative activity in regeneration of the partially resected rat thyroid tissue by using immunohistochemical stainings of PCNA and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). The two methods were compared.
RESULTS:
Cell proliferative activity of regenerated follicular cells around the resected margin showed a continuous acceleration for 72 hours, and the PCNA-labeled cells stained the nuclei as clearly discernible as those of the BrdU-labeled cells. In addition, the immunohistochemical staining of PCNA provided reproducible and quantifiable results without the requirement of pretreatment.
CONCLUSION:
Immunohistochemical staining of PCNA and BrdU may represent as a useful technique for analysis of proliferative activity during regeneration of the thyroid glands in rats.

서론 갑상샘은 호르몬을 생산, 저장, 분비하는 내분비기관으로 소포세포(follicular cell)와 C-세포로 구성된 소포(follicle)로 이루어져 있고 각각의 소포는 결합조직의 특수한 형태인 기저막(basement membrane)에 의해 둘러 싸여져 있다. 갑상샘과 같이 내배엽에서 유래되어 내분비기능을 하는 췌장이나 간 등은 절제 등의 수술적 외상이 가해졌을 때 왕성한 재생을 보이며 이에 관한 많은 연구가 이루어져 있다.1) 그러나 갑상샘은 외과적 손상이 드물지 않음에도 불구하고 재생에 대해서는 지금까지 실험동물을 대상으로 한 소수의 연구만이 시행되었을 뿐 갑상샘 소포의 재생에 관해서는 지금까지 그다지 알려진 바가 없었으나 최근의 연구에서 갑상샘 부분절제 후의 재생 과정에서 소포를 둘러 싸고 있는 기저막의 성분이 재생 시기에 따라 그 성분이 변한다는 것이 알려졌다.2) 또한 이 연구에서 재생에 따른 세포의 분열능력을 proliferating cell nuclear antigen(이하 PCNA라 함) 염색에 의하여 추적한 바 있다. 그러나 PCNA만으로는 재생능력이 충분히 파악되지 못할 소지가 많은 것으로 생각이 되어 PCNA와는 다른 의미에서 세포분열능력을 반영하는 5-bromo-2'-deoxyuridine(이하 BrdU라 함)법을 사용하여 갑상샘 재생에 따르는 세포분열능력 및 양상을 파악하고자 하였다. 재료 및 방법 성숙한 숫흰쥐를 대상으로 갑상샘 부분절제를 시행하고 일정한 시간이 경과한 후에 이를 희생하여 PCNA와 BrdU에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하고 양성세포를 계수하여 두 결과의 관계를 규명하였다. 실험동물 및 실험군 실험동물로는 체중 300 gm 전후의 건강한 SpragueDawley 계의 건강한 숫흰쥐를 사용하였다. 실험군은 각각 정상 대조군과 갑상샘 절제군으로 나누었으며 갑상샘 절제군은 다시 술후 1, 2, 3, 4, 5 및 7일군으로 나누었고, 각각의 실험군당 실험동물은 5마리씩이었다. 갑상샘 부분절제를 위한 수술의 시행 대상 흰쥐는 Ketamine 0.6 ml(50 mg/ml)를 복강 내에 주사하여 마취시켰다. 마취된 흰쥐를 뒤집어서 고정시킨 후 목 앞부분의 피부를 정중선을 따라 절개하여 외측으로 젖혔다. 목의 정중선에서 길이로 위치하고 있는 sternohyoideus muscle을 노출시키고 이 근육의 외측연을 잡고 내측으로 젖혀서 갑상샘을 노출시켰다. 시야를 좀더 확보하기 위하여 serratus ventralis cervicis muscle과 scalenus muscle의 내측면을 외측으로 젖혔다. 이후 갑상샘의 뒷면을 기관(trachea)벽으로부터 분리시켜 갑상샘의 크기를 확인하였으며 노출된 갑상샘은 그 실질을 50∼60% 가량 제거 하되 제거하는 부분은 엽(lobe)의 외측부분으로 위아래 방향이 되도록 하였다. 