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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(5): 682-687. |
| Glutamate-Immunoreactive Neurons in the Nucleus Ambiguus of the Cat: Comparison after Cholera Toxin beta-subunit Injection to the Nodose Ganglion. |
| Young Mo Kim, Jung Il Cho, Young Seok Chung, Joon Hyung Kim, Yoshikazu Yoshida, Minoru Hirano |
1Department of Otorhinolaryngology, InHa University College of Medicine, Inchon, Korea.
2Department of Otorhinolaryngology, School of Medicine, Kurume University, Kurume, Japan. |
| 고양이 의핵내에서 글루탐산-면역 양성을 보이는 뉴우론과 결절핵에 콜레라 독소 베타 단위 주사후 역행적으로 표식된 뉴우론과의 비교 |
| 김영모1 · 조정일1 · 정영석1 · 김준형1 · Yoshikazu Yoshida2 · Minoru Hirano2 |
| 인하대학교 의과대학 이비인후과학교실1;Department of Otorhinolaryngology, School of Medicine, Kurume University, Kurume, Japan2; |
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| ABSTRACT |
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Though the existence of glutamate-immunoreactive(GL-IR) neurons has been suggested in the nucleus ambiguous(NA) by immunocytochemistry, information regarding the distribution of neurons containing glutamate as a neurotransmitter has been to be elucidated. The author focused on distribution and morphology of GL-IR neurons in the NA, which were compared with cholera toxin beta-subunit(CTB) labeled neurons after its injection to the nodose ganglion(NG) in the cat. The results showed that the majority of neurons in the NA were immunoreactive to excitatory neurotransmitter glutamate, and they seemed to be distributed evenly without any special area of predilection or grouping pattern. The cellular shape was predominantly multipolar. GL-IR neurons showed some similarity in morphology and distribution pattern with CTB labeled cells. |
| Keywords:
GlutamateㆍCholera toxinㆍLarynxㆍMotor neuronㆍNucleus ambiguous(NA) |
서론
근래에 와서 Gacek4)을 비롯한 여러 저자들의 연구9)12)23)를 통해 각 내후두근에 따른 운동 신경세포의 위치 및 분포도(cytoarchitectural map)가 비교적 상세히 밝혀졌으며, 이러한 사실은 종(species)에 따른 약간의 차이가 발견되어 논란의 여지가 있긴 하나, 대체적으로 일반적인 것으로 인정되고 있다. 후두의 신경조직망은 내후두근의 섬세한 운동과 후두 반사 등을 조절하며, 이러한 기능들은 뇌간의 의핵과 상위 대뇌 피질에 위치한 조절 부위들이 서로 복잡하게 이루어 진다는 사실이 여러 후두의 해부학16)17)22) 및 생리학적 연구11)결과 밝혀졌다.
내후두근을 지배하는 운동신경들은 뇌간의 의핵(Nucleus ambiguus, NA)내에 존재한다. 의핵내 후두 운동신경세포들은 호흡, 반사적 후두폐쇄 및 발성시 필요한 매우 다양한 후두의 기능 수행에 필수적인 내후두근의 섬세한 운동을 최종적으로 조절하며 상위 중추로 연계되어 있는 것으로 생각되어지고 있다.11)16)21)23)
이런 복잡한 신경구조는 여러 종류의 신경전달물질에 의해 조절되고 있는데7). 잘 알려진 신경전달 물질들 중에서 글루탐산(Glutamate)은 분자량이 작으면서 중추신경계에서 신경정보전달에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 특히 이 물질은 뇌조직내에서 다른 아미노산 보다 높은 농도로 널리 분포하고 있는 것으로 알려져 있다. 이 물질에 관련된 여러가지 기능들은 현재까지도 많은 연구의 대상이 되고 있는데3) 일반적으로 알려진 것은 글루탐산이 포유동물의 중추신경계내 여러 신경경로에서 흥분성 신경전달 물질로 작용한다는 것이다.6)10)14)19) 예를들어 척수에서는 글루탐산이 dorsal roots의 일차구심성 신경섬유에 집중적으로 분포하여 감각신경정보를 전달하거나 운동신경의 조절을 담당하는 것으로 알려져 있으며 뇌에서는 cerebral cortex, hippocampus, neostriatum, cerebellum, lower hypothalamus 등에 분포하는 것으로 알려져 있다. 그러나 내후두근의 운동을 관장하는 것으로 알려진 의핵내에서는 글루탐산과 같은 분자량이 적은 아미노산에 의한 신경전달에 관해서는 아직까지는 밝혀지지 않았다.
