Telomerase Activity in Laryngeal Papilloma.

Kim, Chun Dong; Sung, Myung Whun; Hong, Soon Kwan; Kim, Kwang Hyun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 40(10); 1997 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(10): 1384-1389.

Telomerase Activity in Laryngeal Papilloma.

Chun Dong Kim, Myung Whun Sung, Soon Kwan Hong, Kwang Hyun Kim

¹Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea.
²Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Korea.

후두 유두종에서의 Telomerase Activity

김춘동² · 성명훈¹ · 홍순관¹ · 김광현¹

이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실2;서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;

ABSTRACT

BACKGROUND:
Telomere is derived from Greek words, telos(end) and mere(part). While being located at the end of the chromosome, it contributes to its stability and not only prevents DNA rebonding but also participates in DNA replication. During cell mitosis, because 50 to 200 of the nucleotides disappear, the telomere length shortens. In cells where telomerase activity is preserved, the telomere does not shorten and cell mitosis is active. But in cells where there is no telomerase activity, the telomere length is shortened. Because cell mitosis does not occur in this cell, the cell ages and eventually dies.
OBJECTIVES:
Recently there has been much research on the relationship between telomerase and cancer and it has been reported that in cancer cells due to many complicated genes, tumor suppresor gene, and cancer gene mutation, telomerase activity is high and telomerase is not active in normal cells except germinal cell and lymphocytes. It shows that there is a close connection between telomerase activity and the infinite growth of cancer cells. But in recent studies, telomerase activity has also been reported in precancerous lesions and in some papilloma viruses and so more research is needed in this area.
MATERIALS AND METHOD:
Authors used telomeric repeat amplication protocol assay(TRAP) in eight cases of laryngeal papilloma, which has the highest incidence in benign lesions of the larynx and in some cases are said to be related to the cause of squamous cell cancer.
RESULTS:
Among the eight cases, telomerase activity was positive in seven of the patients and negative in one but the telomerase activity was found lesser than that in squamous cell cancer.
CONCLUSION:
This shows that not the presence of telomerase activity but the quantity is important and that even though the cell is not an infinitely growing one, if active reproduction of cells exists, telomerase activity can be present.

