| Amplification and Overexpression of Cyclin D1 in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. |
| Sang Hyun Kim, Bum Woo Yeom |
1Department of Otolaryngology, National Medical Center, Seoul, Korea.
2Department of Pathology, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 두경부 편평세포암종의 Cyclin D1 유전자 증폭과 단백 과발현 |
| 김상현1 · 염범우2 |
| 국립의료원 이비인후과1;고려대학교 의과대학 병리학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Overexpression of the cell cycle control gene, cyclin D1 may, at least in some tumor types, provide a prognostic marker. Cyclin D1 is expressed during the G1 phase of the cell cycle and becomes associated with its catalytic partner CDK4 or CDK6. This association may overcome the G1 arrest.
OBJECTIVES:
To establish the frequency of cyclin D1 protein overexpression and to evaluate its correlation with cyclin D1 gene amplification and its correlation with clinico-pathologic variables that are used in clinical practice.
MATERIALS AND METHODS:
The cyclin D1 gene amplification was estimated with the differential polymerase chain reaction(PCR) and cyclin D1 protein overexpression was evaluated with immunohistochemical study in 32 cases of resectable head and neck squamous cell carcinoma(SCC). The presence or absence of cyclin D1 protein overexpression was correlated with anatomical sites, T stage, nodal involvement, pathologic grade and survival rate.
RESULTS:
Six SCC cases(18.7%) showed the amplification of cyclin D1 gene. A highly statistical correlation between cyclin D1 gene amplification and cyclin D1 protein overexpression was noted(p<0.05). However in seven cases(21.9%) there was cyclin D1 protein overexpression without gene amplification. There was no correlation between cyclin D1 protein overexpression and known clinicopathologic variables(T and N stages, pathologic grade)(p>0.05). But overexpression of cyclin D1 protein was associated with a poor survival of these cases(p<0.05).
CONCLUSIONS: Overexpression of cyclin D1 is the independent prognostic factor for the head and neck squamous cell carcinoma. The cyclin D1 gene amplification results in the overexpression of cyclin D1 protein. But additional genetic mechanisms are involved in the protein overexpression.
Therefore, cyclin D1 oncogene may be important in tumorigenesis in the head and neck squamous cell carcinoma. |
| Keywords:
Cyclin D1ㆍAmplificationㆍOverexpressionㆍDifferential PCRㆍHead and neck squamous cell carcinoma |
서론
암은 유전자의 변이에 의한 질환이며, 세포 주기 조절능력의 상실에 기인한 질환이다.1) 지난 수 십년 동안 다양한 암종에서 DNA증식과 분열을 유도하는 신호 전달 체계에 있어서 많은 유전자의 변형이 확인되었다. 이러한 변형은 크게 3가지로 구분할 수 있는데 첫째가 성장 인자(growth factor)에 대한 반응을 매개하는 암 유전자, 둘째가 cyclin, cyclin-dependent kinase(cdks), cyclin-kinase inhibitor 등 세포 주기를 매개하는 유전자, 그리고 마지막으로 p53유전자와 같이 스트레스나 손상 반응을 매개하는 유전자의 변형이 암의 발생에 기인하는 것으로 알려져 있다.2)