이 과정에서 갑상샘으로 들어가는 큰 혈관들이 손상되지 않도록 주의하였으며 또한 갑상샘의 외측에 붙어있는 부갑상샘이 함께 절제되지 않도록 하였다. 절제가 끝난 후 약 1∼2분간 압박하여 지혈을 시행하였다. 이러한 갑상샘의 절제과정은 입체현미경 하에서 하였으며 좌우 갑상샘에서 동일하게 시행하였다. PCNA와 BrdU에 대한 면역조직화학적 염색을 위한 시료의 준비 동물의 희생 수술 후 실험 날짜에 해당하는 날, 희생 2시간 전에 생리식염수에 녹인 BrdU(Sigma chemical Co., 20 mg/ml)를 실험동물의 복강에 100 mg/kg 씩 주사하였다. 흰쥐를 ether로 마취하고 심장을 통하여 약 200 ml의 생리식염수를 관류하였다. 이후 고정액을 사용한 관류고정없이 바로 기관과 식도를 포함한 갑상샘을 적출하여 이를 재빨리 Methacarn solution(methanol：chloroform：ac-etic acid＝6：4：1)에 넣어 4℃에서 24시간 고정하였다. Paraffin embedding 고정이 끝난 조직은 100% ethanol에서 1시간씩 3회에 걸쳐 탈수하고 xylene 처리를 거쳐 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직은 5 μm의 두께로 연속절편을 시행하고 매 60장의 절편마다 열 장 씩의 절편을 서로 다른 세 부위에서 조직을 취하되 두장의 연속절편을 한 장은 PCNA에 대한 염색을 하고 다른 한 장은 BrdU에 대한 염색을 시행하였다. 유리 슬라이드에 올려 건조하는 과정에서 열은 가하지 않고 공기 중에서 말렸다. PCNA에 대한 면역조직화학적 염색 갑상샘 절제에 따른 재생에 동반하는 세포분열의 지표로서 PCNA에 대한 염색을 시행하였다. 파라핀 절편을 xylene과 alcohol을 거쳐 함수시킨 후 다음과 같은 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 1차항체 반응으로 단세포군의 anti-PCNA Ab(Biodesign M01103M)를 1：50이 되도록 희석하여 4℃에서 20시간 가량 조직에 반응시킨후 PBS로 10분씩 3회 세척하고 PCNA 염색에 대한 2차 항체 반응으로 anti-mouse IgG Ab(Sigma M9902) 1：100용액을 실온에서 40분 반응시키고 다시 PBS로 10분씩 3회 세척하였다. PCNA 염색에 대한 3차 항체 반응으로 PAP(Sigma P2416, in mouse) 용액을 1：100이 되도록 희석하여 실온에서 40분 반응시키고 PBS로 10분씩 3회 세척하고 0.05 M acetate buffer(pH 6.0)로 10분간 1회 세척한후 PCNA에 대한 발색반응으로 nickel chloride를 첨가한 0.025% 3,3-diaminobenzidine in PBS 용액에 hydrogen peroxide를 0.045% 첨가하여 실온에서 3분 가량 발색하였고 Acetate buffer(0.1 M, pH 6.0)로 10분간 2회 세척한후 PBS로 10분씩 3회 세척 다시 증류수로 간단하게 세척하고 필요에 따라 Mayer’s hematoxylin으로 대조 염색을 시행하고 통상의 탈수과정을 거쳐 polymount로 봉입하였다. BrdU에 대한 면역조직화학적 염색 파라핀 절편을 xylene과 alcohol을 거쳐 함수시킨 후 다음과 같은 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. DNA denaturation을 위하여 37℃ 2 N HCl 용액에서 20분간 반응시킨후 1차 항체 반응으로 단세포군의 anti-BrdU Ab(MONOSAN 8003)을 1：50이 되도록 희석하여 4℃에서 20시간 가량 조직에 반응시키고 2차 항체 반응으로 anti-mouse IgG Ab(Sigma M9902) 1：100 용액을 실온에서 40분 반응시켰다. 3차 항체 반응으로 PAP(Sigma P2416, in mouse) 용액을 1：100이 되도록 희석하여 실온에서 40분 반응시킨후 0.05 M acetate buffer(pH 6.0)로 10분간 1회 세척하고 nickel chloride를 첨가한 0.025% 3,3’-diaminobenzidine in acetate buffer 용액에 hydrogen peroxide를 0.045% 첨가하여 실온에서 3분 가량 발색반응을 시켰다. PCNA 및 BrdU 양성 세포의 계수 와 표지율 갑상샘소포를 이루고 있는 세포중에서 PCNA 양성세포와 BrdU 양성세포를 각각 계수하였다. 