Keywords: TelomeraseㆍLarynx papillomaㆍPrecancerous lesion

서론 Telomere는 희랍어인 telos (end)와 mere (part)의 합성어로 염색체의 말단에 존재하여 염색체의 안전성을 높이고 DNA의 재결합을 방지할 뿐 아니라 염색체의 복제에도 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Telomere는 RNA-dependent DNA polymerase 기능을 가진 ribonucleoprotein인 telomerase라는 효소에 의해 만들어 지는데 TTAGGG의 telomeric repeat를 합성하여 telomere의 끝에 붙여줌으로써 telomere의 길이가 일정하도록 유지시켜 준다. Telomere는 세포가 분열할 때마다 50개에서 200개의 nucleotide가 소실되어 짧아지는데 telomerase에 의해 telomere의 길이가 유지되는 세포에서는 세포분열이 왕성하게 일어나며 telomerase의 활성도가 없는 세포에서는 telomere의 길이가 일정 길이로 짧아져 더 이상의 세포분열이 일어나지 않고 세포가 노화가 되어 죽는다. Telomerase와 암과의 관계는 최근 많이 연구되어져 여러 복잡한 유전자, 종양억제인자나 암유전자의 돌연변이에 의해 나타나는 암세포에서는 telomerase의 활성도가 높고, 생식세포나 림프구를 제외한 정상 체세포에서는 telomerase의 활성도가 나타나지 않아 암세포가 무한정 자라나는데에는 telomerase의 활성도와 밀접한 연관을 가짐이 관찰되고 있다. 하지만 최근의 보고에 의하면 전암병변이나 일부 유두종 바이러스에서도 telomerase의 활성도가 나타난다고 보고되고 있다. 저자들은 후두에서 발생하는 양성종양중 가장 발생률이 높고 유두종바이러스의 종류에 따라서는 편평상피세포암의 발생원인에 일부 역할을 한다고 알려져 있는 후두유두종에서 telomeric repeat amplication protocol assay(TRAP)를 이용하여 telomerase의 활성도의 유무를 확인하고 후두 유두종의 빠른 성장, 많은 재발률과 telomerase와의 관계를 규명하고자 하였다. 연구 재료 및 방법 1. 조직 채취 및 보관 서울대학병원 이비인후과에서 후두미세수술을 받은 8례의 소아 및 성인 후두유두종환자를 대상으로하여, 수술시 유두종 조직을 채취한 즉시 곧바로 액체질소에 넣어 얼린 후 -70 냉장고에 동결보존하였다. 정상 대조조직으로는 인체의 섬유아세포를 배양하여 이용하였고 양성 대조조직으로는 후두유두종과 같은 상피세포가 기원인 후두의 편평상피세포암을 선정하였다. 2. 연구방법 -70℃ 냉장고에 동결 보존된 조직 100mg을 ice cold wash buffer(Hepes-KOH(pH 7.5)：10mM, MgCl 2：1.5mM, KCl：10mM, Dithiothreitrol：1mM)로 씻어낸 후 200μl의 ice cold lysis buffer(tris-HCl(pH7.5)：10mM, MgCl 2：1mM, EGTA：1mM, phenylmethylsulfonyl floride：0.1mM, β-mercaptoethanol：5mM, CHAPS：0.5%, glycerol：10%)를 혼합하여 kontes튜브에 넣고 450rpm의 속도로 조직을 균질화 시킨다. 균질화된 조직을 4℃에서 30분간 incubation한 다음 4℃에서 30분간 16,000g로 원심분리시켜 상층부위의 조직추출액을 얻는다. 얻어진 조직추출액을 Bio-Rad protein assay kit(BIO-RAD, Califonia)를 이용하여 단백질 농도를 2∼3mg/ml안에서 조직추출액을 사용하여 TRAP assay를 시행한다. TRAP assay는 먼저 eppendorf tube에 40pmole의 CX primer를 넣고 그 위에 100μl의 wax(Ampliwax, Perkin-Elmer)를 놓고 녹인 후 상온에서 굳혀 상층반응액과 분리시킨다. Wax 상층 부위에 Trap reaction buffer 50μl(tris-HCl(pH 8.3)：20mM, MgCl 2：1.5mM, KCl：63mM, Tween-20：0.0005%, EGTA：1mM, dNTP：50μM(10mM dNTP：0.25μl, [-32P]dCTP：0.4μl), TS primer：40pmole, Taq DNA polymerase(Boehringer Mannheim)：2 unit, cell lysate：2∼5μl)를 넣은 후 실온에서 약 30분간 반응시킨후 튜브를 DNA thermal cycler(Perkin-Elmer 9600)에 넣고 95℃에서 5분 94℃에서 30초 50℃에서 30초 72℃에서 90초의 반응조건으로 40cycle PCR 반응을 시킨다. 이때 CX primer는(5-\{CCCTTA\}3CCCTAA-3)이고 TS primer는 5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' 이다. 