말초장기를 지배하는 운동신경세포체를 중추신경계통내에서 형태학적으로 밝히기 위하여 과거에는 퇴행성 변화를 많이 이용하였으나 이후 축삭과 세포체사이의 물질이동(axoplasmic transport)의 원리를 이용하여 신경세포체나 신경섬유에 추적자(tracer)를 주입하여 운동신경세포체와 감각신경세포체를 찾아내는 방법이 이용되고 있다. 이들 추적자중 evans blue, fast blue 등의 형광물질과 horseradish peroxidase(HRP) 효소가 많이 이용되었으나 최근에 개발된 콜레라 독소 베타단위(cholera toxin β-subunit(CTB))가 골격근을 지배하는 운동신경과 감각신경세포체를 추적하는 좋은 추적자로 알려져 있다.5)
본 연구는 고양이 후두신경의 결절핵(nodose ganglion, NG)에 콜레라 독소 베타단위를 주사하여 역행적으로 표식된 의핵내 후두근 운동뉴우론을 확인하고, 한편 확인된 운동뉴우론에 대한 글루탐산-면역 반응(GL-IR)을 조사하여 고양이 뇌간 의핵의 후두근 운동뉴우론에 글루탐산이 관여하는 가를 살펴보고자 하였다.
재료 및 방법
본 실험은 체중 1∼2kg의 건강한 암·수 고양이 4마리를 대상으로 하였다. 고양이를 30∼40mg/kg 용량의 ketamine과 0.5∼1.0mg/kg의 xylazine hydrochl-oride로 전신마취 후 경부 정중선에 절개를 하고 근육을 박리하여 후두와 기관을 노출시켰다. 우측 미주신경을 찾아 결절핵을 확인 후, 수술 현미경 하에서 예리한 유리 피펫을 장착한 10μl Hamilton 주사기를 이용하여 NG에 3μl의 CTB(List biological laboratories. Inc., Ca-mpbell, USA)를 추적자가 새지 않도록 서서히 주사바늘을 후퇴시키면서 주입하였다. 주위조직을 생리식염수로 세척한 후 피부를 봉합하였다.
48시간 후, 고양이에 heparin을 관주 후 2% paraformaldehyde와 0.1% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer로 심장을 관류하여 고정하였다. 이후 뇌간을 절제하여 20% sucorse in 0.1M phosphate buffer 용액에 3일간 침수하여 동결에 의한 손상을 방지하였다. 뇌간을 50μm 간격으로 연속 동결절편 후, 2군으로 나누어 각기 항-글루탐산(rabbit anti-glutamate, Chemicon International, CA, USA) 및 항-콜레라 톡신(goat anti-cholera toxin B, List biological laboratories. Inc., Campbell, USA)에 의한 Avidinbiotin-complex(ABC) 면역조직 화학법으로 염색하였다. 이런 절편들은 0.3% Triton-X in 0.1% phosphate buffer saline(PBS-T)에 2일간 침수 후 0.3% H 2O 2를 함유한 0.1M PBS-T에 1시간 동안 처리하였다. CTB에 대해서는 정상 염소 혈청에, 또 글루탐산에 대해선 정상 토끼 혈청에 1시간 동안 항온 반응 후 PBS-T에 희석된 1차 항 혈청 즉 항 글루탐산, 항 콜레라 독소에 3일동안 반응 시켰다. 이 절편들은 희석된 biotinylated anti-goat IgG 용액에 2시간 동안 반응 후 ABC reagent(Vectastatin)에 1시간 침수시켰다. 이어 0.02% 3.3-diamonobenzidine에 5분간 반응시킨후 0.02% H 2O 2 용액에 10분간 담가 발색시켜 chromealum-gelatin 칠이된 슬라이드 유리에 올려 광학 현미경으로 각각 CTB, 글루탐산에 반응하는 뉴우론의 존재 및 형태를 관찰하였다.
