| Detection of Epstein-Barr Virus DNA in Oropharynx by Polymerase Chain Reaction. |
| Nam Yong Doh, Wan Soo Kim, Sung Hyun Kim, Jun Han Lee, Do Yong Lee, Bong Nam Choi |
| Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery, College of Medicine, Chosun University, Kwang-Ju, Korea. |
| 구인두에서 중합효소 연쇄반응에 의한 Epstein-Barr Virus DNA 검출 |
| 도남용 · 김완수 · 김성현 · 이준한 · 이도용 · 최봉남 |
| 조선대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
구인두 세척ㆍ중합효소 연쇄반응ㆍE.B.V. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpes virus which causes infectious mononucleosis and is associated with such human cancers as Burkitt's Lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, and nasopharyngeal carcinoma. However, the role of EBV as a causative factor in other head & neck tumors is not fully elucidated. This study analyzed the detection rate of Epstein-Barr virus (EBV) in the throat washing samples from pateints with head and neck tumors and non-malignant diseases, as well as from normal subjects.
MATERIALS & METHODS: The throat washing samples were collected from 49 patients of head & neck tumors, 52 patients of non-malignant diseases (pharyngitis and tonsillitis) and 24 normal subjects. The EBV DNA was detected by using the EBV (BNRF1)-specific primers & Polymerase Chain Reaction (PCR).
RESULT: The EBV DNA was detected in 25 (51%) of the 49 throat washing samples from patients with tumors, as well as 3 (60%) of 5 samples from patients with nasopharyngeal carcinoma, and 22 (50%) of 44 samples from patients with head and neck tumors. The throat wasing samples from 52 patients with non-malignant diseases and 24 samples from healthy subjects were also examined. EBV was detected in 17 (32.7%) of 52 patients with non-malignant diseases and 3 (12.5%) of 24 samples from healthy subjects.
CONCLUSION:
These data indicate that the EBV may be related to non-malignant diseases and head and neck tumor. |
| Keywords:
Epstein-barr virus(EBV)ㆍPolymerase chain reaction(PCR)ㆍThroat washing |
서론
Epstein-Barr virus(EBV)는 Epstein등 1)에 의해 Burkitt씨 림프종 세포에서 처음으로 발견된 double-stranded DNA 바이러스로 인형 헤르페스 바이러스에 속하며, 전염성 단핵구증, Burkitt씨 림프종, 비호지킨스(Non-Hodgkin’s)림프종 및 호지킨스(Hodgkin’s) 림프종 등의 유발에 관여하고 특히 비인강암 등의 종양과도 관계가 있는 것으로 알려져 있다.2-4) 근래에는 편도염등의 염증성 질환의 원인균으로도 증명되었으며, 두경부 악성종양의 일부도 EBV의 감염과 관계가 있다는 보고가 증가되고 있으며 또한 정상인에서도 상당수가 EBV에 감염되어 있다는 보고가 많다.5)6)
EBV의 검출을 위한 검체로 종양조직을 이용하거나 혈청학적 검사등을 많이 이용하였으나 근래에는 타액이나 구강 및 인두 세척액에서 검출한 보고도 증가되고 있다. 따라서 저자들은 두경부 악성종양환자, 인두 및 편도의 염증성 질환자 그리고 정상인 등에서 병변 조직이 아닌 구인두 세척(throat washing)에 의해 가검물을 채취하여 EBV의 검출에 민감도가 높은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 EBV를 검출하여 구인두 감염율을 분석하고자 연구를 시행 하였다.
대상 및 방법
대상
1995년 7월부터 1996년 12월까지 본원 이비인후과에서 조직생검으로 확인된 두경부 악성종양 환자 49례, 인두 및 편도염 환자 52례와 이학적 소견상 정상소견을 보인 의학과와 간호학과 학생 24례을 대상으로 하였으며 환자들은 치료전 상태에서 구인두의 세척액을 채취하였다. 대상자의 남녀 비는 72：53 이었고, 연령 분포는 5세에서 88세까지 였으며 평균연령은 36.9세였다.
