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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(9): 1274-1279. |
| Expansion and New Creation of Human Septal Cartilage from Biopsied Fragment: Using in vivo 3-D Culture of Chondrocytes. |
| Dong Joon Park, Seog In Paik, Jeong Pyo Bong, Sang Yoo Park, Gi Won Yu, Jeung Gweon Lee |
1Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, Wonju, Korea.
2Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 삼차원적 배양기법을 이용한 사람 비중격 연골파편의 인공증식 |
| 박동준1 · 백석인1 · 봉정표1 · 박상유1 · 유기원1 · 이정권2 |
| 연세대학교 원주의과대학 이비인후과학교실1;연세대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
The use of autogenous cartilage has the problem of donor site morbidity and limited supply in reconstructive surgery.
OBJECTIVES:
The purpose of this study is to increase the size and the volume of the autogenous small cartilage by the new three dimensional culture technique.
MATERIALS AND METHODS:
The chondrocytes from biopsied human septal cartilage were subcultured. The increased cells were encapsulated with calcium alginate and were injected to the subcutaneous tissue of the athymic nude mouse for in vivo 3-dimensional culture.
RESULTS:
After 8 weeks of the injection, the implanted subcutaneous nodule was seemed to be the natural cartilage and the histoarchtectures revealed characteristics of the hyaline cartilage.
CONCLUSION:
This results suggest that the small biopsied cartilage can be expanded by the techniques of subculture and the 3-dimensional culture., and can potentially overcome the limited availability of autogenous donor cartilage. |
| Keywords:
ChondrocytesㆍCell cultureㆍCartilageㆍAlginate |
서론
미용목적이나 재건을 위한 연골조직의 이식에 있어 자가이식이 생물학적으로 가장 이상적 이라할 수 있겠으나, 여러 제한점이 동반된다. 예를들어 늑연골 채취시 늑막의 손상은 치명적 합병증을 초래할 수 있으며, 이개 연골이나 비중격 연골은 그 크기가 제한되어 있기 때문이다. 따라서 현재에도 다소 여러 문제점이 있지만 합성물질이나 동종이식이 많이 쓰이고 있는 형편이다.
작은 크기의 연골은 신체의 여러곳에서 쉽게 채취할 수 있다. 특히 비중격 연골은 공여부의 큰 합병증 없이 얻을수 있는 유리연골(hyaline cartilage)이다. 만약 이 연골을 조금 채취하여 세포배양을 통해 그 크기를 증가 시킬수 있다면 자가 연골이식의 문제점은 극복될 수있으리라고 본다.