결과
1. 콜레라 독소 베타단위(CTB)에 대한 표식세포
고양이 결절핵에 CTB를 주사후 역행적으로 후두의 뇌간에 표식된 뉴우론은 의핵의 전장에 걸쳐 관찰되었다. 의핵은 문측으로는 상올리브핵의 미단부로 부터 시작하여 미측으로는 하올리브핵의 미단부에 걸쳐 위치하였다. CTB에 대해 표식된 뉴우론의 대부분은 여러 수상돌기를 가진 다극형 신경세포 였고, 일부는 작은 방추상 신경세포 였다(Fig. 1).
2. 글루탐산에 면역반응(GL-IR)하는 뉴우론
고양이 뇌간에 대한 항글루탐산 면역반응 결과 의핵내 대부분의 뉴우론이 글루탐산에 대해 면역반응성 세포였으며 인접 절편에서 항콜레라 독소 베타단위에 반응한 뉴우론이 항글루탐산에도 반응이 관찰되었다. 그들의 분포는 의핵내 특정부위에 국한 또는 밀집되지 않고 전체적으로 분포하는 양상을 보였고, 모양은 크기가 큰 다극성 세포였으며 여러 수상돌기를 관찰할 수 있었다. 한편 소수의 방추상 뉴우론들이 의핵 복측에서 관찰되었다(Fig. 2).
고찰
중추신경계나 말초신경계에서 발견되는 아미노산 중 일부가 신경전달물질(neurotransmitter)로 작용함은 이미 여러 문헌에서 보고되어 왔다, 특히 뇌조직이나 척수에서 발견되는 아미노산 신경전달물질은 small interneuron에서 그 약리학적 기능을 발휘하는 것으로 추정되고 있는데 기존의 면역조직화학적 검사나 receptor 연구를 통하여 아미노산 신경전달물질의 전달경로가 많이 밝혀지고 있는 실정이다. 신경생리학적인 측면에서 볼때, 아미노산 신경전달물질은 2종류로 대별할 수 있는데 흥분성 신경전달물질인 글루탐산 등과 억제성 신경전달물질인 GABA(γ-amino butyric acid) 등이 대표적인 물질이 되겠다.
글루탐산은 phosphate activated glutaminase(PAG)에 의해 글루타민으로 부터 형성된다.13)18) 글루탐산이 포유동믈의 중추 신경계에서 흥분성 신경전달 물질로 작용한다는 것은 많은 연구 결과에 의해 뒷받침 되고 있다.3)10)14)19) Senba등15)은 뇌간의 PAG에 대한 면역세포 화학법을 통해 의핵내에서 이 효소 면역활성도가 나타남을 보고하였으나, 아직까지 의핵내 후두운동신경 뉴우론에서 신경전달물질로서의 글루탐산과의 연관성에 관해 연구한 경우는 없다. 이에 본 연구에서 직접적으로 글루탐산에 대한 면역 반응성을 알아본 결과, 의핵의 전체 부위에 걸쳐 글루탐산에 강한 면역반응을 보인 뉴우론들을 관찰할 수 있었다.
