The Changes of Na+-K+ ATPase Activity and Ultrastructure of Endolymphatic Secretory Epithelium by Local and Systemic Streptomycin Treatment.

Chung, Woon Kyo; Kim, Hee Nam; Lee, Won Sang; Chi, Jang Hoon

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 40(11); 1997 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(11): 1616-1631.

The Changes of Na+-K+ ATPase Activity and Ultrastructure of Endolymphatic Secretory Epithelium by Local and Systemic Streptomycin Treatment.

Woon Kyo Chung, Hee Nam Kim, Won Sang Lee, Jang Hoon Chi

Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University, College of Medicine, Seoul, Korea.

Streptomycin이 들쥐 내림프 분비세포의 Na<sup>＋</sup>-K<sup>＋</sup> ATPase 활성도 및 미세구조에 미치는 영향

정운교 · 김희남 · 이원상 · 지장훈

연세대학교 의과대학 이비인후과학교실

ABSTRACT

The endolymphatic secretory epithelium are stria vascularis in cochlear and dark cell in vestibule which are regulated by Na+-K+ ATPase. It is important that we study intracytoplasmic Na+-K+ ATPase for the physiologic research of inner ear. Recently cerium-based method for stain of Na+-K+ ATPase was developed. This study was underkaken to investigate the morphologic changes and Na+-K+ ATPase activity in stria vascularis and vestibular dark cell of mongolian gerbil after systemic intramuscular injection(200mg/kg or 300mg/kg) for 7days or local infiltration of streptomycin through round window. The results are as follows. 1) The strong Na+-K+ ATPase activity was seen at basolateral infoldings of marginal cell in stria vascularis but weak Na+-K+ ATPase activity in dark cell near transitional area. 2) There was no change of Na+-K+ ATPase activity in the stria vascularis and dark cell by systemic injection of streptomycin. The decrease of Na+-K+ ATPase activity in stria vascularis was seen at destruction site of infoldings by local infiltration of streptomycin but no changes in dark cell. 3) The ultrastructural changes of marginal cell by local infiltration of streptomycin were intracytoplasmic vacuole, partial loss of cytoplasmic infoldings, edema, and increase of melanin particle. but, there was no change of ultrastructure in dark cell except increase of melanin particle. The changes of ultrastructure of stria vascularis was variable by systemic streptomycin injection and there was no dark cell change except increased melanin particle. From the above results, the changes of ultrastructure and Na+-K+ ATPase were more severe by local infiltration of streptomycin through round window than systemic injection of streptomycin. The local infiltration of streptomycin through round window may be suitable method for the induction of inner ear damage.