유리연골은 조직학적으로 연골세포와 이를 둘러 싸고있는 기질로 되어있다. 이 기질은 연골세포에서 분비되며 주로 제 2 형 콜라젠과 당단백으로 구성되어 든든한 지지구조를 이룬다. 이 연골세포는 다른 세포들처럼 단층 세포배양이 가능하지만 계대배양을 할경우 모양이 섬유 아세포처럼 변하며, 생물학적 특성도 잃게되어 기질분비가 정지 되거나, 제1형의 콜라젠이 분비된다.17)(Fig. 1, 2) 따라서 기존의 단층 세포 배양 방법으로는 세포수의 증가는 가능하나 연골을 생성시킬 수 없다. 그러나 1982년 Benya 등3)은 연골세포를 아가로즈 겔내에서 3차원적 배양을 하면 세포특성도 유지할 뿐더러 심지어는 단층배양으로 세포특성을 잃었던 세포들도 다시 연골세포의 특성을 되찾을 수 있다고 보고 하였다. 이 결과는 3차원적 배양으로 in vitro에서 연골생성의 가능성을 제시하였고 아가로즈 겔이외에도 콜라젠18), fibrin glue9), hyaluronic acid15), 그리고 calcium alginate7)8) 등의 기질에서도 생물학적 특성을 유지하며 배양이 가능하다는 보고들이 있다. 이중에서도 calcium alginate는 해조류에서 추출된 용액 상태의 sodium alginate에 Ca ++를 첨가하여 gel 모양으로 변화시킨 기질로서 인체에 무해하며 잘 흡수되는 물질이다. 또한 이 calcium alginate는 그 굳기도 sodium alginate의 농도나 첨가한 Ca ++의 농도와 비례하므로 적당한 농도로 주사(injection)도 할 수 있다.12) 이러한 결과를 이용하여 단지 연골세포의 특성만 유지하며 배양만 시키는 데에서 벗어나 실제로 연골을 생성 시키기도 하였는데 paige 등12)은 송아지의 관절에서 분리한 연골세포를 calcium alginate에 넣어 누드 마우스내에 주사하여 연골을 생성시켰다. 그러나 이 실험은 단지 갓 분리한 많은양의 세포를 그대로 누드 마우스내에서 배양시킨 것으로 연골의 크기 증가에는 별 도움이 되지 못하고 단지 연골의 생성만 확인한 결과였다. 따라서 본 연구에서는 생검한 연골 파편의 크기를 증가시키기 위해 단층 배양을 하여 세포수를 증가 시킨후, 이를 다시 paige등이 사용한 방법으로 연골을 생성 시키고자 하였고, 아울러 생성된 연골의 조직학적 분석 및 calcium alginate를 통한 자가 연골이식의 가능성에 대해 알아 보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 연골세포의 분리 및 단층 배양
연골 파편은 비중격 성형술시 상악능(maxillary crest)과 비중격 연골을 분리할 때 얻은 것을 사용하였다. 파편의 크기는 대략 0.5×1.0×0.1Cm 이었으며 Klasburn10)이 기술한 방법을 약간 변형하여 세포분리 및 배양을 시행하였다. 간략하면, 채취한 연골파편을 200μg/ml의 streptomycin과 200U/ml의 penicillin이 들어있는 중성 posphate buffered saline(PBS)에서 잘 세척후 1mm 3의 크기로 잘게 자른다. 이 연골 조각들을 15ml falcon tube에 넣고 3mg/ml의 type Ⅱ collagenase(Worthington Freehold, NJ), penicillin(200U.ml), 그리고 streptomycin(200 μg/ml)이 들어있는 10cc의 PBS 에서 잘 흔든후 37℃의 세포배양기에서 18시간동안 효소 소화 시킨다. 5000rpm으로 1분간 원심분리후 상층액은 버리고 PBS로 3회 세척후 단층배양을 위해 3cc의 배양액에 잘 섞는다. 배양액은 Dulbecco’s modified eagles medium(DMEM)에 10%의 FBS와 상기의 항생제를 섞어 만들며 25Cm 2의 배양 flask 에서 시행하되 온도는 37℃, 5% CO2가 섞인 실내공기를 사용한다. 배양액은 3일 마다 한번씩 갈아준다.
2. 배양된 연골세포를 함유한 calcium alginate의 제작 및 athymic nude mouse로의 이식
세포가 배양 flask에서 합류(confluence)를 이루면 이를 트립신 처리하여 세포를 얻은후 이들 세포의 반수를 다시 계대 배양한다. 제 3 대 계대배양이 합류를 이루면 이를 채취하여, 1.8%의 sodium alginate(Yakuri pure chemicals, Japan)에 10×10 6/ml 세포수(정상 유리 연골 세포 밀도의 약 10분의1)가 되게한다. 이 sodiun alginate-연골세포 혼합액 0.2cc를 취하여 100mM의 CaCl 2를 첨가하면 순간적으로 calcium alginate로 변하며 겔모양으로 되는데 이를 athymic mude mouse의 전두부와 두부의 피하에 주사한다.
3. 조직학적 관찰
주사후 약 8주 경과시 마우스를 희생시켜 주입한 기질을 채취하고 이를 10% 중성 포르말린에 고정시킨다. 통상적인 파라핀 포매법과 염색법에 따라 H&E 염색을 시행하고 기질내의 당단백을 관찰하기 위해 alcian blue 염색, 그리고 콜라젠을 관찰하기위해 Masson’s trichrome 염색을 시행한다. 각각의 염색된 절편은 이 실험에 대해 사전 지식이 없는 병리학자가 관찰하여 정상 연골의 유무를 관찰하게 한다.