이렇게 만들어진 PCR반응물 중 20μl를 취하여 12% polyacrylamide nondenaturing gel에서 1x TBE를 완충액으로 전기영동한 후 telomeric repeat를 autoradiography로 관찰하였다. 음성의 기준세포로는 인체의 섬유아세포를 사용하였으며 양성의 기준세포로는 telomerase 양성으로 밝혀진 인체의 후두암조직을 사용하였다. 결과 8례의 후두유두종 환자 중 성인형과 소아형 유두종에 차이없이 7례에서 telomerase 활성도가 양성을 보였으며 1례에서 음성을 보였으며 음성을 보인 환자는 interferon 치료를 받은 환아 이였으며, 전반적인 활성화 정도는 후두 편평상피세포암에서의 telomerase의 활성정도 보다는 약한 경향이 있다(Table 1, Fig. 1, 2). 고찰 Telomere는 McClintock와 Muller에 의하여 발견이 되었고 그 기능은 염색체가 서로 붙는 것을 방지하여 염색체의 안정성을 높이는 것으로 알려져 있다. Telomere의 구조는 1978년에 Blackburn에 의해 밝혀졌는데, 그는 tetrahymena 라는 단핵세포의 염색체 끝에 아주 짧고 단순한 nucleotide의 반복적인 배열 즉 TTGGGG라는 nucleotide가 연속적으로 반복됨을 밝혀냈다. 이와같이 telomere는 염기 중 주로 T와 G가 많은 nucleotide가 여러번 반복되는데 사람을 비롯한 척추동물의 telomere는 TTAGGG이며 2000번정도 반복되는 것으로 알려져 있다.1)2) Telomerase는 RNA-dependent DNA polymerase 기능을 가진 ribonucleoprotein으로서 telomerase의 활성도를 측정하는 방법으로는 TRAP assay(telomeric repeat amplication protocol) 방법을 사용하며 이 방법은 detergent lysis 방법으로 추출한 세포추출물에 telomerase가 존재하면 PCR에의해 TTAGGG 반복 서열이 첨가된 생산물이 형성되고 이것을 전기영동방법에 의해 크기별로 분리해내는 방법으로서 아주 작은 조직(100mg)으로도 분석이 가능하며 10 4 cell에 1개 정도가 불멸화 세포이거나 telomerase의 활성도가 있는 세포가 10개 정도만 있어도 양성으로 나오는 매우 민감도가 높은 방법이다.3) Telomerase와 암과의 관계는 최근 많이 연구되어 지고 있는데 여러 복잡한 유전자, 종양억제인자나 암유전자의 돌연변이에 의해 나타나는 암세포에서 telomerase의 활성도가 높고 정상체세포에서는 telomerase의 활성도가 나타나지 않아 암세포가 무한정 자라나는데에는 telomerase의 활성도와 밀접한 관계가 있을 가능성을 많은 연구에서 보고하고 있다.3-6) 이에 Greider는2) telomerase와 암과의 관계를 규명하고자 일종의 model을 제시하였는데 사람의 경우 telomerase가 정상적으로 태아의 배아세포에서는 활성화되어 세포가 증식을 하게되고 일단 성장이 끝나면 대부분의 체세포내의 telomerase의 활성도는 감소하여 세포가 분열할 때마다 telomere의 길이는 짧아지고 telomere의 길이가 어느 길이 이하로 짧아지게 되면 세포의 분열은 정지되고 결국 세포는 죽게 되나 종양억제인자나 암유전자의 돌연변이로 인해 암세포로 형질변환되는 세포에서는 이러한 안전신호가 무시되어 정상 노화과정을 뛰어넘어 계속분열하다가 telomerase가 다시 활성화되면서 telomere의 길이를 유지할 수 있게되어 죽지않고 계속 분열할 수 있는 세포가 된다는 가설을 제시하였다. 하지만 이가설은 정상 체세포인 대식세포나 림프구에서 telomerase 활성도가 나오고 일부종양세포 예를들면 신경아세포종양(neuroblastoma)이나 망막아세포종양(retinoblastoma)에서는 telomerase의 활성도가 없이도 무한정 증식 한다는 결과도 있어 좀더 연구가 필요할 것으로 판단된다.7) 두경부 종양환자에서의 telomerase의 연구를 보면 Mao 등8)에 따르면 두경부종양 환자의 주변조직 중에서 dysplasia가 있는 7례와 hyperplasia가 있는 5례 모두에서 100% telomerase 활성도가 나타났으나 그 활성정도는 종양보다는 낮았다는 보고를 하였는데 이것은 두경부종양에서의 telomerase의 활성도는 종양화 시기의 이른시기에 나타나기 때문에 두경부종양의 위험도나 재발, 치료효과 측정에 있어서 좋은 표식자가 될 것으로 예상하였으며, Califano 등9)에 의하면 두경부종양 환자의 구강세척물(oral rinse)에서 telomer-ase의 활성도를 측정하였을때 두경부종양에서 telomerase의 활성도를 보이고 구강세척물에서도 telomer-ase의 활성도를 보인 경우가 32%정도로 나타나 두경부 종양환자의 위험도를 평가하는 새로운 방법이 될 것으로 보고하고 있다. 