Keywords: Na+-K+ ATPaseㆍSterptomycin ototoxicityㆍEndolymph secretory epithelium

서론 내이에서 혈관조와 dark cell의 Na＋-K＋ ATPase는 내림프액의 형성뿐만 아니라 내림프액의 높은 K＋ 농도와 낮은 Na＋ 농도를 유지한다.54)64) Na＋-K＋ ATPase의 조직내 분포에 대한 연구는 혈관조와 dark cell이 형태학적으로 비슷한 구조를 지니고 있음에도 불구하고 와우의 혈관조에서는 많이 연구된 반면에20)28)49) 전정기관의 dark cell에 관한 연구는 거의 없는 실정이다. Na＋-K＋ ATPase에 대한 연구방법으로는 방사선 자가기록법(radioautography)57)과, 면역조직화학법(immunocytochemistry)35) 그리고 p-nitrophenyl phosphatase(p-NPP)를 이용한 효소조직화학법(enzyme histochemistry) 등이 있지만 이중 효소조직화학법이 일반적으로 사용되고 있다.11)40) 효소조직화학법은 1960년대 처음으로 Wachstein-Meisel 방법으로 연구하여 내이 혈관조에는 Na＋-K＋ ATPase 활성도가 신장의 반정도 있다고 보고한 이래로18)34) 내형질표면(endoplasmic surface)에 주로 분포한다고 알려졌으나44)45), Wachstein-Meisel 방법은 염색이 불완전한 문제가 있었다. 그후 strontium-lead법이 개발되어 와우 혈관조의 Na＋-K＋ ATPase 활성도를 관찰한 결과 앞의 보고와 달리 혈관조 변연세포(marginal cell)의 세포교대감입교합부위(cytoplasmic infolding)에서 주로 분포한다고 보고하였다. 그러나 strontium-lead법은 생리적인 산도에서 측정할 수 없으며 두 단계를 거쳐 염색해야 하는 단점이 있었다.11) 그후 Ernst 방법의 단점을 보완하여 생리적 산도에서 Na＋-K＋ ATPase의 활성도를 측정할 수 있고 염색이 잘되는 cerium-based법을 개발하여 현재 널리 사용되고 있다.30) 그러나 cerium-base법으로 시행한 dark cell에서 연구는 1987년 Yoshihara 및 Igarashi가 원숭이에서 혈관조보다는 약하게 염색이 되며 세포교대감입교합부위에 염색이 됨을 보고한 것65) 이외 다른 연구가 없는 실정이다. Aminoglycoside 항생제가 신장독성과 함께 내이독성이 있음은 이미 잘 알려져 있으며 이것은 신장과 내이의 조직형태와 기능이 비슷하므로 유사한 효과가 있을 것으로 추측되고 있다. 지금까지의 aminoglycoside 항생제의 내이에 대한 독성은 주로 와우나 전정계의 감각세포에 대하여 주로 연구되어 있다.10)15)41)43)58)62)63) Aminoglycoside 항생제는 30S ribosomal subunit와의 상호작용을 통하여 단백질합성을 억제하는 작용을 한다고 알려져 있으며4), 또한 수용세포의 calcium-sensitive potassium channel을 억제하는 것으로 알려져 있다.38) 더우기 내이의 aminoglycoside 독성의 주된 작용은 세포막지질의 억제에 있다고 하였으며 내이에서 polyphosphoinositide 신진대사의 억제로 인하여 세포막 투과성과 세포막구조의 변화로 항상성(homeostasis)을 유지를 할 수 없기 때문에 나타난다고 하였다.50)51)59) Aminoglycoside가 내이세포에 미치는 형태변화는 유모세포의 퇴행과 파괴, 미토콘드리아의 부종, 부동섬모의 변형과 내림프액 분비세포인 혈관조의 위축이 대표적인 것으로 알려져 있다.10)63) 임상적으로 streptomycin은 전정계의 독성이 우선 나타나므로 와우의 기능을 보존하면서 전정계를 파괴할 목적으로 메니에르증후군 환자에서 근육주사에 의한 전신투여와 국소점적요법으로 좋은 효과를 보고하고 있다.3)12)13)46)52)53) 지금까지의 기초 연구는 주로 aminoglycoside 전신투여에 의한 효과만을 연구하였으며 정원창을 이용한 국소점적에 의한 연구는 많이 되어 있지 않은 실정이다. 