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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(7): 984-989. |
| Expression of PLC- 1 in Human Middle Ear Cholesteatoma. |
| Young Myoung Chun, Kee Hyun Park, Dong Hoon Lee, Sung Chul Hwang |
1Department of Otolaryngology, Pulmonary, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea.
2Department of Critical Medicine, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea. |
| 중이진주종에서의 PLC-γ1의 발현 |
| 전영명1 · 박기현1 · 이동훈1 · 황성철2 |
| 아주대학교 의과대학 이비인후과학교실1;호흡기내과학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
EGF and TGF-gamma are believed to mediate their pleiotrophic actions by binding to and activating cell surface receptors with an intrinsic protein-tyrosine kinase.
Protein-tyrosine kinase phosphorylation has been considered involved in intrinsic signal transduction, proliferation and transformation of the cells. Phospholipase C-gamma1 is well characterized substrate for tyrosine kinase.
OBJECTIVE: The purpose of this study is to elucidate the distribution of PLC-gamma1 in normal meatal skin and cholesteatoma matrix.
MATERIALS AND METHODS:
8 cholesteatoma specimens were obtained from operated patients for immunohistochemistry and western blot analysis.
RESULTS:
On immunohistochemistry, PLC-gamma1 was detected only in basal layer of the deep meatal skin, but was readily detectable in both the basal and suprabasal layer in cholesteatoma matrix. By western blot analysis, considerable higher levels of PLC-gamma1 protein were detectable in cholesteatoma matrix compared with the deep meatal skin.
CONCLUSION:
Overexpression of PLC-gamma1 in cholesteatoma suggests a possible derangement of enhanced growth signal transduction in keratinocytes. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍPhospholipase C-gamma1ㆍSignal transduction |
서론
세포의 성장과 분화 그리고 변성 등은 발생, 성장기 뿐만 아니라 성인에서도 한 세포에서 다른 세포로 소위 신호전달체계(signal transduction system)라는 과정을 통해 이루어진다. 이러한 신호전달체계는 외부로부터의 정보를 세포막을 통해 이차전달 물질을 사용하는 여러 기전에 의해 세포내부로 전달하는데, 이러한 신호전달체계 가운데 cyclic AMP를 이차전달물질로 사용하는 신호전달경로는 이미 잘 알려져 있다. 그리고 그 이후 Inositol을 이차전달물질로 활용하는 새로운 신호전달경로가 발견되었으며, 이들 중요한 이차전달물질을 생성하는 효소가 phospholipase C(PLC)임이 알려지고, 또한 이 효소가 분리되기에 이르러 최근 이 신호전달체계에 대한 연구가 본격적으로 이루어지고 있다.1)2) 특히 최근 여러 연구에서 PLC-γ1은 epidermal growth factor receptor tyrosine kinase의 기질로 잘 알려져 있어 상피세포가 상피성장인자(EGF)의 자극을 받은 후 PLC-γ1이 활성화되어 신호가 전달되는 것으로 알려져 있다.3)
중이진주종은 염증에 관여되는 여러 cytokine에 의하여 과증식과 골파괴 등의 성향을 갖게 된다고 설명된다. 그러나 이런 외부의 자극이 세포 내부에서 어떤 경로를 통해 이루어지는지 혹은 외부의 자극과는 별도의 내부 신호전달체계가 활성화되는지에 대한 의문이 제기될 수 있다. 또한 중이진주종의 형성과정에서 세포의성장과 분화를 조절하는 유전인자들의 이상과 연관될 수 있다는 주장이 제기되고 있다.4) 특히 성장과 분화에 관계되는 PLC-γ1의 역활 등을 밝히는 노력은 매우 중요하리라 생각된다. 더욱이 중이진주종의 신호전달체계에 대한 연구는 현재까지는 보고된 바가 없기 때문에 저자 등은 이 연구를 통해 중이진주종에서의 PLC-γ1의 발현을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 조직표본
실험에 사용한 조직은 본원에서 진주종성 중이염으로 진단받고 수술을 받은 8명의 환자에서 진주종상피와 진주종이 없는 심부외이도상피를 취하였다. 면역조직화학적염색은 조직을 10% 중성포르말린에 48시간 고정한 후 탈수하여 파라핀에 포매하였으며, 조직은 5mm로 절편하였다. 또한 western blotting을 위해 조직의 일부는 -70℃에서 냉동보관하였으며 양성대조군으로 위암조직을 이용하였다.