Cyclin 단백은 처음 쥐의 난(卵)세포의 수정 후에 고농도로 축적되었다가 세포 분열되면 즉시 파괴되는 단백으로 발견되었다.3) 유핵 세포에서 cyclin은 cyclin-dependent kinase(cdks)와 복합체를 형성하여 세포 주기에 작용, 세포 분열에 관여한다. Cyclin A와 cyclin B는 세포 주기 G/M기로의 진행에 작용하며, cyclin C, D, E는 세포 주기에서 가장 중요한 역할을 하는 G1/S기로의 진행에 작용하는 것으로 알려져 있다.3) D-형의cyclin은 3가지 아형(D1, D2, D3)이 알려져 있으며 구조적 유사성과 CDK와 결합하여 pRb단백의 과인산화에 작용하는 등 기능상의 유사성에도 불구하고 서로 다른 세포군에 작용한다.4)
염색체 11q13부위의 증폭은 두경부 편평세포암, 유암, 식도암, 폐암, 방광암 그리고 간암 등을 포함한 다양한 암종에서 보고 되었다.5) 염색체 11q13 amplicon은 여러 가지의 전암 유전자를 포함하고 있다. 이 부위에 분포하는 유전자는 bcl-1, EMS-1, hst-1, int-2, cyclin D1 등의 전암 유전자를 포함하고 있다. 그러나 hst-1과 int-2 유전자는 11q13 부위가 증폭된 암 종에서 단백질이 표현되지 않는 유전자로 종양 형성에는 관여하지 않는 것으로 인식되고 있고, 반면 cyclin D1유전자는 증폭은 물론, 단백질의 과발현을 보여 세포 주기 조절 능력 상실로 인하여 종양을 형성하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.6)
유전자 증폭 여부를 측정하는 방법으로 southern blot이나 dot blot 방법 등이 사용되고 있다. 그러나 이 방법을 위해서는 많은 양의 DNA가 필요하며 또한 항상 방사선 동위원소 표식자를 사용해야 하지만, 하나의 중합 효소 연쇄 반응 용기내에 표적 유전자와 대조 유전자를 동시에 증폭시켜 전기 영동 후 각 중합효소연쇄반응띠(PCR band)의 강도를 비교함으로 증폭 여부를 판단하는 differential PCR을 사용하면 보다 적은 양의 DNA을 이용하여 신속하고 간편하게 표적 유전자의 증폭 여부를 알 수 있다. 이 differential PCR 방법은 중합효소 연쇄반응의 여러 가지 요소 즉, 중합 효소 연쇄 반응 회전(PCR cycle)수와 최초의 DNA양에 영향을 받지 않고 간단히 표적 유전자의 증폭 여부를 판단할 수 있는 방법이다.7-9)
본 연구는 두경부편평세포암에서 cyclin D1유전자의 증폭의 빈도를 알아보고 유전자 증폭과 단백 과발현과의 관계, cyclin D1 단백이 두경부편평세포암의 예후 인자로 역할을 할 수 있을 지를 알아 보기 위하여 본 실험을 실시 하였다.
연구 재료 및 방법
1. 연구 재료
총 32례의 두경부 편평 세포 암으로 진단 받은 환자를 대상으로 하였으며 cyclin D1 유전자 증폭 여부는 differential PCR을 시행하였으며, cyclin D1 단백 과발현을 관찰하기 위하여는 면역 조직 화학 염색을 시행하였다. Differential PCR을 위한 신선 동결 조직은 수술시나 진단적 생검시 얻은 조직을 즉시 영하 80℃ 냉동고에 보관하였다. 면역 조직 화학 염색을 위한 조직은 파라핀 포매 조직을 이용하였다. 발생 부위 별로는 후두암이 6례, 구강암이 13례, 구인두암이 8례, 하인두암이 4례 그리고 비강암이 1례였다. 남녀 비는 3：1로 남자가 24례 여자가 8례 였다. 평균 나이는 61.2세 였으며 평균 추적 관찰 기간은 19.5개월로 최고 54개월까지 추적 관찰하였다.
2. 실험 방법
1) Differential PCR
(1) DNA 분리
영하 80℃ 냉동고에 보관 되어 있는 암 조직을 작은 절편(약 0.3∼0.4mm 2)으로 만든 후 Braun Microdismembrator(Melsungun, Germany)을 이용하여 가루로 분쇄 후 용해 완충액(0.5% sodium dodecyl sulfate, 0.3M sodium acetate, 5mM EDTA, pH 8.5)으로 용해 시킨 후 phenol/chloroform으로 두 차례, chloroform으로 한 차례 처리하고 원심분리후 상층액을 ethanol로 침전하여 말린후 증류수로 용해 시켰다. 추출한 DNA의 순도는 형광 광도계(260nm)로 측정하였으며, flurometer(Hoefer, USA)를 이용하여 DNA 농도(100ng/μl)를 측정하였다.
(2) 시발체(primer)
Cyclin D1 유전자의 증폭을 위하여 cyclin D1 exon 2와 intron 1을 포함하는 시발체를 만들었다. 전방 시발체는 5’-GTAGGTCTGCGAGGAACAGAA-3’, 반전 시발체는 5’-ATGGAGCCGTCGGTGTTAGAT-3’로 중합효소연쇄반응 후 증폭되는 유전자 절편의 크기는 201염기이다. Cyclin D1 유전자 증폭을 확인 하기 위하여 사용된 대조 유전자는 β-actin으로, β-actin의 exon 4를 증폭 할 수 있는 시발체 염기 배열을 만들었다. 전방 시발체는 5’-GTCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’, 반전 시발체는 5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTGAG-3’로, 중합효소연쇄반응 후 증폭되는 유전자 절편은 304염기 크기이다.