또한 streptomycin의 전신투여 및 정원창을 이용한 국소점적 방법은 선택적인 전정기관의 감각세포에 대한 파괴로 현훈의 증상을 없애는 방법이지만 이차적으로 내림프 분비에 관여하는 dark cell과 혈관조의 분비세포 파괴에 의한 내림프 생성의 변화에 따른 효과도 있을 것으로 생각되나1)53) 이에 대한 연구는 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 streptomycin의 전신투여와 국소점적시 내이의 내림프액 분비세포인 와우의 혈관조 세포와 전정계의 dark cell에서 미세구조와 Na＋-K＋ ATPase 활성도의 변화를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 1. 실험 동물 및 streptomycin 처치 실험동물은 체중이 65∼90g의 귓병이 없는 들쥐(mongolian gerbil) 36마리를 대상으로 하였다. 실험 전에 평평한 땅위에서 두부와 몸통이 이루는 각도가 일직선으로 유지되고 꼬리를 잡고 들었을 때 평형을 유지하기 위하여 앞발을 앞으로 뻗고 중심을 잘 지키는 전정계의 상태가 정상인 동물만을 선택하였으며 전정기능의 소실 여부는 들쥐가 평평한 땅위에서 들쥐의 머리와 몸통과의 각도 변화가 있는 경우와 꼬리를 잡아서 들었을 때 들쥐가 평형을 유지 못하는 태도 변화를 기준으로 판단하였다. 실험군의 분류는 streptomycin을 전신적으로 매일 200mg/kg과 300mg/kg을 1주간 대퇴부의 근육에 주사한 각각 4마리와 streptomycin을 국소점적한 후 1주, 2주, 3주 경과군 각각 4마리(우측 4귀)로 구분하였다. 또한 미세구조의 변화를 관찰하기 위하여 streptomycin 300mg/kg을 1주간 전신 투여한 4마리와 국소점적한 후에 1주가 경과한 4마리(4귀)를 대상으로 하였으며 정상 대조군은 점적하지 않은 반대측 4귀를 이용하였다(Table 1). Streptomycin 국소점적은 ketamine hydrochloride 40mg/kg를 근육 주사한 뒤에 lidocaine을 이개의 뒤쪽에 국소주사하고 피부절개 후 내이 구조가 손상되지 않게 붕소(bulla)를 개방한 뒤에 정원창을 확인하고 1cc 주사기를 이용하여 streptomycin을 정원창 입구부위를 가득 메울 정도(0.005∼0.01g)로 점적하고 근육조각을 이용하여 정원창을 폐쇄한 뒤에 피부를 봉합하였다. 2. 내림프 분비세포의 Na＋-K＋ ATPase 활성도 측정 Na＋-K＋ ATPase의 활성도를 측정하기 위하여 ketamine hydrochloride(40mg/kg)로 근육 주사한 뒤에 100cc의 생리 식염수를 심장내 관류시켜 혈액을 제거한 뒤에 0.1M cacodylate buffer에 2% paraformaldehyde와 0.05% glutaraldehyde를 혼합한 고정액 100cc를 좌심실을 통하여 주입하여 조직을 고정하였다. 고정후 측두골을 채취하고 붕소를 개방한 뒤에 고정액을 주입하고 수술 현미경하에서 혈관조와 세반고리관의 팽대부위를 분리한 후 고정액속에 1시간 재고정을 시킨 뒤, 0.1M cacodylate buffer를 이용하여 3차례 세척한 후 약6시간 4℃의 냉장고에 보관하였다. 50mM tricine을 이용하여 15분간 세척한 뒤에 Na＋-K＋ ATPase 염색을 cerium-base방법으로 배양액을 50 mM tricine buffer 100cc에 2mM CeCl, 10mM Mg Cl2, 50mM KCl, 2mM p-NPP(Mg-salt), 5% sucrose, 0.00015% triton X-100, 2.5mM levamisol을 섞어서 pH가 7.5가 되게 조절한 후에 shaking incubator를 이용하여 37℃에서 45분간 반응시켰다. 효소반응의 음성대조를 위하여 10mM의 ouabain을 혼합한 배양액으로 반응시켰다. 배양후 50mM tricine(pH 7.5)를 이용하여 3차례 세척한 뒤 다시 0.1M cacodylate(pH 7.5)를 이용하여 3차례 세척하고 0.2M cacodylate buffer와 2% OSO4를 이용하여 40분간 처리한 뒤에 0.1M cacodylate buffer로 3차례 다시 세척하고 알콜을 이용하여 탈수시킨 후 epon에 포매하였다. 조직을 1μm로 절단한 뒤에 1% toluidine blue를 이용하여 염색한 후 광학현미경을 이용하여 관찰할 부위를 선택한 뒤에 50∼60nm의 두께로 절단하였다(Fig. 1). 투과전자현미경 관찰을 위하여 uranyl acetate로 1차염색 후 lead citrate를 이용하여 2차염색을 하였다. Na＋-K＋ ATPase 활성도 측정은 음성대조군의 염색정도와 비교하여 음성과 양성으로 구분하였다. 3. 내림프 분비세포의 미세구조 관찰 내림프 분비세포의 미세구조 관찰을 위하여 streptomycin 전신투여 및 국소 점적한 각각 4마리씩을 ketamine hydrochloride(40mg/kg)로 근육주사한 뒤에 측두골을 적출하였다. 