CTB는 신경세포막에 존재하는 monosialoganglio-side와 특이한 상호작용으로 결합체를 형성한 후 신경세포막으로부터 능동적인 세포내 이입이 이루어지게 된다.17)20) 이러한 특성에 기인하여, 결절핵에 CTB를 주입하면 역행적으로 내후두근의 운동신경 뉴우론의 집합체로 알려진 의핵내에서 CTB로 표식된 뉴우론이 나타나게 되므로 후두신경의 이들 CTB표식 뉴우론과 뇌간에 대하여 직접 글루탐산염색한 GL-IR 뉴우론의 비교를 통하여 의핵내 후두운동신경 뉴우론의 분포 및 형상을 파악할 수 있었다. 저자들의 실험에서 이들 GL-IR 뉴우론의 분포를 살펴본 결과 CTB에 의해 표식된 뉴우론의 분포와 유사하였고, 그 모양 또한 일부 작은 방추상 세포가 있긴 했으나 CTB 표식 뉴우론과 유사한 다극형상이 대부분이었다. 이런 뉴우론의 형상은 직접 내후두근으로 부터 의핵내로 역행적으로 표식하여 발표된 많은 보고에서의 뉴우론 양상과 일치하는 소견이었다.4)9)12)22)23) 즉, 저자의 실험과 기존의 연구결과들을 고찰하여 볼때, 결절핵내 CTB 주사후 표식된 내후두근의 신경 뉴우론이 뇌간 의핵에서의 흥분성 운동신경 뉴우론으로 알려진 GL-IR과 일치한다고 볼 수 있었다. 즉 글루탐산은 후두 운동신경 뉴우론의 주요한 흥분성 신경전달 물질이라는 것을 뒷받침 한다.
글루탐산은 중추신경내의 중요한 신경전달 물질일 뿐 만 아니라 뇌의 중요한 대사물질로서도 역할을 한다.1)8) 즉 글루탐산의 대사푸울(metabolic pools)은 신경전달물로서의 푸울(transmitter pools) 보다 그 크기가 동일하거나 더 크다. 특히 뉴우론의 세포질내는 신경전달 물질이 유리되는 장소와 거리가 멀기 때문에 이 부위의 글루탐산 면역반응 정도는 신경전달물질보다는 대사물질로서의 보관양에 더 비례한다고 할 수 있다.3) 또한 글루탐산은 억제성 신경전달 물질인 GABA의 바로 전단계 전구물질이며, 대부분의 GABA-IR 뉴우론의 세포질내에서도 글루탐산에 대한 면역반응성을 볼수있다는 보고13)에 비추어볼 때, 본 연구에서 관찰된 많은 GL-IR 뉴우론중 일부는 GABA-IR 뉴우론과 중복되었을 가능성이 있다. 그러나 본 연구에서는 뉴우론의 세포체내에서 뿐만아니라 세포체에서 뻗은 수상돌기에서도 고배율 광학현미경하에서 글루탐산-면역반응이 뚜렷이 관찰되므로 의핵내 후두신경 뉴우론에서 흥분성 신경전달물질로서의 글루탐산이 관여할 것으로 사료된다. 앞으로 전자현미경을 통한 신경 말단에서의 글루탐산-면역반응성의 관찰이 좀더 유익한 정보를 줄것으로 사료되어 이에 관한 연구가 이루어져야 될 것이다.
결론
저자들은 의핵내 다수를 차지하는 뉴우론은 흥분성 신경전달 물질에 면역반응하는 GL-IR 세포군임을 관찰하였다. GL-IR 세포군은 CTB에 의해 역행적으로 의핵내에 표식된 뉴우론군과 비슷한 모양 및 분포를 보였으며, GL-IR 세포는 CTB에 의해 표식된 흥분성 운동신경 뉴우론과 관련되어 있다고 생각할 수 있다. 의핵내 이 세포군의 정확한 역할에 대한 이해를 위해 후두의 신경해부학적, 신경생리학적 연구가 더 진척되어야 할 것으로 사료된다.
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