(3) 중합효소연쇄반응
중합효소연쇄반응 혼합액은 DNA 100ng, 1x PCR buffer(Gene amp(r)), 각각 0.5M의 시발체, 각각 0.3 mM의 dATP, dCTP, dTTP, 16μM의 dCTP, 중합 효소 연소 반응 절편에 표식자를 위하여 0.24μl의 [α32-P] dCTP(10μCi/μl, 3000Ci/mmol：Amersham)를 첨가하였고, 1.5mM MgCl2, 2.0 unit AmpliTaq Gold TM와 증류수로 총 30μl로 만들었다. 중합효소연쇄반응은 Omnigene Thermal cycle(Hybrid)를 사용하여 처음 93℃로 12분 1회 가열 후, 93℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 총 25회 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 유지 하였다. 중합효소연쇄반응 후 반응액을 7.5% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기 영동하고 겔 건조기(Hybrid)에서 60분간 건조한 후 phosphoimager(Fuji) 판에 12시간 노출시키고 두 유전자 중합효소연쇄반응 산물의 농도를 측정하였다.
(4) 유전자 증폭의 판정
Cyclin D1 유전자의 증폭 여부는 정상 조직의 DNA를 암 조직의 DNA와 비교함으로, 암 조직에서의 β-actin에 대한 cyclin D1 유전자의 농도 비가 정상 조직에서의 β-actin에 대한 cyclin D1 유전자의 농도 비에 비하여 2배 이상인 검체를 cyclin D1 유전자가 증폭 되었다고 정의 하였다(Fig. 1). 양성 대조군으로 이미 slot blot 방법으로 cyclin D1 유전자 증폭이 확인된 하인두암조직을 이용하였으며 정상 대조군으로는 종양을 가지지 않은 정상인의 구강조직을 이용하였다.
2) 면역 조직 화학적 염색
(1) 실험 시약
실험에 이용한 cyclin D1 항체는 쥐 단클론 항체인 DCS-6(Novocastra Laboratory Ltd, UK)를 사용하였고 염색은 DAKO LASB kit와 발색제로 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 사용하였다.
(2) 방법
파라핀 조직을 약 5μm 두께의 절편으로 잘라 슬라이드에 부착한 후 약 56℃에서 30분간 처리하고 xylene으로 약 10분간 3회 탈 파라핀 후 100%, 95%, 75% 알코올로 처리하는 함수 과정을 거쳐 메탄올-과산화수소 액으로 내인성 과산화 효소를 억제시켰다. Tris 완충액으로 세척한 nonimmune goat serum으로 5분간 반응시킨 후 세척을 하고 항체 cyclin D1은 30：1로 희석하여 30분간 반응시켰다. 다시 tris-완충액으로 세척한 후 biotinlyated anti-rabbit와 anti-mouse immunoglobulin을 10분간 반응시키고, tris-완충액으로 세척한 후 streptavidin과 반응시키고 발색제인 DAB(3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 반응시켜, 세척한 후 Meyer-hematoxylin으로 대조 염색 후 봉입하였다.
(3) 양성 반응의 판정
면역 조직 화학적 방법으로 염색한 조직 표본의 현미경적 관찰은 주변부에서는 위 양성을 보이는 경우가 많으므로 조직 편의 중앙부에서 관찰하였다. 200배 배율로 관찰하여 benzidine 반응에 전체 암세포의 10%이상에서 세포핵에 황갈색의 과립이 관찰되는 조직을 cyclin D1 단백의 과발현으로 간주하였다(Fig. 2).