등골(stapes)을 제거한 후 2% paraformaldehyde와 2% glutaraldehyde를 난원창에 1cc 주사기로 주입하여 조직고정을 한 뒤에 1일간 냉장고에 보관하고, 5% EDTA에 3일간 넣어 탈석회화를 하였으며 phosphate buffer로 2시간동안 2번 세척한 뒤에 0.2M phosphate buffer와 1% OSO4 2시간 처리한 뒤 phosphate buffer로 다시 세척한 후 알콜로 탈수하고 epon에 포매하였다. 투과전자현미경 관찰을 위하여 앞에서 시행한 절단 및 염색과정을 거쳐 Hitachi-600 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 결과 1. 내림프 분비세포의 Na＋-K＋ ATPase 활성도 변화 1) 정상 대조군 정상 대조군의 Na＋-K＋ ATPase 활성은 ouabain으로 처리한 음성대조군에서 억제가 되는 것을 알 수 있으며(Fig. 2) 와우의 혈관조에서는 변연세포의 세포교대감입교합부위에서 강하게 염색 되었으며, 기저세포와 중간세포에서는 활성도가 관찰되지 않았다(Fig. 3). 전정계 dark cell은 반응의 정도가 혈관조의 변연세포에 비하여 매우 약하였고(Fig. 3), 이행부위나 이행부의 원위부 dark cell에서는 활성도를 관찰할 수 없었다(Fig. 4). 2) Streptomycin 전신투여군 모든 예에서 혈관조의 변연세포와 전정계의 dark cell에서 Na＋-K＋ ATPase의 활성도는 정상 대조군과 유사하였으며 본 실험에서 사용한 streptomycin 용량내에서는 투여량에 따른 활성도의 차이도 없었다(Fig. 5). 3) Streptomycin 국소점적군 혈관조에서는 변연세포의 세포교대감입교합의 소실과 부종에 의한 세포질의 변화로 Na＋-K＋ ATPase의 활성도가 부분적으로 소실 또는 파괴되었으나 파괴되지 않은 부위의 활성도는 정상대조군과 유사하였으며 점적 후 기간에 따른 변화의 차이는 없었다. 전정계 dark cell에서는 혈관조에서와 달리 활성도의 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 6, 7). 2. 내림프 분비세포의 미세구조 변화 1) 정상대조군 혈관조의 변연세포는 내첨단부위의 내림프강면에 많은 수의 미세융모와 세포핵이 내림프강에 가까이 분포되어 있었으며 세포질은 기저부에 크게 발달되어 있었다. 세포질내에 많은 미토콘드리아와 그 사이에 많은 세포교대감입교합을 잘 관찰할 수 있다. 미토콘드리아는 기저부나 중간세포에서 발달되지 않은 것을 관찰할 수 있으며 미토콘드리아와 세포교대감입교합의 사이사이에 내형질세망(endoplasmic reticulum)과 리보좀 및 골기체가 관찰된다. 메라닌색소는 전체 혈관조세포에서 변연세포나 중간세포 및 기저세포에서 부분적으로 관찰되었다(Fig. 8). Dark cell은 모양이나 세포의 크기가 위치에 따라 일정치 않았으나 이행 부위의 세포는 입방형(cuboid)이었으며 팽대부위와 멀어질수록 세포는 평편한 모양이었으며 세포질의 기저부위에 주로 발달된 세포교대감입교합을 관찰할 수 있으며, 세포교대감입교합 사이에 혈관조에 비하여 적은 수의 미토콘드리아가 보이며 세포질내 내형질세망, 리보좀과 많은 수의 공포와 소포가 관찰되었다. 멜라닌색소는 dark cell의 표피하 부위에 발견되고 세포질내에는 관찰되지 않았다(Fig. 9). 2) Streptomycin 전신투여군 혈관조에서는 개체간에 차이가 있어 변연세포의 미세융모 및 세포질내 미세 기관과 세포교대감입교합이 잘 유지되고 있는 경우와 세포질의 부종 및 미토콘드리아의 부종을 관찰할 수 있는 경우는 각각 1마리씩의 들쥐에서 관찰할 수 있었으며 정상과 비교할 때 뚜렷한 차이를 관찰할 수 없는 경우는 4마리중 2마리에서 관찰되어 개체간의 폭이 많았다. 그러나 변연세포내 멜라닌색소가 증가된 것을 모든례에서 관찰할 수 있었다(Fig. 10). 전정계의 dark cell에서도 정상군과 비교하여 형태 변화의 차이를 관찰할 수 없었으나 정상군에서 상피세포 아래에 멜라닌색소들이 증가하고 더우기 멜라닌색소들이 dark cell의 세포질내까지 증가된 소견을 볼 수 있었다(Fig. 11). 3) Streptomycin 국소점적군 와우의 혈관조에서는 변연세포의 부종에 의한 세포교대감입교합의 파괴를 볼 수 있었다. 또한 미토콘드리아의 부종 및 세포질내 공포형성과 부분적인 세포파괴 현상을 관찰할 수 있었으며(Fig. 14), 정상대조군에 비하여 멜라닌색소의 수가 증가된 양상을 관찰할 수 있었다(Fig. 8). 전정계의 dark cell은 대조군에 비하여 분비세포의 세포교대감입교합에 형태 변화는 없었으나 멜라닌색소의 증가가 관찰되었다(Fig. 13). 