방법
DNA 분리
15 ml의 인산 완충 용액(phosphate buffered saline)으로 30초 동안의 구인두 세척 후 얻은 검체를 3500 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 침전물을 무균상태의 1.5 ml eppendrof tube로 옮기고, 20% cheating resin인 Imminodiacetic acid(Sigma, St. Louis, MO)가 포함된 증류수 300 μl를 첨가하여 56℃에서 30분동안 가온시킨후 15분간 끓였다. 끓인후 15,000 rpm으로 10분간 원심분리시키고 500 μl의 eppendorf tube에 옮긴후 0.1×TE(1×TE：10 mM, Tris, 0.1 mM EDTA)가 되도록 처리한후 -20℃에서 사용할때까지 보관하였다.
중합 효소 연쇄반응을 이용한 EBV-DNA의 검출
중합 효소 연쇄 반응 혼합액은 구인두 세척에 의해 분리된 DNA 10 μl와 25 pM의 oligonucleotide primer 1, 2와 200 mM의 4 dNTP(Boehringer Mannheim, Germany), 10X reaction buffer(USB, Amersham, USA), 15 mM MgCl 2(USB, Amersham, USA), 0.625 Unit Taq polymerase(USB, Amersham, USA)와 170 μg/ml의 bovine serum albumin(Janssen, Belgium)으로 제작하여 250 μl의 eppendorf tube에 넣은 후 50 μl의 mineral oil(Sigma)을 첨가하여 DNA Thermal cycler(UNO-Thernoblock, Biometia, Germany)에서 30 cycle을 증폭하였다. 처음 29 cycle의 변성(denaturation)은 95℃에서 120초, 결합(annealing)은 68℃에서 99초, 연장(elongation)은 72℃에서 120초이었으며, 마지막 cycle의 사슬연장(postelongation)은 72℃에서 420초를 시행하였다. Oligonucleotide primer는 BNRF 1(5'oligo：5'GGT, AGG TCC CCT GGA CCT GCC GCT3', 3'oligo；5'CCC TCC CTC AGG TCC AAC GAC ACT3’) 이었다 양성대조군은 Raji 세포주를 이용하였으며, 음성대조군으로는 세척하지 않은 인산 완충 용액을 사용하였다. 증폭된 PCR생성 용액 10 ml을 2% 한천에서 분자량 표식자(USB, Life science)을 이용하여 전기 영동한 후 ethidium bromide를 이용하여 염색한 다음, 자외선등(UV/DNA, photographic system SLⅢ, Vilber Lourmat, TFP-20 M, France)에서 검색하였다.
통계 처리
통계처리는 Chi-square검정법을 이용하였으며, 유의 수준은 95%로 하였다.
결과
중합 효소 연쇄반응의 산물을 전기영동한 결과 전체 125례중 45례(36.0%)의 구인두 세척검체에서 225 bp 크기의 EBV에서 증폭된 DNA band를 확인하였다(Fig. 1).
49례의 악성종양 환자중 25례(51.0%)에서 양성을 보였으며, 이중 후두암이 19례중 10례(52.6%), 구강 및 구인두암이 18례중 9례(50.0%), 비인강암은 5례로 숫자는 적었으나 3례(60.0%)에서 양성을 보였고 이는 통계적으로 유의한 결과를 보였다(p<0.05). 기타 악성 종양 7례중 상악동암, 이하선의 악성종양, 비강의 악성림프종 각 1례에서 양성을 보였다. 비인강암 5례는 WHO Ⅱ형(non-keratinizing epider-moid cancer) 1례, WHO Ⅲ형(undifferentiated cancer) 4례 였으며, 이중 WHO Ⅲ형 3례에서 양성을 보였다. 인두 및 편도염 환자는 52례중 17례(32.7%)에서 양성을 보였으며, 정상인은 24례중 3례(12.5%)에서 양성을 보였다(Table 1).