3. 임상 병리학적 소견 및 통계 분석
대상 환자의 병력지와 hematoxylin-eosin으로 염색된 조직 표본을 재 검토하였으며 cyclin D1 유전자의 증폭과 cyclin D1 단백의 과발현과의 관계 및 임상 병리적인 소견과 예후와의 관계를 관찰하였다. 대상 환자들의 임상적 병기 및 hematoxylin-eosin 염색 조직 표본의 분화도 분류는 미국 암 학회 분류(Classification of American Joint commitee on Cancer, 1988)를 사용하였으며, 통계 처리는 윈도우형 SAS(statistical analysis system) 4.0을 사용하였다. Kaplan-Meier’s 법을 이용하여 생존 곡선을 그렸으며, 각 집단간의 차이는 log rank법을 이용하여 검증하였다. Cyclin D1 단백의 과발현도에 따른 임상 병리적 차이는 chi-square test와 Fishers exact test를 이용하였다.
결과
1. Cyclin D1 유전자 증폭과 cyclin D1 과발현과의 관계
총 32례중 differential PCR을 통하여 확인된 cyclin D1 유전자 증폭은 6례(18.7%) 였으며, 이 6례 모두에서 면역 조직 화학적 염색상 cyclin D1 단백의 과발현을 보였으며, 7례(21.9%)에서는 유전자의 증폭은 발견하지 못하였지만 cyclin D1단백의 과발현을 보였다(Table 1).
2. 각 부위 별에 따른 cyclin D1 단백의 과발현
각 부위에 따른 특별한 차이를 보이지 않았지만 일반적으로 두 경부 암중 예후가 비교적 좋지 않은 하인두암 4례 전부에서 cyclin D1 단백 과발현을 관찰할 수 있었다(Table 2).
3. 원발 부위 병기, 림프절 전이 및 병리학적 분화도에 따른 cyclin D1 단백질의 과발현
Cyclin D1 과발현은 종양의 원발 부위의 진행도, 림프절 전이여부와는 상관 관계를 보이지 않음을 관찰 하였고, 암의 병리적인 분화도에도 상관 관계가 없음을 알 수 있었다(Table 3).
4. Cyclin D1 단백 과발현에 따른 생존율의 비교
두 경부 편평 세포 암 환자의 생존률은 cyclin D1 단백 과발현에 따라 뚜렷한 차이를 보여 cyclin D1 단백 과발현을 보인 예들에서 cyclin D1 발현을 보이지 않은 예들보다 현저히 나쁜 생존율을 보였다(Table 4).
고찰
염색체 11번 단완(11q13)의 증폭은 두경부, 폐, 식도 편평세포암의 10∼50%까지 관찰되며10), 이는 암종의 유발과 진행에 이 부위 amplicon에 위치한 유전자가 중요한 역할을 할 것이라는 것을 의미한다.13)14) 염색체 11q13 부위에 위치한 전암 유전자는 hst-1, int-2, bcl-1, sea, cyclin D1(PRAD1/CCND1), men-1, ems-1 등이다.10-12) D-형 cyclin은 3가지 아형이 알려져 있다. 이 중 cyclin D1는 세포 주기 G1기에 발현되어 동반 물질인 CDK 4, 6(cyclin-dependent kinase)와 복합체를 형성하여 serine이나 threonine의 키나제 역할을 하게 된다.15) 고로 이 복합체는 pRb의 과인산화를 유도하여 pRb단백의 세포주기 조절 억제 능력의 소실을 초래하고 이로 인하여 pRb에 의하여 조절되던 E2F라는 전사 인자가 활성화함으로써 세포 주기 S기에 필요한 촉매를 합성 가능하게 하여 세포의 분화가 촉진되게 된다.16) D2형 cyclin은 염색체 12q13에 존재하는 CCND2 유전자에 의하여 표현된다. CCND2 유전자는 쥐의 T-세포 백혈병에서 쥐의 백혈병 바이러스의 접합인 vin-1 유전자로 알려져 있다. CCND2 유전자의 증폭이 대장암과 직장암에서 알려져 있다. CCND3 유전자는 염색체 6p21에 위치하며 cyclin D3을 만든다. CCND3 유전자는 아직까지는 전암유전자로는 알려져 있지 않다.23) Cyclin D1 단백의 작용은 G1 세포주기의 조절에서 가장 중요한 부분으로 이 cyclin D1의 정상적인 조절이 되지 않음으로 인하여 여러 부위의 암 발생에 관여한다. 