고찰 와우의 혈관조는 변연세포(marginal cell), 중간세포, 기저세포로 구성되며 이중에 변연세포는 기저측면의 세포형질막(basolateral plasma membrane)이 교대감입교합으로 되어 있고 많은 미토콘드리아가 분포되어 있다.31) 또한 정상 dark cell의 가장 특징적인 모양은 첨부에서는 세포질이 조밀하며 세포아래 3분의 2에는 많은 세포교대감입교합부위로 구성되어 있는 것이다. 세포질의 상부에는 많은 수의 소포가 있으며 미토콘드리아와 잘 발달된 골기체 그리고 많은 RNA 입자가 있다. 기저부에는 많은 수의 모양이 긴 세포질돌기가 많은 미토콘드리아와 함께 있으며 적은 RNA 입자가 보인다고 알려져 있다.29) Na＋-K＋ ATPase는 세포막내의 효소로 세포막을 통한 Na＋와 K＋ 이온교환의 능동이동에 관여하여 내림프액의 낮은 Na＋와 높은 K＋의 농도를 유지하고 내림프액의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있으며 따라서 내림프액의 전해질 농도를 유지하는데 필수적이며 세포막전위를 유지하는데 중요한 역할을 한다.54)64) 내림프액 생성의 주된 분비세포는 혈관조의 변연세포와 전정계의 dark cell이며 와우에서 더 내림프생성에 주된 기능을 한다고 알려져 있다. Dark cell이 혈관조와 같이 내림프액의 형성에 관여한다는 생각은 혈관조와 같이 미토콘드리아가 많으며 세포교대감입교합부위가 잘 발달된 구조로 구성되어있다는 점과 세포질내 많은 미립자 때문으로20) 추측되었으며 그후 여러 연구에 의하여 확인이 되었고28)49) 더우기 dark cell이 혈관조와 세포모양이 비슷하고 광범위하게 퍼져있기 때문에 전정계의 내림프액 형성에 dark cell이 혈관조세포보다 더 중요한 작용을 할 수 있다고 하였다.29) 내이의 Na＋-K＋ ATPase활성도는 최근 일반적으로 통용되고 있는 cerium-based 방법으로 연구한 결과 혈관조의 변연세포에서 기저측면에 발달된 세포교대감입교합부위에서 관찰되며 내형질부위 및 기저부위에는 활성도가 없는 것으로 알려져 있다.22)23)30) 본 연구에서 들쥐의 혈관조에도 다른 연구자와 같이 변연세포의 기저측면의 세포교대감입교합부위에 Na＋-K＋ ATPase 활성도를 관찰할 수 있었으며, 내형질부위나 중간부위, 기저부위에는 활성도를 관찰할 수 없었다. 또한 전정계의 dark cell에서의 Na＋-K＋ ATPase의 활성도는 세포교대감입교합부위에서 관찰할 수 있었으나 혈관조에 비하여 매우 약하게 관찰되었다. 이는 Yoshihara의 연구와 같은 결과로65) Na＋-K＋ ATPase 활동이 dark cell보다 혈관조에서 강함을 알 수 있었다. 특히 본 실험에서는 들쥐를 대상으로 동물간의 차이가 있겠지만 Na＋-K＋ ATPase의 활성도가 이행세포 부위에 인접한 dark cell에 제한되어 나타나며 이행세포로부터 멀어지면서 활성도가 점차 적어져 활성도가 소실됨을 관찰할 수 있어 활성도는 다른 실험동물에 비하여 더욱 약하다고 생각되었다. Dark cell이 혈관조에 비하여 매우 적은 Na＋-K＋ ATPase 활성도를 지닌 것으로 보아 혈관조가 dark cell보다 Na＋-K＋ ATPase를 이용한 내림프형성과 전해질 조절활동에 중요한 작용을 한다고 추측할 수 있겠다. 그러나 cerium-based 방법으로 측정한 Na＋-K＋ ATPase 활성도는 K＋-NPPase 뿐이기 때문에 다른 ALPase나 Mg＋＋-ATPase 등의 활성을 측정할 수 없으므로 또한 세포내 위치에 차이가31) 있으므로 이에 관하여는 좀 더 연구되어야 한다고 생각한다. Streptomycin의 이독성은 대부분 감각세포의 손상이 주가 되지만, 내림프 분비세포에 대한 streptomycin의 효과는 1952년 Hawkins등에 의하여 처음으로 제시되었는데 streptomycin이 분비세포의 혈관을 손상시켜서 분비기능의 변화를 초래할 수 있다는 가설이 보고되었다.17) 그 후에 몇몇의 연구자들은 streptomycin외에 다른 aminoglycoside 항생제가 나선인대(spiral ligament)나 혈관조 그리고 나선융기(spiral prominence)의 모세혈관 전조직에 손상을 주고 특히 혈관조의 위축을 대표적인 변화로 보고하였다.14)21) 또한 streptomycin이나 gentamicin으로 처리한 실험 동물에서 전정계 팽대부의 dark cell에서 퇴행성 변화가 나타난다는 연구가 있으며16), 임상적으로 aminoglycoside 항생제의 이독성이 내림프 분비세포에 영향을 주는 효과는 메니에르병 환자에서 현훈을 치료할 목적으로 사용되고 있으나 정확한 작용기전은 아직 잘 알려지지 않았다.1)53) 본 연구에서 streptomycin이 혈관조에 미치는 영향으로 세포질내 공포형성 및 미토콘드리아의 부종과 기저측면의 세포교대감입교합부위의 파괴를 관찰할 수 있었으며 멜라닌 색소의 증가를 관찰할 수 있었으나 streptomycin의 전신투여시에는 개체간의 차이가 있어 변화가 약하게 나타나거나 변화가 없는 경우가 있었고 국소점적의 경우는 모든 예에서 혈관조의 변화가 심하게 나타났다. 