계수할 부위는 광학현미경 400배 시야에서, 한 절편의 한쪽엽 각각 2군데씩 양쪽 4곳을 선정하였으며 1부위에서 각각 5절편을 계수하였으며 서로 다른 부위 3군데에서 계수하였다. 표지율(labeling index)은 갑상샘소포를 이루고 있는 세포중에서 PC NA와 BrdU 양성세포와 PCNA와 BrdU 음성세포를 계수하고 이 두 종류 세포의 합계에 대한 PCNA와 BrdU 양성세포의 백분율로 하였다. 얻어진 자료는 repeated meas-ured analysis of variety(ANOVA) test를 사용하여 검증하였다(p<0.05). 결과 PCNA에 대한 면역조직화학적 염색 소견 Nickel-DAB에 의하여 발색된 PCNA에 대한 염색은 검정에 가까운 짙은 갈색으로 핵에 국한되어 나타났다. 1차 항체를 반응시키지 않은 조직에서는 전혀 발색이 되지 않아서 이 염색의 특이성을 확인시켜 주었다. 발색된 장소는 비록 핵에 국한되어 나타났지만 발색의 정도는 한 조직 표본에서도 매우 다양하여 아주 진한 것부터 겨우 알아볼 정도로 흐린 것까지 다양하였다. 또한 식도나 기관점막상피의 기저층에 위치한 기저세포들이 PCNA에 양성을 보이기 때문에 이들의 염색 여부로써 positive control을 삼을 수 있었다. 수술을 시행하지 않은 대조군에서 PCNA 양성세포는 비교적 드물어서 전체 소포세포중에서 400배 현미경 시야에서 나타나는 빈도수가 평균 2, 3개이었고 표지율은 2.5%이었다. PCNA 양성세포의 분포는 대체적으로 균일하였으나 좁은부분(isthmus)에서 그 출현빈도가 다소 높은 경향을 보였다. 또한 엽의 중앙보다는 위나 아래 끝에서 양성세포가 다수 관찰되는 경향을 보였다. 수술군에서 PCNA 양성세포의 비율은 급격히 증가하여 수술 후 1일에는 표지율이 11.5%, 2일에는 18.6%, 3일에는 26.4%, 4일에는 13.2%, 5일에는 11.2%, 7일에는 3.1 %로, 수술 후 2, 3일 특히 3일 경에 최고의 수치를 보인 후 감소하는 양상을 보였다(Table 1)(Figs. 1-5). 한편 수술 후 7일에는 정상대조군과 비슷한 수치를 보였다. 한 개체에서 PCNA 양성세포의 갑상샘 조직내의 분포는 다소 불균등한 모습을 나타내었다. 즉, 양성세포가 엽 전체에 걸쳐 나타나기는 했지만 두 가지 양상을 보여서 어떤 경우는 하나의 소포에 1∼2개씩 흩어져 나왔으나 또 다른 경우는 여러개의 양성세포가 무리를 이루어 나타났다. 후자의 모습은 특히 절제면에 인접한 곳과 좁은부분(isthmus) 등에서 두드러졌다. 이외에 혈관내피세포가 양성반응을 보이는 경우도 있었으며 이런 경우에는 내피세포의 핵이 커져 있는 경우가 많았다. BrdU에 대한 면역조직화학적 염색소견 Nickel-DAB에 의하여 발색된 BrdU에 대한 염색은 PCNA에 대한 염색소견과 유사하게 핵에 국한되어 나타났다. 1차 항체를 반응시키지 않은 조직에서는 전혀 발색이 안되는 것과 염색의 정도가 한 조직 표본에서도 매우 다양하게 나타난 것도 유사하였다. 수술을 시행하지 않은 대조군에서 BrdU 양성세포는 비교적 드물어서 현미경 400배 시야의 한 영역(field)에서 1개 내지 2개의 양성세포가 발견되었으며 표지율은 1.2% 이었고, 대체적으로 분포가 균일하였지만 좁은부분 (isthmus)에서 그 출현빈도가 다소 높은 경향을 보였다. PC NA와 마찬가지로 엽의 중앙보다는 위나 아래 끝에서 양성세포가 다수 관찰되는 경향을 보였다. 수술군에서 BrdU 양성세포의 비율은 급격히 증가하여 술후 1일에는 표지율이 8.3%, 2일에는 13.6%, 3일에는 20.1%, 4일에는 12.3%, 5일에는 8.7%, 7일에는 1.9%가 각각 관찰되어서 수술 후 2, 3일 특히 3일 경에 최고의 수치를 보인 후 감소하는 양상을 보여 PCNA 염색과 유사한 소견을 보였다(Table 2). 한 개체에서 BrdU 양성세포의 갑상샘 조직내의 분포는 다소 불균등한 모습을 나타내었다. 즉, 양성세포가 엽 전체에 걸쳐 나타나기는 했지만 PCNA 염색과 마찬가지로 두 가지 양상을 보여서 어떤 경우는 하나의 소포에 1∼2개씩 흩어져 나왔으나 또 다른 경우는 여러개의 양성세포가 무리를 이루어 나타났다. PCNA와 BrdU표지의 통계학적 분석 수술 후 제 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일째에 계수된 PCNA 양성세포 표지율과 BrdU 양성세포의 표지율을 비교하였다. 