2. Western blot분석
8명의 환자로부터 얻은 모든 진주종상피와 모든 심부외이도상피를 한꺼번에 모아서, 각각 EBC완충액(40mM Tris/HCl, pH 8.0, 120mM NaCl, 0.5% NP-40, 2mg/ml aprotinine, 2mg/ml pepstatin, 2mg/ml leupeptin, 100mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride)을 가한 후, 유리 파쇄기를 이용하여 조직을 파쇄하였다. 파쇄된 조직을 4℃에서 20분간 유지시킨 후 15,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 소의 혈청 알부민을 표준액으로 하여 각각의 단백질 양을 측정한 후, 2mg/ml의 단백질이 되게 2×sodium dodecyl sulfate(SDS) sample 완충액(100mM Tris/HCI, pH 6.8, 200mM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophebnol blue, 20% glycerol)을 가한 후 5분간 끓여 시료로 사용하였다. 전기영동은 mini-gel kit(Bio-Rad)를 이용하였으며, buffer system은 Laemmli13)의 방법에 따랐으며, 젤은 6% SDS/polyacrylamide를 사용하였다. 전기영동으로 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane으로 전기적인 방법으로 옮겼다. Nitrocellulose membrane은 5% non-fat dry milk(Carnation)가 함유된 TNE 완충액(10mM Tris/HCl, pH 7.5, 2.5mM EDTA, 50mM NaCl, 0.1% Tween20)으로 1시간 처리한 후 PLC-γ1 동위효소에 특이적인 항체로 1∼2시간 동안 처리하고, 0.05% Tween20이 함유된 TNE 완충액으로 3회 수세한 후 chemilumin-nescence reagent(NEN, Boston, MA)를 이용하여 X-ray film(Kodak)에 3초∼1분 동안 노출하였다.
3. 면역조직화학적염색
절편된 조직을 파라핀을 제거하고 탈수한 다음 3%H2O2가 포함된 methanol에 30분간 처리하여 조직에 포함된 peroxidase의 활성을 제거하였다. 염색은 LSAB Kit(Dako, Carpinteria, CA, USA)를 사용하였는데, 일차항체(Lab. of Cell Signaling at NIH, Bethesda, Maryland, USA)는 10mg/ml이 되게 blocking 용액에 희석한 후 실온에서 1시간 반응시켰고, 이차항체를 처리한 다음 AEC로 발색시켰다. 대조염색은 Harris hematoxylin을 사용하였다.
결과
진주종상피에서의 PLC-γ1의 발현여부를 위해 실시한 western blot분석에서는 진주종상피는 단백질의 농도를 20, 40, 60mg protein/lane으로 증가시킴에 따라 PLC-γ1에 대해 증가된 양성발현을 보였으며, 심부외이도상피에서는 발현되지 않았다(Fig. 1). Western blot 분석에 의하여 확인된 진주종상피에서의 PLC-γ1의 과발현이 조직내에서의 어떤 분포를 보이는지를 확인하기 위하여 면역조직화학적염색을 실시하였다. 결과판정은 음성(-), 양성(＋), 강양성(＋＋) 및 부분적 양성(F)으로 구분하였다(Fig. 2, 3).
총 8례의 조직표본중에서 진주종상피는 1례를 제외한 모두에서 기저세포층에서 양성발현 및 부분적 양성발현을 보였고, 기저상부층에서는 8례 모두 양성 및 강양성발현을 보였는데, 극세포층과 과립세포층 모두에서 강한 양성을 보였다. 이에 비해 동일한 환자군에서 취한 심부외이도상피는 1례에서만 기저세포층과 기저상부층에서 양성을 보였고, 나머지는 음성 혹은 부분적 양성만을 보였다(Table 1, 2).