그러나 dark cell의 경우는 멜라닌 색소의 증가를 전신투여군 및 국소점적에 관찰할 수 있었지만 다른 형태변화는 정상군과 차이를 관찰할 수 없었다. 이 결과는 gentamicin의 전신투여후 dark cell에 미치는 효과를 보고한 Yoshihara의 결과에서 dark cell의 변화가 적게 나타나는 것과 같은 결과이다.66) Streptomycin의 전정신경세포에 대한 독성효과는 주로 단백질합성의 억제로 나타난다고 하였으며56) streptomycin 전신투여의 경우 고양이에서 미토콘드리아의 변화와 감각세포의 세포질 부종 및 공포형성과 세포핵의 핵농축 등을 관찰함과63) 동시에 Duvall 등은 streptomycin이 처음부터 세포와 미토콘드리아의 형질세포막에 직접영향을 준다고 하였다.9)10) 그러므로 본 연구에서는 감각세포뿐 아니라 내분비세포에 streptomycin이 직접 영향을 주어서 세포질내 공포형성과 부종이 유발되었으며 미토콘드리아의 부종 및 파괴를 관찰할 수 있었을 것으로 생각된다. 정원창을 통한 국소점적시에 혈관조에서 세포질내 공포형성과 부종 기저측면의 세포교대감입교합부위의 부분 파괴 및 감소, 미토콘드리아의 부종등 세포의 손상이 잘 나타났으며 교대감입교합구조의 파괴로 인한 Na＋-K＋ ATPase의 부분 결손을 쉽게 볼 수 있었다. 1967년 Iinuma는 kanamycin으로 혈관조에서 Na＋-K＋ ATPase의 활성도를 감소시킬 수 있다고 보고한 것과19) 1994년 Yoshihara등의 연구결과 활성도는 관찰되지만 부분 감소를 볼 수 있었다는 결과는66) 본 연구와 같은 결과이다. 이러한 aminoglycoside 이독성이 Na＋-K＋ ATPase의 감소를 초래하지만 부분적인 감소는 내림프액의 이온조절에 영향을 미칠 정도는 아닐 것이라는 보고66) 이외에 Konishi(1979), Konishi 및 Mori(1984)는 kanamycin 처리한 기니픽에서는 실제로 내림프액의 Na＋, K＋ 농도의 변화를 관찰할 수 없었다는 보고가 뒷받침한다.32)33) 그러므로 이를 종합하면 aminoglycoside 이독성에 의한 분비세포의 미세구조의 변화 및 Na＋-K＋ ATPase의 부분 감소의 변화는 내림프 분비세포의 전해질 조절기능을 감소시킬 정도는 아니라고 추측할 수 있지만66) 본 연구에서 나타난 streptomycin이 내분비세포에 미치는 미세구조의 변화 및 기저측면의 세포교대감입교합구조의 파괴와 이로 인한 Na＋-K＋ ATPase의 부분 소실이 분비세포의 주된 기능의 하나인 내림프액 형성 저하를 추측할 수 있으나 이에 대하여는 좀 더 많은 연구가 필요하다고 생각한다. 본 연구에서 streptomycin이 미세구조에 미치는 변화는 정상 dark cell에서 보인 구조와 차이를 관찰할 수 없었는데 이는 dark cell의 미세구조는 모양이나 크기가 다양한 것으로 알려져 있으며 특히 팽대부에 가까운 부위는 7μ정도이며 점차 멀어질수록 크기가 작아지기 때문에 streptomycin의 이독성에 의한 영향을 비교하기 위하여 정확한 위치 선정에 주의하여야 한다. 또한 전신투여시나 국소점적시에 dark cell의 미세구조 변화를 관찰할 수 없는 까닭으로 고려하여야할 점은 혈관조에서는 미세구조 변화가 국소점적시에 심하게 나타나며 전신투여시에도 개체간의 차이가 있지만 변화를 보이는 것으로 보아 국소점적은 정원창을 통한 streptomycin의 투여가 직접 확산에 의하여 와우의 내림프액으로 확산되고 이것이 직접 혈관조에 작용하여 미세 구조의 커다란 변화를 초래한다고 볼 수 있으며 와우의 내림프액으로 확산된 streptomycin이 전정계의 내림프액으로 들어가야만 dark cell의 변화를 유발한다. 그러나 전정계와 와우계는 경게막(membrana limitans)에 의하여 직접 연결되지 않고 약제가 와우에서 전정계로의 확산에 제한을 하기 때문에 이들 두 분비세포에 미치는 미세 구조의 영향에 차이가 있을 것으로 생각되어진다. 이러한 전정계와 와우의 약제의 확산에 제한이 있다는 연구는 streptomycin을 이용한 국소점적시에 전정계의 변화없이 와우의 미세 구조의 변화를 연구한 Kimura의 연구에서 잘 알 수 있다.26)27) 본 실험에서 streptomycin의 국소점적을 시행한 전례에서 3일이내에 전정기능의 소실로 인한 들쥐의 자세 변화와 행동의 변화를 관찰할 수 있었다. Streptomycin이 와우의 내림프액으로 확산되어 전정계까지 적은 양이라도 도달하여 전정기능의 소실을 유발할 수 있었던 이유는 이항생제에 대한 독성이 전정계의 감각세포가 와우의 감각세포보다는 예민한 기관이기 때문일 것으로 추측할 수 있다. 