절대수는 PCNA 양성세포가 BrdU에 비하여 더 많은 양상을 보였으며 3일째에 가장 높은 것과 시간이 지날수록 양성세포의 계수가 감소하는 것과 7일째에는 정상대조군과 비교하였을 때 비슷한 것은 양쪽이 모두 동일하였다(Fig. 6). 시간에 따른 양성세포의 계수가 변화하는 양상은 양쪽 군이 유사하였으며(p<0.01, repeated measured ANOVA test) 두 군간에 양성세포의 표지율이 변화하는 양상은 유사하였다(p<0.01, repeated measured ANOVA test). 고찰 본 실험에서는 흰쥐의 갑상샘을 수술적으로 부분절제한 후 잔존 갑상샘 조직을 파라핀 포매로 고정하고 PCNA와 BrdU에 대한 monoclonal Ab를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하여 재생에 따른 세포분열능력에 대하여 정량적인 결과를 얻었다. Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)은 cyclin이라고도 불리우는 내인성 단백질(endogenous protein)로서 분자량이 대략 34kD이며 세포분열시기 중에서 G1, S 그리고 나아가서는 G2 시기에 나타나는데 특히 합성기에 최고치를 보이며 그 역할은 DNA polymerase delta의 cofactor의 작용을 하는 것으로 알려져 있으며 합성기(S phase) marker로서 cell proliferation의 정도를 평가할 수 있는 척도를 제공한다.3-5) 가끔 과평가(over estima-tion)의 소견을 나타내기도 하고,6) late G1기와 S기에서 나타나는 것으로 생각이 되지만,7) 여러 저자에 의하면 일반적으로 PCNA의 immunoreactivity는 S기와 잘 부합이 된다고 한다.4) 그리고 실제로 Xenopus embryos에서는 PCNA가 오직 S기에서만 관찰이 되는 것으로 알려져 있다.8) 이러한 여러 증거를 근거로 PCNA에 대하여 면역조직화학적으로 검색함으로써 세포분열정도를 확인하는 새로운 방법으로 많이 사용되고 있다. 여러 장기를 대상으로 한 많은 연구에서 PCNA법에 의한 표지율(labeling index, LI)은 자가방사기록법이나 flow cytometry에 의한 합성기 분획과 BrdU를 사용했을 때의 표지율과 매우 높은 상관관계를 보여주고 있다9)10) 또한 PCNA법은 앞서 언급된 두 방법과는 달리 사전 조작없이 바로 사용할 수 있다는 장점이 있고 연구자에 따라서 PCNA법은 BrdU법에 비하여 5배의 민감도를 나타낸다는 보고도 있다.11) 그러나, PCNA에 의하여 반영되는 세포주기의 분획은 앞서 언급한 두가지 방법에 의하여 반영되는 세포주기의 분획과는 그 의미가 다르다. 즉, 3H-thymidine이나 BrdU는 일단 DNA에 끼어들면 시간이 지나도 간직된 채 있게 되며 따라서 세포의 분열한 정도를 나타내주는 지표이나 PCNA는 유사분열을 이루기 전인 G1, S, G2기에 나타났다가 10시간 내지 20시간 후에는 사라지기 때문에12)13) G2기를 지나 G0기에 들어선 세포도 염색될 수 있으며 이렇게 염색된 세포무리는 세포분열분획(proliferation fraction)을 나타내기 보다는 성장분획(growth fraction)을 반영하는 의미가 있다.9)10) 따라서 PCNA법에 의한 결과를 해석함에 있어서는 그 의미의 해석에 주의를 해야 할 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고 PCNA 염색법과 BrdU 염색법을 비교한 많은 연구에서 이 두 방법은 그 결과가 잘 일치하기 때문에 많은 연구자들이 PCNA법을 활용하고 있는 실정이다.11) 본 연구에서는 갑상샘 부분절제에 따라 휴지상태(quiescent state)에 있던 갑상샘 구성세포들이 세포주기를 시작하는 시기에 PCNA 염색법과 BrdU 염색법을 시행하여 일정한 기간동안 일어난 상태를 시간별로 또 두 염색법의 결과를 비교 분석하였다. 3H-thymidine 자가방사법과 BrdU-labeled S-phase cells에 대한 면역화학염색법은 많은 실험동물에서 정확한 세포분열의 표지(markers)로 이용되어져 왔다.14) 그러나 이러한 방법들은 여러 단점을 지니고 있는데 예를 들면 신선한 조직이 필요하고 조직을 배양하여야 하며 인체에 해로운 표지물질을 이용하여야만 한다는 것이다. 