고찰
Epstein-Barr Virus(EBV)는 지역적인 빈도차이는 있으나 전세계적으로 널리 퍼져 있으며 대부분 무증상의 감염을 일으키는 인형 헤르페스 바이러스로서 150∼180 nm의 크기를 가지며 EBV-DNA유전자는 175 K 염기쌍으로 구성되어 있으며, 다른 헤르페스 바이러스군 처럼 상피세포에서 감염되고 증식할수 있다.7) EBV의 자연숙주는 인간에 국한되어 있으며 보균자의 타액에 의해 다른사람에게 감염되고, 구인두에서 처음 감염을 일으켜서 타액선, 인두의 상피세포 그리고 림프계 조직에서 바이러스의 증식이 일어난다고 하며4) 대부분의 전염성 단핵구증 환자,3)4)8) 면역억제제를 투여 받고 있는 환자의 50%이상9) 그리고 EBV항체 양성인 건강인의 20% 이상10)에서 타액에 존재한다고 보고되었다. 그러나 EBV의 감염기전에 대해서는 아직 확실한 기전이 밝혀지지는 않았으나 B 림프구의 표면에 존재하는 CD21 수용체를 통하여 이루어 진다고 알려져 있으며 CD21 수용체의 제한적 분포 때문에 숙주세포에 대해 제한적인 감염을 유발한다고 한다.11) 또한 EBV 감염후 감염세포의 불멸화과정은 여러종류의 EBV 유전자 산물에 의해 이루어 지며 이중 핵항원인 EBNA1, EBNA2 그리고 LMP1이 EBV와 관련된 악성종양의 병인 기전에 관여한다고 한다.12)
EBV의 검출방법으로 현재 많이 이용되는것으로는 virus의 DNA sequence를 밝혀내고 이를 이용한 DNA hybridization에 의해 EBV를 검출하는 southern blot hybridization이나 in situ hybridization(ISH)법과 중합효소 연쇄반응(PCR)법 등이 있다. 이중 ISH법은 감염된 세포의 조직내 위치 및 세포내 감염부위를 알수있어 특이성이 높으나 각 세포에서 virus genome이 많이 있어야 검출이 가능하기 때문에 민감도가 떨어지는 단점이 있다. 그러나 중합효소 연쇄반응법은 미량의 virus DNA sequence도 검출할 수가 있어 민감도가 높은 장점은 있으나 조직의 분쇄로 인해 특이성이 낮다는 단점이 있다.
EBV와 비인강암과의 관계를 규명한 보고는 많이 있는데 Ichiro등13)은 비인강 암조직에서 EBV를 검출한 결과 WHO Ⅰ형에서 71.4%, Ⅱ형에서 61.5%의 검출율을 보고하였고, Jeng등14)이나 Tyan등15)은 대만인을 대상으로한 인종적 특성을 갖기는 하지만 비인강암 조직 전부에서 양성반응을 보였다고 하였다. 국내 보고를 보면 서 등6)은 비인강암조직에서 PCR을 이용하여 EBV를 검출한 결과 WHO Ⅱ형 50%, Ⅲ형 91.6%의 양성율을 보고하였고, 민 등 16)은 ISH 법으로 검출한 결과 미분화세포암은 86.95%, 편평세포암은 72.72%라고 보고하였으며, 그외 대부분의 보고들도 비인강암이 EBV와 밀접한 관계가 있다고 하였다.
그러나 비인강암을 제외한 두경부 영역의 암과 EBV와의 관계에 대한 연구는 미흡한 실정이
다. Brichacek등17)은 성문상부암 5례중 3례에서 EBV DNA양성을 보고하였고, Gan등18)은 구강암조직의 PCR검색으로 66%의 검출율을 보고하였다. Jeng등14)은 두경부 암조직에서 PCR을 이용하여 검색한 결과 하인두암과 후두암은 각 3례중 2례, 구인두암은 3례중 1례에서 EBV를 검출하였고, Tyan등15)도 두경부 암조직에서 PCR을 이용한 검색결과 하인두암 12례중 8례, 후두암 10례중 6례, 타액선암은 전예에서 그리고 구강암은 9례중 4례에서 검출하여 대부분의 보고들이 높은 검출율로서 EBV 감염과의 관련을 보고하고 있다. 그러나 민 등16)은 후두암 조직에서 17.95%의 검출율을 보고하여 민감도가 낮은 ISH법이라는 차이는 있으나 타 보고자 보다 낮은 성적을 보고하였다.