고찰
최근까지 연구된 결과를 토대로 중이진주종의 병인을 분자생물학적으로 요약해 보면 다음과 같다. 진주종은 retraction theory와 papillary proliferation theory의 상호 보완적 장애에 의해 유도될 수 있다. 즉 정상 피부상피가 고막함몰 등에 한 변화와 염증 등에 의해 과증식성향을 갖게 되는 것이 가장 중요한 과정이다. 이 과정은 상피성장인자, 종양괴사인자-α(TNF-α), transforming growth factor-α 등의 여러 cytokine이 고막이나 외이도 상피의 기저세포의 수용기에 coupling되어 유발된다. 이러한 외부의 자극은 기저세포내에서 tyrosine kinase를 활성화시키고, 다시 특정한 신호전달경로를 통해 핵내에서 c-jun이나 c-fos 등의 transcription factor의 발현을 통해 DNA에 변화를 초래할 수 있게 된다.4)5) 이로 인해 세포주기의 변화가 유도되어 세포의 증식도가 변하게 된다. 이 결과 상피세포는 과증식성향을 띄게 되어 진주종의 특성을 갖게 된다.6)7) 또한 정상 상피의 terminal differentiation은 상피세포 고유의 프로그램에 의해서 이루어지는데 이를 조절하는 여러 유전자의 변화도 동시에 일어날 수 있다. 즉 과증식성향을 가진 기저세포 및 인접세포가 세포의 상층부로 이동하면서 오히려 terminal differentiation의 가속이 초래된다. 이 결과 세포는 소위 soft keratinization을 초래하고 과다한 케라틴이 생성되며, 이 과정에 apoptosis가 관여된다는 주장도 제기되었다.4)8)9) 이상에서 언급한 내용은 아직 일부에서는 가설로만 주장되고 있고, 현재까지 이의 입증을 위한 연구가 계속되고 있다.
여기서 이미 확인된 여러 cytokine들이 과연 세포내에서 어떠한 경로로 핵내의 변화를 유도하는지에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않다. 또한 이 과정은 여러 성장인자와 그들의 수용체의 발현이 증가되었다고 하여도, 이런 정보가 세포내부로 전달되지 않는다면 세포에서의 변화를 기대할 수 없게 된다. 또한 외부의 정보전달이 없이도 만약 신호전달체계의 이상이 초래된다면 세포내부에서 변화가 초래될 수 있다. 저자는 이러한 모든 가능성 등을 규명하기 위해 일차로 상피세포의 성장과 분화에 가장 밀접하게 관여되는 신호전달물질인 PLC-γ1에 대한 연구를 하게 되었다. 여기서 현재까지 밝혀진 신호전달기전을 간략하게 기술하여 보겠다.