세포분열과정을 분석하기 위하여 여러 가지의 monoclonal antibodies를 이용하여 Ki-67이나 DNA polymerase alpha와 같은 것에 면역조직화학적 염색을 이용한 방법은 다른 방법에 비하여 많은 장점을 지니고 있다. 이 방법은 조직의 구조를 그대로 유지하면서 조직의 배양을 필요로 하지 않는다.15) 그렇지만 이러한 방법은 신선한 동결조직을 필요로 하기때문에 단점이 없는 것은 아니다. 파라핀에 포매된 고정된 조직에서 PCNA를 인식하는 monoclonal antibody가 세포증식의 과정을 잘 나타내는 것으로 알려졌다. 이러한 PCNA 염색법은 다른 방법들에 비하여 더 쉽고 효과적이며 덜 위험하다. 세포주기에서 DNA 합성과정 동안이나, S기 동안에 thymidine이 이용된다. 이 thymidine의 analogue인 BrdU 에 대한 monoclonal antibody가 발견되면서 “S-phase labeling index”를 in vivo 상태에서나 in vitro 상태에서 immunoperoxidase technique을 이용하여 측정할 수 있게 되었다. 이 표지율(labeling index)은 proliferating cell population을 정확히 평가할 수 있고 안전하게 사용할 수 있는 방법이지만 체외 방법(in vitro method)을 이용한 표지법은 신선한 조직이 필요하므로 생검을 한 조직이나 사전 약물을 투입하지 않은 과정이 필요하다.16) BrdU는 thymidine analogue로서 signal-stranded DNA와 결합을 하며, BrdU에 대한 면역조직화학적 염색법은 세포주기의 S 기에 있는 세포들을 표지하는데 이용되어져왔다. 다른 저자들은 PCNA 염색법이 암세포나 다른 실험동물 모델에서 나타난 S기 분획(S phase fraction)보다 더 높은 표지율을 나타낸다고 하였다. 4) 본 저자는 흰쥐에서 수술적으로 갑상샘을 부분절제한후 1, 2, 3, 4, 5, 7일째 각각의 쥐들을 희생시켜 PCNA와 BrdU에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였는데 결과 PCNA 표지율이 BrdU 표지율보다 실험 첫날부터 끝까지 높게 나왔다. 그리고 실험기간내 표지율의 변화하는 양상은 PCNA와 BrdU의 양군에서 제 3 일째에 가장 높게 나왔으며 점차로 감소하는 추세를 보였고 7일째에는 정상대조군과 비슷한 양상을 볼 수 있었으며 이는 통계학적으로 의미가 있었다. 이러한 결과를 미루어 보면 PCNA의 면역조직화학적 염색법에 의한 표지율은 합성기 분획뿐만 아니라 세포주기중에서 합성기 분획 외의 세포도 표지한다고 할 수 있다. Woods등 17)에 의하면 PCNA 표지율은 S, G2, M기 분획을 모두 더한 곳에서 나온다고 하였으며 소화기 악성 림프종에서 flow cytometry에 의하여 조사한 결과 PCNA의 면역반응도와 합성기 분획은 비례관계에 있다고 하였다. 하지만 더 많은 조사와 연구가 PCNA 면역반응도에 대하여 이루어져야 할 것으로 사료된다. 세포주기와 세포성장을 연구하기 위하여 PCNA법과 BrdU법을 같이 사용하는 것은 다른 연구법에 비하여 세포의 구조를 그대로 유지할 뿐만 아니라 같은 조직 표본에서도 다른 항원들을 쉽게 찾을 수가 있는 장점이 있다. 이 방법은 임상적 분석이나 실험 모델에서도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각되며 실험 모델이나 인체를 이용하여 세포분열의 역학(proliferation kinetics)을 연구하면 갑상샘 재생에 대한 새로운 접근법을 제공할 것으로 생각된다. 결론 갑상샘 부분절제를 시행하고 그에 따른 재생과정에서 형태적 관찰 및 PCNA와 BrdU에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 이들의 시간에 따른 변화를 비교 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1) PCNA에 의하여 반영된 소포세포의 증식도는 수술 후 3일에 최고치를 보였고 7일 이후에는 대조군과 유사하게 나타나서 부분절제 후 소포세포의 증식은 수술 후 1주일 이내에 왕성하게 일어나는 것으로 생각되었다. 2) PCNA 표지율은 BrdU 표지율에 비하여 실험기간 내내 높게 나타났고 이 두 표지율은 모두 대조군에 비하여 의미있게 유사했다.
REFERENCES
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