전암병변과 유두종 바이러스가 감염된 조직에서의 telomerase의 활성도에 대해서도 최근 많은 연구가 이루어지고 있는데 Bednarek 등10)에 의하면 백서의 피부유듀종을 chemical carcinogenesis model(DMBA와 TPA사용)을 사용하여 피부유두종을 만들고 시간의 경과에 따른 telomerase의 활성도를 관찰한 바 10주 이상이 지나면 아직 암세포가 되지 않은 전암병변인 피부 유두종 일때에도 telomerase 의 활성도가 점차 증가한다는 보고를 하였는데 이것은 유전인자의 불안정성이 증가함에 따라 혹은 성장분화세포(proliferating cell)의 비율이 많아짐에 따라 telomerase의 활성도가 증가한다고 해석하였으며 백서에서는 hyperplastic skin에서도 telomerase의 활성도가 보이나 시간이 경과함에 따라 telomerase의 활성도 정도가 증가하지 않는 것이 전암병변의 변화와 다른 점이며 이것은 단순히 세포의 증식이 증가한 결과로 해석하였다. Mutirangura 등11)에 의하면 oral leukoplakia와 erythroplakia 환자의 26개 조직중에서 10개에서 telomerase 활성도가 나타나 38.5%의 양성률을 보였으며 hyperplasia 보다는 dysplasia에서 양성률이 3베정도 높아 oral premalignant lesion의 hyperplasia부터 late stage cancer까지 발현되나 late stage cancer에 발현률이 많은 것으로 보고하고 있다. 이와같은 보고를 종합하여 보면 telomerase의 활성도는 종양의 종류에 따라 발현되는 시기가 다름을 알 수 있는데 폐암이나 위암에서는 종양의 늦은 시기에 발현이 되며 간암이나 피부암, 두경부암에서는 전암병변에서도 telomerase의 활성도가 나타남을 알 수있다.12-14) 후두유두종은 후두에 발생하는 양성종양중 가장 흔한 것으로 국내에서는 역학이 밝혀지지 않았으나 미국에서는 해마다 인구 10만명당 7명정도 발생한다고한다. 임상 양상에 따라 소아-다발형, 소아-단발형, 성인-다발형, 성인-단발형으로 나뉘며 후두유두종은 human papillomavirus(HPV) 감염과의 관련성이 널리 알려져 있고 특히 출생시에 모체의 성기 콘딜로마로부터 HPV에 감염되어 발생한다고 알려져 있다. 또한 Lindeberg 등15)에 따르면 후두유두종의 대부분은 양성종양의 특성을 갖고 있으나 intraepithelial anaplastic change와 atypia 가 20∼40%에서 보고 되고 있으며 일부는 악성화 할수 있다고 알려져 있다. 악성화는 심하며 오랜 기간동안 지속되는 유두종이나 juvernile onset 유두종에서 adult onset 유두종보다 더 잘 발생하는 것으로 알려져 있으며 이것은 유두종바이러스와 관련된 조직 변화인 flat, invertd or papillary lesion with koilocytic atypia와 in situ DNA hybridization으로 증명이 된 상태이다. 유두종의 악성화는 유두종바이러스 16, 18, 30에서 가장 잘 발생한다고 알려져 있으나 저위험군인 유두종바이러스 11에서도 in situ DNA hybridization방법으로 악성화된 후두암에서 발견되어 악성화할 수 있음이 보고되었다. 하지만 후두 유두종에 있어서 telomerase의 활성도에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없고 유두종 바이러스에서의 telomerase의 연구는 Klingelhatz 등16)에 의하면 인간의 유두종바이러스 16(human papillomavirus type16)에서 E6단백질이 발현되면 세포가 불사세포(immortal cell)가 되기전에도 p53같은 유전인자와는 상관없이 telomerase를 활성화 시킬수 있음을 증명하였다. 본 연구의 결과로서 후두유두종 8개중에서 7개에서 telomerase의 활성도가 나온 것은 정상 임파구의 혼합이 이런 결과를 이룬 것으로 보기에는 lymph node나 spleen에서의 telomerase의 반응이 나오지 않고 저자들이 실험한 만성 염증조직을 대상으로 실험한 결과와도 다르기 때문에 임파구에 의한 영향은 아닌 것으로 사료되며 사람의 두경부영역에서는 폐나 위같은 조직과는 달리 세포변화의 이른시기인 전암병변이나 세포가 활발히 증식하고 있는 조직은 telomerase의 활성도가 암조직보다는 그 활성정도가 낮으나 양성으로 나올 수 있음을 말해주며 간염바이러스에의한 만성간염조직에서 telomerase의 활성도가 양성으로 나오는 것같이 후두유두종바아러스에의한 유듀종조직에서도 telomerase의 활성도가 양성으로 나오며 바이러스와 telomerase의 관계는 좀더 연구가 필요하다고 사료된다.
REFERENCES
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