결과
주입한 혼합물은 피하조직으로 주사 되면서 젤이되어 굳어져 마우스의 안면 외형이 변하였고 이 모양은 8주후 마우스를 희생 시킬때까지 지속되었다(Fig. 3). 또한 굳기는 주사후 약 2주후부터 굳어져 8주에는 단단한 결절을 이루었다. 조직 채취시 이 결절은 주위조직과 피막으로 경계되어 있어 용이하게 분리 되었으며 반투명하게 보이는 이 조직내에는 혈관은 보이지 않았다. 또한 괴사나 심한 염증소견도 보이지 않았다. 결절의 모양은 주사할 때 굳어진 그대로 유지됨을 알수 있었고 심지어는 주사시 형성된 피부와의 누공으로 새어나온 혼합물의 모양도 그대로 유지한채 연골이 형성되어 있었다(Fig. 4).
조직학적 결과도 새로운 연골의 생성소견을 보이고 있었다. 즉 병리학자의 관찰로도 연골세포, 기질, lacuna의 모양등이 정상 연골구조와 차이가 없었으며, alcian blue 염색에 의한 당단백과 Masson’s trichrome 염색에 의한 콜라젠의 염색상도 정상과 동일 하였다(Fig. 5).
고찰
동물 모델에서 calcium alginate를 기질로 이용한 연골세포의 이식 및 연골의 생성에 대한 연구는 이미 몇몇 연구자들에 의해 보고된 바 있다.1)8)12)13) 그러나 이들은 모두 송아지나 돼지 등의 관절등에서 충분하게 연골세포를 확보한 뒤 시행한 결과이므로 비록 연골이 생성되어도 실제로 임상에 적용하기엔 다소 무리가 있는 연구이다. 따라서 본연구에서는 어떻게 하면 적은양의 연골조직을 이용하여 많은양의 연골세포를 얻고, 이를 이용하여 본래보다 커진 연골을 생성 시키느냐에 목적을 두었다. 따라서 고전적인 배양기법을 먼저 이용하여 세포수를 증식 시킨후 이를 연골생성이 가능한 3차원적 배양에 적용 하였으며, 이 계대배양한 세포로도 연골 생성이 가능하다는 결과를 얻게 되었다.
사실 연골세포의 단순한 단층 배양이나, 3차원적 배양5)19), 그리고 calcium alginate 내에서의 연골 생성은 이미 알려진 사실이나, 계대 배양한 세포를 이용한 연골의 생성은 본 연구가 최초이다. 그러나 최대한 어느정도 까지 확장이 가능한지는 좀더 연구가 필요할 것으로 생각된다. 즉 본 연구에서는 임의로 제 3 대 계대 배양한 세포를 사용 하였는데 연골 생성능력을 가진 마지막 계대가 몇대인지 우선 결정 되어야 단순 계대배양으로 증식 시킬수 있는 최대한의 세포수가 결정 될 것이다. 또한 최적의 세포 희석농도의 결정도 중요한 과제이다. 본 연구에서는 정상 유리연골에서 볼 수 있는 세포수의 약 10%16)를 사용하였는데 이보다 더 낮은 농도로도 연골의 생성이 가능 하다면 그만큼 확장 시킬수 있는 범위가 늘어나게 될 것이다.
Guo 등7)은 연골세포를 단층 배양 flask와 calcium alginate 내에서 각각 배양시켜 증가된 세포수를 서로 비교하여 본 결과 calcium alginate 내에서 증가율이 flask 내 증가율의 30%정도라고 보고 하였다. 이 결과는 연골세포가 calciun alginate 내에서 기질만 분비하는 것이 아니라 약간의 증식도 한다는 것을 보여주므로 그 증식이 언제부터 발생하여 언제 멈추는가에 대한 연구도 필요 하겠다. 그러나 이때 간과 해선 안될것은 세포의 증식이 일어난다고 해서 이식된 calcium alginate 내에서 형성된 연골의 크기가 증가하는 것은 아닌 점이다. Lipman 등11)의 연구에 의하면 alginate gel을 이용하여 누드 마우스내에서 생성시킨 연골의 총무게가 따로 단순 배양된 같은수의 세포와 같은양의 alginate 무게의 합보다 100%이상 증가 했다고 한다. 이 결과는 연골이 형성되는 것은 세포의 수가 증가하거나 크기가 변하는 것에 기인하는 것이 아니라 기질의 축적에 의한 것임을 알 수 있다. 이 사실은 또한 향후 이를 미용목적의 임상에 적용 하였을 때 크기의 변화는 없음을 나타내므로 안심하고 사용할수 있다고 본다.