이는 streptomycin이 양전위를 가지고 있어서 음전위를 지니고 있는 전정감각세포에는 잘 붙지만 와우는 양전위를 가지고 있어 streptomycin이 붙지 못하므로 streptomycin이 전정말초수용계에 선택적으로 잘 접착되는 특성을 가지고 있으며 모든 aminoglycoside 항생제 중에서 streptomycin이 와우에 가장 적은 접착성을 가지고 있다는 연구가 뒷받침해 준다.61) 또한 다른 연구자들도 streptomycin 같은 특정 aminoglycoside는 일차신경의 손상없이 부동모의 파괴를 유발할 수 있다고 보고하였으며42)46)60) 더욱이 streptomycin을 이용하여 Norris와 Shea 등은 와우와 다른 전정계의 파괴없이 부동모와 감각세포의 파괴를 고양이 실험에서 증명하였으며46) Kimura는 gentamicin을 이용하여 기니픽에서 같은 결과를 얻었다.25)26) 임상적으로 streptomycine의 이독성 이용은 메니에르 환자에서 사용하는데 투여방법은 전신투여방법과 국소점적방법이 있다. 전신투여방법은 1947년 처음으로 치료가 되지 않는 메니에르 환자를 대상으로 streptomycin을 전신투여하여 streptomycin의 이독성을 유발하는 것으로 시작되었으며12) 양측전정기능과 청력의 소실을 최대한 적게하면서 치료 효과를 높이기 위하여 여러 연구자에 의하여 전신투여 방법이 개발되었다.13)52) 그러나 이러한 전신투여는 내이기능의 파괴로 인한 부작용으로 임상적 적용에 한계가 있었으나 이러한 부작용이 없이 치료할 수 있는 국소점적 방법이 고안되기 시작하였다.3)46)53) 1969년 Lindeman의 연구에 의하면 streptomycin의 고실내점적에서 기니픽 모든 예에서 전정기능소실에 의한 자세변화를 관찰하였다고 보고하면서 이들 이독성은 전정계중에서 팽대부의 감각세포가 가장 손상이 쉽게 나타난다고 하였다.39) 본 연구에서 국소점적을 실시한 들쥐 모든 례에서 1일에서 3일내에 모두 전정기능의 소실을 유발하였지만 이들 전정계의 dark cell에서 미세 구조의 변화를 관찰할 수 없었던 것은 Linderman의 전정팽대부위의 감각 신경세포가 쉽게 손상을 받는다는 이유로 설명할 수 있다. 본 연구에서 정원창을 통한 streptomycin의 국소점적으로 이독성을 유발하는 기전은 고실점적 방법과 같이 중이강내의 streptomycin이 정원창을 통하여 내이로 흡수로 생긴 것이라고 알 수 있다. 그러나 중이강으로 국소점적을 하면 중이강내에서 대부분 이관을 통하여 빠져 나가므로 정원창에 도달하는 양은 매우 적다고 추측할 수 있으며 특히 액체상태로 만든 aminoglycoside인 경우는 소실된 약물의 양이 많기 때문에 내이로 점적시키는 양의 조절이 어렵다. 임상적으로 streptomycin을 중이강내로 점적하여 메니에르 환자를 치료하는 경우는 치료성적이 발표자에 따라 서로 다르며3)36) 직접 외측반규관이나 정원창을 통한 점적방법은 치료성적이 항상 일정하게 좋게 나타나는 것으로 점적 방법에 따른 내이침투양의 조절에 문제가 있음을 추측할 수 있다.53) 또한 고막을 통한 streptomycin의 이독성의 변화를 연구한 실험에서39) Lindeman은 streptomycin 5∼20mg을 0.1ml의 생리식염수에 녹여 점적한 실험동물 모든 례에서 전정기능의 소실을 보았는데 이때 사용한 streptomycin의 양은 본 실험에서 사용한 streptomycin 1회 사용량 5∼10mg의 2배의 양이었다. 본 실험에서 적은 양의 streptomycin을 이용하여 정원창으로 전정기능의 소실을 유발할 수 있는 것으로 보아 본 연구에서 시행한 들쥐의 붕소를 개방하여 직접 정원창에 streptomycin을 점적하는 방법은 앞으로 점적양의 조절을 통한 최소의 점적양으로 내이의 변화를 유발하도록 연구가 더 필요하다고 사료되지만 본 연구에서는 streptomycin을 분말로 사용하기 때문에 식염수에 녹여 사용하는 방법보다 이관을 통해 소실되는 양을 최소로 하고 점적후에도 오랜 시간동안 정원창을 통하여 확산되는 것을 기대할 수 있기 때문에 내이에 영향을 주는 효과적인 방법으로 사료된다. 실험에서 200mg/kg와 300mg/kg의 streptomycin 전신투여시 전정기능의 소실에 다른 태도의 변화를 전례에서 관찰할 수 없었다. 