암조직을 사용한 직접적인 EBV 검출에서 연관성이 확인되므로 직접적인 조직의 채취없이 구인두나 비인두의 세척액에서 EBV를 검출하여 두경부암과의 관계를 규명하고자한 연구가 시도되고 있다. Hording등19)은 후비강의 세척액을 PCR을 이용하여 검색한 결과 덴마크인은 35%, 그린랜드인은 81%의 EBV 양성율로 EBV 감염의 인종간 차이를 보고하였다. Sixbey등20)은 구강세척 검체에서 PCR을 이용하여 건강인의 경우 22%, 면역억제재를 투여중인 환자는 55.6%의 EBV 양성율로서 면역결핍 환자들이 EBV에 많이 감염되었음을 보고하였다. 또한 Jeng등14)은 건강인 47%, 비종양성 질환자 46%라는 높은 감염율을 보고하였는데 이는 대만인이라는 인종적 특성이 관여된 것으로 생각된다. 저자들의 경우는 정상인의 구인두 세척검체에서 12.5%, 인두염이나 편도염 환자의 경우 32.7%의 감염율로서 타 보고자에 비하여 낮은 결과를 보였다. Jeng등14)은 두경부 악성종양 환자의 구인두 세척검체에서 PCR을 이용하여 EBV를 검출한 결과 비인강암 78%, 후두암과 하인두암이 각각 65%, 구인두암 60% 등으로 두경부암에서 건강인의 47%에 비하여 유의하게 높은 검출율을 보고하였다. 저자들의 결과도 비인강암 60%, 후두암 52.6%, 구강 및 구인두암 50%로서 정상인에 비하여 유의하게 높은 검출율을 보였다. 이 결과등으로 보아 비인강암 뿐만 아니라 다른 두경부암과도 EBV 감염은 관계가 있는 것으로 생각되며 병변조직이 아닌 구인두 세척액을 이용한 EBV 검출도 유용한 방법으로 생각되나 구인두의 감염이 두경부 종양과의 친화성 때문인지 또는 종양의 직접 유발요인으로 작용했는지는 보다 많은 예를 이용한 지속적인 연구가 필요할것으로 보여진다.
결론
EBV감염이 비인강암과 그외의 두경부 악성종양 이나 구인두 염증성 질환과의 연관성에 관하여 알아보기 위하여 직접적인 조직의 채취보다 간편한 구인두 세척에 의한 검체로부터 DNA를 분리하고 EBV의 검출에 민감도가 높은 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 정상인, 두경부 악성종양환자 그리고 염증성 질환자에서 EBV를 검출하여 다음의 결과를 얻었다.
1) 정상인 24례중 3례(12.5%)에서 EBV가 검출되었다.
2) 49례의 악성종양 환자중 25례(51.0%)에서 검출되었으며 이중 후두암이 19례중 10례(52.6%), 구강 및 구인두암이 18례중 9례(50.0%), 비인강암이 5례중 3례(60.0%) 에서 양성을 보였고 이는 통계적으로 유의하였다(p<0.05).
3) 인두 및 편도염 환자는 52례중 17례(32.7%)에서 EBV가 검출되었다.
따라서 EBV감염이 정상인의 낮은 감염율에 비하여 염증성질환이나 두경부 악성종양환자의 감염율이 높게 나타나 두경부 악성종양과 어느정도 관계가 있는것으로 생각되나 EBV가 직접 암의 유발요인으로 작용했는지는 지속적인 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
REFERENCES
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