조절 기능을 상실한 cyclin D1이 암을 유도하는 증거로는1) G1 세포 주기가 짧아지고 외부 성장 인자에 대한 의존성이 상실되고2) 면역기능이 소실 된 쥐에 cyclin D1 이 과발현되는 쥐의 태생 섬유모세포를 주입하면 종양이 형성되고3) H-ras 유전자와 같이 종양세포를 유도한다는 것이 있다.15) 본 실험에서는 differential PCR 방법을 이용하여 유전자의 증폭을 관찰 하였다. 이 방법은 Frye등에 의하여 사용되기 시작하여 기존의 surthern blotting 이나 dot blotting 방법에 비하여 유전자 증폭 여부를 간단하고, 빠르며, 예민하게 판정 할 수 있는 장점 이외에 특히 아주 소량의 유전자만으로도 분석 가능하다.7-9)18) 특히 본 연구에서는 효소중합연쇄반응 산물의 겔 전기 영동 후 띠(band) 농도 측정을 위하여 자기 방사선 법(autoradiograpy)보다 정확한 phosphoimaging을 이용하였다. 총6례(18.7%)에서 유전자의 증폭이 관찰되었으며, Gillett 등이 유방 암에서 관찰한 31.7%, Jares 등이 후두 암에서 관찰한 37% 등 다른 연구자에 비하여 다소 적은 수치이긴 하지만 대동소이한 결과를 보였다.19)20) 유전자의 증폭을 보였던 6례는 모두 단백 과발현의 소견을 보여, 유전자의 증폭이 단백의 과발현에 직접 관여한다는 다른 연구자의 실험과 같은 결과를 관찰할 수 있었다.19)20)21) 그러나 유전자의 증폭을 보이지 않았던 7례(21.9 %)에서 단백의 과발현이 관찰되어 유전자의 증폭 이외에 다른 기전에 의하여도 단백의 과발현이 생길 수 있음을 알 수 있다. 즉 cyclin D1유전자 자체는 증폭됨이 없이 촉진자(promoter) 부위의 돌연변이나, 조절 인자의 변형, 유전자 전위(translocations), 역위(inversion) 등에 의하여 단백의 과발현이 발생할 수 있기 때문이다.19)21) 추후로 증폭이외의 다른 기전에 대한 연구가 있어야 하겠다. 이러한 여러 가지 기전을 통하여 총 32 례의 두경부암 중 13례(40.6%)에서 cyclin D1 단백의 과발현을 보여, 두경부 편평세포암의 발생과 진행에 cyclin D1 단백이 크게 기여함을 알 수 있었다.19)21)
Cyclin D1 단백 과발현의 두경부 편평세포암에서의 임상적 의미는 아직 명확하게 규명되지 않았다. Jares등은 후두 편평 세포 암을 대상으로 한 연구에서 원발 부위가 진행된 예에서, 림프절 전이를 동반한 예, 진행된 병기에서, cyclin D1의 증폭과 과발현이 관찰되어 cyclin D1은 예후를 결정하는 중요한 인자라고 하였다.20) 그리고 Michalides 등은 두경부 편평세포 암에서 cyclin D1 단백의 과발현은 종양의 재발과 관련이 있으며, 또한 이미 알려진 종양의 예후 인자(원발 병기, 전이 여부, 종양 병기)와는 관계없이 또 하나의 독립적인 나쁜 예후를 결정하는 인자라고 보고 하였다.22)23) 본 실험에서도 cyclin D1단백의 과발현이 이미 알려진 예후 인자인 원발 부위의 병기, 전이 여부, 종양의 병리학적 분화도와는 관계없이 cyclin D1 단백 과발현을 보인 예에서 나쁜 생존률을 관찰 할 수 있었다.
결론
본 저자들은 총32례의 두경부 편평세포암에 대한 cyclin D1 유전자 증폭과 단백의 과발현에 관한 연구를 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1) Cyclin D1 유전자는 두경부 편평세포암의 발생에 중요한 유전자이다.
2) Cyclin D1 단백의 과발현 기전은 cyclin D1 유전자의 증폭은 물론 다른 기전으로도 단백 과발현을 유도할 수 있다.
3) Cyclin D1 단백 과발현은 독립적인 나쁜 예후를 나타내는 인자로, 두경부 편평세포암에서 cyclin D1 단백 과발현은 좀 더 적극적인 치료를 요구하는 지표가 되겠다.
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