그러므로 전정신경세포의 변화를 유발하기 위하여는 전신 투여량의 조절이 필요할 것으로 보이지만 streptomycin의 전신투여로 실험동물에서 전정기능의 소실을 유발할 수 있는 양은 실험동물이 비록 다르나 고양이의 경우 kg당 100에서 400mg을 8일간 투여한 경우 최대 전정기능 소실 효과를 관찰할 수 있었으며15) 기니픽에서는 streptomycin의 이독성을 유발할 수 있는 투여량은 kg당 200mg에서 300mg 1주간의 투여로 나타날 수 있다고 하였다.62) 그러므로 본 연구에서 사용한 kg당 300mg은 전정계의 이독성을 유발시킬 수 있는 충분한 양이라고 생각되지만 실제 7일간의 투여로 기능변화에 따른 태도 변화를 관찰할 수 없었다. Aminoglycoside 전신투여로 이독성을 이용한 실험동물은 내이의 감각세포의 손상으로 이독성을 유발하기 전에 조직내물질의 손상을 유발하여 대부분의 동물들이 전신적 독성으로 쉽게 죽으나 국소점적에 의하여는 실험동물의 전신독성 없이 광범위하게 유발시킬 수 있다.39) 본 실험에서도 전신투여 300mg/kg로 최고 농도를 유지하였고 그 이상 주입한 경우는 전신 독성으로 실험동물의 대부분이 수일을 넘기지 못하고 죽었으나 국소점적군에서는 모두 독성 사망없이 내이의 변화를 쉽게 유도할 수 있었다. 그러므로 정원창을 통한 국소점적은 전신 독성없이 쉽게 이독성을 유발할 수 있는 좋은 방법이라고 생각되어진다. 내이의 분비세포에 존재하는 멜라닌세포의 분포에 관한 연구는 몇몇 연구자에 의하여 이루어졌으며24)37) 이들 기능에 대하여는 정확히 알려져 있지 않았으나 aminoglycoside 항생제의 기능을 멜라닌세포가 억제하며2)6) 이들 항생제에 의한 이독성시에 멜라닌소체가 증가한다는7) 보고가 있다. 더욱이 1994년 Yoshihara는 gentamicin의 주입양에 따라 멜라닌색소가 증가한다고 보고하였다. 이런 멜라닌세포와 aminoglycoside 이독성과의 관계는 멜라닌의 형성 과정에서 일시적인 Ca＋＋ 침착에 멜라닌이 관여하고 Ca＋＋는 여러 세포와 효소의 기능 중에서 중간 메개체로써의 역할을 한다고 알려져 있으며8) 이들의 기능은 세포막의 이온 투과성과 신경전달물질의 분비, 근육과 분비과정에서 자극과 수축의 기능에 관여한다.47)48) Na＋-K＋ ATPase의 활성도도 역시 세포외 Ca＋＋의 농도와 세포내 Ca＋＋의 농도에 의하여 영향을 받는 것으로 알려져55)5) 결국 멜라닌의 역할은 Na＋-K＋ ATPase와 adenylate cyclase의 조절에 관여한다고 추측한다.66) 그러므로 본 실험에서는 다른 미세구조와 달리 전신투여나 국소점적에 모두 멜라닌이 증가하는 것을 볼 수 있었으며 특히 전신투여한 군에서는 dark cell의 상피세포 아래에서의 증가이외에 dark cell의 세포질 내로 침투하여 증가되는 것도 관찰할 수 있었으며 이는 streptomycin의 이독성에 대한 효과로 추측하며 그 기능에 대하여는 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다. 결론 Streptomycin 이독성을 이용하여 들쥐에 streptomycin 200mg/kg와 300mg/kg을 1주간 전신투여시와 정원창을 통한 국소점적시 내림프분비세포인 와우 혈관조세포와 전정계 dark cell의 Na＋-K＋ ATPase 활성도와 미세구조의 변화를 정상 대조군과 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 정상 대조군에서는 와우 혈관조에서는 변연세포의 세포교대감입교합부위에서만 강한 Na＋-K＋ ATPase 반응을 보였으며, 전정계에서는 이행부위에 인접한 특정 dark cell 부위에서 강한 Na＋-K＋ ATPase 반응을 보였으나 전체적으로 혈관조보다는 dark cell 부위의 반응 정도가 약하였다. 2) Streptomycin 전신투여군에서 Na＋-K＋ ATPase 활성도는 혈관조의 변연세포와 전정계의 dark cell 모두에서 별 변화가 없었으며 국소점적군에서는 혈관조의 변연세포에서만 Na＋-K＋ ATPase 활성도 저하가 관찰되었고 그 변화는 세포교대감입교합부위의 부분적 소실 및 부종때문이었다. 3) Streptomycin 투여에 의한 내이 분비세포의 형태 변화는 국소점적군에서 혈관조 변연세포에서 세포질내 공포형성, 세포교대감입교합부위의 부분적 소실, 부종 및 멜라닌색소의 증가였으며 전신투여군에서는 멜라닌색소의 증가만을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과로 보아 streptomycin은 정원창을 통한 국소점적이 전신투여보다 심한 내이의 Na＋-K＋ ATPase활성도 저하를 동반한 분비세포의 손상을 초래할 수 있었으며 정원창을 통한 streptomycin의 국소점적법은 내이의 형태학적 변화 및 전정기능의 저하를 주는 좋은 실험 방법으로 생각된다.
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