세포상호간의 정보교환은 다세포개체에서는 특히 중요하다. 세포의 성장, 분화, 지각감지 그리고 변성 등은 발생시뿐만 아니라 성장후에도 한 세포에서 다른 세포로 소위 신호전달이라는 과정을 통해 이루어진다. 또한 이러한 신호전달의 파괴는 악성종양, 당뇨병, 그리고 여러 면역관계 질병을 초래한다. 이러한 신호전달과정을 이해하기 위해서는 수용기, membrane phospholipids, 여러 종류의 phospholipase, 그리고 protein phosphorylation 등의 상호관계를 이해함이 필요하다. Inositol 지질을 활용하는 신호전달경로가 발견되었으며, 1975년 Mictchell에 의해 Inositol 1, 4, 5-triphospate(IP3)가 calcium 동원을 유도한다는 새로운 사실이 발표된 후, 이 새로운 신호전달체계에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.10) 한편 이들 중요한 2차 신호 전달물질을 생성하는 효소가 phosphoinositide-specific phospholipase C(PLC)임이 알려지고, 또한 이 효소가 분리되기에 이르러 최근 이 신호전달체계에 대한 연구가 본격적으로 이루어지고 있다. 즉, phosphatidyl inositol 4, 5-biphosphate(PIP 2)가 PLC에 의해 inositol 4, 5-biphosphate(PIP 3)와 diacylglycerol 등의 이차전달물질을 생성하는데 이는 두 경로에 의해서 유도될 수 있다.3)11)12) 첫째는 tyrosine kinase에 의존하는 수용기를 통해서, 둘째는 G-protein과 연결되어 있는 수용기를 통하는 경로이다. 이렇게 하여 유도된 이차전달물질은 세포내에서 여러가지 다양한 변화를 유도한다. 즉 IP3는 특정한 수용기와 결합하여 내형질세망과 같은 세포내 저장소에 칼슘을 유리시켜 세포내 칼슘농도를 높히며, diacylglycerol은 강력한 protein kinase C의 stimulator이고, 활성화된 protein kinase C는 세포의 성장, 분화 및 변성에 필수적인 여러 단백질을 인산화시킨다.2)
Phospholipase C는 β, γ, δ 동위효소가 존재하며, PLC-β는 G-protein의 action site로 생각되고 있으며, PLC- 는 암유전자인 src와 염기배열의 유사성을 갖고 있고, 또한 세포증식인자 등과 밀접한 관계를 갖고 있어 세포의 성장과 분화에 중요한 역활을 하는 것으로 알려지고 있다. 최근 여러 연구에서 PLC-γ1은 EGF-R tyrosine kinase의 기질로 잘 알려져 있다. 즉 상피세포가 EGF의 자극을 받은 후 세포내 생화학적 신호전달에 중요한 역활을 담당하고 있다. 또한 최근 발표된 연구에서 사람피부의 과증식질환인 psoriasis, acrochordons, seborrheic keratoses 등과 화상환자의 상피 등에서 PLC-γ1이 기저세포층 및 인접세포층에서 관찰됨을 보고하였다.13)
본 연구에서 심부외이도상피는 대부분 음성발현을 보였으나, 일부에서 부분적으로 양성발현을 보였는데 이는 저자 등이 보고한 바와 같이, 심부외이도의 일부에서의 과증식 성향을 반영하는 소견으로 생각되었다.14)15) 이에 비해 진주종상피는 기저층과 기저상부층에서 대부분 증가된 발현을 보였다. 여기서 흥미로운 점은 기저상부층에서 극세포층과 과립세포층에서 모두 강한 양성 발현을 보였는데, 이는 “과증식은 주로 기저층과 인접된 기저상부층에서 관찰된다"는 현재까지의 보고들과 일치하지 않는 결과였다.16)17)18) 여기서 그 이유를 정확히 설명하기는 곤란하나, 이는 세포의 상층부에서도 PLC-γ1을 매개로 하는 신호전달이 활발히 이루어짐을 시사하는 결과라 생각된다.
결론적으로 진주종상피에서 PLC-γ1의 발현이 증가된 결과는 진주종상피의 세포막의 tyrosine kinase activity의 활성을 간접적으로 시사해주며, 위에서도 언급한 바와 같이 tyrosine kinase는 피부상피의 증식을 유도하고 지속시키는데 가장 중요한 key hole이다. 이중 상피성장인자의 수용기는 대표적인 tyrosine kinase 수용기로 이를 통해 진주종의 과증식과정이 유도될 수 있음을 쉽게 추론해 볼 수 있다. 그러나 외부의 자극없이도 세포내에서 신호전달체계의 이상에 의해 PLC-γ1의 발현이 증갸될 수 있음을 완전히 배재할 수 없기 때문에, 이러한 수용기와의 상관 여부는 동일한 조직에서 이들의 발현을 비교함으로써 증명이 가능하리라 사료된다.