Calcium alginate는 생체에 안전하며 잘 흡수된다. 즉 alginate는 치과에서 치형을 본뜰대 사용되는 재료의 원료이며 화상 상처에 직접 뿌려 치유를 증진시키는 작용을 하기도 한다. 또한 오직 이 gel만 피하에 주입하면 거의 대부분이 1개월내에 흡수되어 버린다(저자의 실험적 관찰로서 논문 제작중). 따라서 생체내에서 연골이 형성되면서 이 calcium alginate의 운명은 기질로 치환되며 흡수된다고 가정할 수 있으나 아직 이에대한 정확한 연구는 없는 실정이다.
이 calcium alginate 외에도 물론 연골세포를 배양 시킬수 있고 생체에서 흡수되는 물질이 있는데, Puelacher 등14)이 연구한 nonwoven mash of polyglycolic acid fiber가 그것이다. 이 중합체를 원하는 모양으로 미리 만들어 놓은후 여기에 연골세포를 부착 시켜 in vitro, in vivo 모두에서 연골을 형성할 수 있다. 그러나 이것은 친수성이 없어(hydrophobic) 생체와 적합성이 떨어지고 연골세포가 잘 붙지를 못해 실용적이지 못하다. 반면, calcium alginate 는 유동적 모양의 젤 형태로 그 굳기를 조절하면 주사뿐만 아니라 미리 원하는 모양으로도 제작이 가능하다.
이 새로운 연골의 제작이 임상에 적용 되려면 좀더 연구가 필요 하겠다. 즉 본연구는 면역 반응이 약화된 무흉선 마우스에서의 실험이므로 정상적인 동물에서, 그리고 사람에서 자가이식이 가능한지 규명되어야 할 것이다. 또한 정상 연골조직을 자가이식해도 어느정도의의 흡수율을 보이므로6) 인공적으로 생성된 이 연골의 흡수율도 연구 되어야 한다고 생각된다.
이러한 미비점들이 완벽히 해결된다면 임상에 적용이 가능 하다고 추측되는 분야는 상당히 다양할 것이다. 우선 미용목적으로 낮은 코를 올려주는 비 확장술이나 안면 성형에 적용이 가능할 것이다. 본 연구에서와 같이 한번 주입된 calcium alginate는 연골이 완전히 성숙될때까지 그 형태를 유지하므로 기존의 실리콘 이나 자가연골을 대신 할수 있을 것으로 생각되며 이식 방법도 수술대신 단지 주사 만으로도 가능하다고 생각된다. 또한 위축성 비염시 비강 점막내에 주입함으로써 비저항을 증가 시키거나 성대마비시 성대 내전을 위한 새로운 주입물2)4)로 사용하는 등의 치료 목적으로도 사용이 가능하고, 미리 모양이 제작된 연골의 형성도 가능하게 된다면 이를 응용해 인공 기관지의 제작이나 기타 여러 자가 연골조직 사용상의 난제의 해결도 기대할 수 있을것 이라고 생각된다.
결론
제 3 대 계대배양된 사람 비중격 연골세포를 sodium alginate 용액에 넣어 calcium alginate gel 형태로 만든후 무흉선 누드 마우스의 피하조직에 넣어 8주후에 관찰한 결과 정상과 같은 연골조직을 얻을 수 있었다. 이는 적은양의 연골조직을 이용하여 크게 확장시킬수 있고, 기존의 자가연골 이식의 문제점을 극복 할 수 있는 가능성을 제시한 연구 결과이며 임상적용을 위한 연구가 더욱 필요할 것으로 사료된다.
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