현재 눈부시게 발전하고 있는 분자생물학의 도움으로 세포의 내부에서의 변화가 점차 밝혀지고 있으며, 진주종의 형성과 유전자의 이상과의 연관 여부도 관심의 대상이 되고 있다. 따라서 본 연구결과를 토대로 세포내에서 형성된 이차전달물질이 핵내에서 어떠한 변화를 유도하는지가 다음 연구대상이 될 수 있다고 사료된다.
결론
저자 등은 중이진주종에서 PLC-γ1의 증가된 발현을 western blot 분석과 면역조직 화학적 방법을 통해 확인하였고, 이는 현재까지 확인된 여러 성장인자들의 세포내 신호전달체계를 이해할 수 있는 중요한 자료가 되리라 사료된다.
REFERENCES
1) Rhee SG, Suh PG, Ryu SH：Studies of inositol-specific phospholipase C. Science. 1989；244：546-550
2) Rhee SG：Inositol phospholipid-specific phospholipase C：Interaction of the 1 isoform with tyrosine kinase. Trends Biochem Sci. 1991；16(8)：297-301
3) Yang L, Rhee SG, Williamson JR：Epidermal growth factor induced activation and translocation of phospholipase C- to the cytoskeleton in rat hepatocytes. J Biol Chem. 1994；269：7156-7162
4) Shideo H, Huang CC：Expresion of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma：Relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope. 1995；105：1232-1237
5) Stammberger M, Bujia J：Alteration of epidermal differentiation in middle ear cholesteatoma. Am J Otol. 1995；16：527-531
6) Chao WY, Hunag CC：An immunohistochemical study of cytokeratin expression in human middle ear cholesteatoma. Arch Otorhinolaryngol. 1989；246：37-42
7) Freedberg IM： Epidermal differentiation and keratinization. In：
8) Broekaert D, Cornille A, Eto H：Keratinization of aural cholesteatoma：A quantiative histophotometric study of the suphydryl and disulphide content. In：Cholesteatoma and mastoid surgery, Second international conference, Sade J, et al (eds). Amsterdam, Kugler and Ghedini Publications, 1982：161-172
9) Kopan R, Fuchs E：The use of retinoic acid to probe the relation between hyperproliferation asociated keratins and cell proliferation in and malignant epidermal cells. J Cell Biol. 1993；109：295-307
10) Arteaga CL, Johnson MD, Todderud G：Elevated content of tyrosine kinase substrate phospholipase C- 1 in primary human breast carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA. 1991；88：10435-9
11) Berrige MJ：Inositol triphosphate and diacylglycerol, two interacting second messengers. Annu Rev Biochem. 1987；56：159-193
12) Lee CW, Park DJ, Lee KH：Purification, molecular cloning, and sequencing of phospholipase C- 4. J Biol Chem. 1993；268：21318-21327
13) Chun YM, Park K：Hyperproliferative characteristics in human deep meatal epidermis. Korean J Otolaryngol. 1997；39(1)：56-62
14) Johson AP：The mechanism of migration in the external ear canal. In：Cholesteatoma and mastoid surgery, Third international conference, Tos, et al (des). Amsterdam, Kugler and Ghedini Publications, 1988：271-273
15) Johson AP：The mechanism of migration in the external ear canal. In：Cholesteatoma and mastoid surgery, Third international conference, Tos, et al (eds). Amsterdam, Kugler and Ghedini Publications, 1988：271-273
16) Park K, Chun YM, Park HJ：Cytokeratin immunohistochemistry of acquired cholesteatoma in middle ear. Korean J Otolaryngol. 1994；37(1)：199-205
17) Park K, Chun YM, Park HJ：Cytokeratin expressions of induced cholesteatoma in gerbil. Korean J Otolaryngol. 1996；39(5)：747-753
18) Bujia J, Schilling V, Holly M：Hyperproliferation-associated keratin expression in human middle ear cholesteatoma. Acta Otolaryngol (Stockh). 1993；113：354-368
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