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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(4): 600-606. |
| Changes of the Sialoglycoconjugates in the Maxillary Sinus Mucosa of theRabbits after Inoculation of Influenza a Virus. |
| Jin Hak Cho, Yin Gyo Jung, Chin Saeng Cho, Kyung You Park, Hyun Joon Lim |
| Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Chuncheon, Korea. |
| Influenza A 바이러스에 감염된 가토상악동점막에서Sialoglycoconjugates의 변화 |
| 조진학 · 정인교 · 조진생 · 박경유 · 임현준 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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The present study was carried out in order to observe the changes in the expression of the sialoglycoconjugates of the rabbit sinus mucosa after inoculation of influenza A virus utilizing a biotin labeled lectins for light microscopy with four different lectins; Maackia amurensis(MAA), Wheat germ agglutinin(WGA), Sambucus nigra(SNA), and Peanut(PNA). A comparison of the affinity of these lectins demonstrated the different distribution of sialoglycoconjugates in the ciliary layer and goblet cells. The normal sinus mucosa stained with four types of lectins showed that the sialoglycoconjugates were mainly distributed in the ciliary layer and goblet cells. Moreover, the main sugar residues of the sialoglycoconjugates were figured out to be consisted of Neu5Ac(alpha2,3)Gal, GlcNAc and Neu5Ac. Influenza A virus infection decreased the staining intensity of the mucosa with MAA, but not with WGA. The staining intensity of PNA, however, was highly increased in the viral infected mucosa.
These results suggest that Neu5Ac(alpha2,3)Gal sugar residues may be required as protecting factor or modulator for Influenza A virus infectivity. |
| Keywords:
SialoglycoconjugatesㆍLectinsㆍInfluenza A virusㆍMaxillary sinus mucosa |
서론
비점막은 배세포와 점막고유층 점액분비세포로부터 분비된 점액으로 덮혀있으며, 이는 외부로부터 침입한 각종 물리적, 화학적, 생물학적 물질을 포착하여 체외로 배출함으로써 비점막 및 하기도를 보호하는 생체방어작용을 갖고 있다.3) 점액의 주성분은 당단백이며 구조는 폴리펩타이드사슬에 N-acetylgalactosamine(GalNAc)이 O-배당결합(glycoside bond)으로 연결되어 있고 GalNAc에는 몇개의 단당이 붙어있으며 그 말단부에는 대부분 sialic acid가 존재한다. Sialic acid가 포함된 sialoglycoconjugates는 점막표면에 호수성 환경을 제공하고 탈수를 막아줄 뿐만 아니라17), 외부에서 들어오는 이물질의 흡착에 관여하는 것으로 알려져 있으며5)11), 최근 생쥐의 비점막에서 렉틴을 이용한 연구결과 호흡점막과 후각점막의 sialoglycoconjugates의 조성과 분포가 서로 다르다는 것이 밝혀짐으로써 호흡점막과 후각점막이 각각 다른 병원미생물에 의하여 감염이 일어나는 것에 대한 해석이 가능하게 되었다.21)
급성상기도염의 중요한 원인균중 하나인 influenza 바이러스도 세포막의 sialoglycoconjugate의 특정한 사슬을 인지하고 그곳에 부착하여 화학적, 생물학적 작용을 거쳐 세포내로 침입하는 것으로 알려져 있다.15) 이에 저자는 influenza A 바이러스에 감염 후 상악동 점막표면의 sialoglycoconjugates의 변화를 관찰하고저 정상가토의 상악동점막에 influenza A 바이러스를 감염시킨 후 sialic acid에 특이적으로 반응하는 렉틴인 MAA, WGA, SNA와 Galactose(Gal)에 특이적으로 반응하는 렉틴인 PNA를 이용하여 sialoglycoconjugates의 변화 양상을 검토하였다.
재료 및 방법
1. 재료
1) 실험동물
체중 2.5∼3.5Kg의 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 백색가토(New Zealand white rabbit) 15마리를 암수 구별없이 일정한 환경에서 사육하였다.
2) Influenza A 바이러스
본 실험에 사용된 바이러스는 한림대학교 의과대학 미생물학교실에서 배양중인 influenza A 바이러스；A/Korea/1/80(H3N2)를 2회 Medin Darby canine kidney cell(MDCK)에 배양하여 실험전까지 -70℃에 보관하였다가 실험시 해빙하여 혈구응집저지반응으로 역가를 측정하여 Eagle’s minimum essential medium을 첨가하여 7×10 6 plaque forming units(p.f.u.)로 희석하여 사용하였다.
2. 방법
총 15마리 중 5마리는 Eagle’s minimum essential medium만을 첨가한 용액을 상악동에 천자주입하여 정상대조군으로 이용하였고 10마리는 아래와 같은 방법으로 실험하였다.
1) Influenza A 바이러스 주입
케타민(Ketamine HCL, 50mg/Kg)을 근육주사하여 전신마취시킨 후 혈청학적 검사를 위하여 심장을 천자하여 혈액을 채취하였다. 베타딘 용액과 알콜로 비배부를 소독한 다음 우측상악동 전벽을 천자흡인하여 동내에 저류액 등의 병변이 없는 것을 확인한 후 7×10 6 p.f.u. 정도의 부유액으로 만든 바이러스용액을 1cc 피부반응검사용 주사기를 이용하여 0.3cc를 주사하였다. 바이러스감염에 대한 판단은 실험전에 채취한 혈액과 희생시 심장에서 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청을 -70℃에 보관하였다가 혈구응집저지반응(hemagglutination inhibition test)을 시행하여 바이러스 주입전에 비하여 역가가 4배이상 증가한 경우 바이러스에 감염이 되었다고 판정하였다.
2) 조직의 채취 및 광학현미경 관찰을 위한 표본제작
Influenza A 바이러스를 상악동에 천자주입한 7일째, 케타민(Ketamine HCl, 50mg/kg)을 근육주사하여 전신마취 시킨 후 상악동을 노출시키고 상악동 내측벽 점막을 1×1cm 크기로 잘라내어 10% formalin 용액에 24시간 고정한 후 파라핀 포매과정을 거쳐 4∼5μm두께로 박절하였다. 4종의 biotin 결합 렉틴(Table 1) 즉, MAA, WGA, SNA, PNA(EY laboratories, San Mateo, CA)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase complex법으로 염색하였다. 염색방법은 내인성 과산화효소의 활성을 없애기 위하여 3% 과산화수소수용액에 실온에서 20분간 처리하였고 단백질의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 1% bovine serum albumin을 역시 실온에서 5분간 처치하였다. Biotin 결합 렉틴의 농도를 30 μg/ml로 희석하여 높은 습도가 유지되는 용기에서 1시간 반응시킨 후 diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색 반응시켰다. 염색표본에서 렉틴의 반응을 Olympus Vanox-S type의 광학현미경을 사용하여 400배로 사진촬영 후 강반응이 나타나는 경우를 +++, 중등도의 반응을 보이는 경우를 ++, 약반응이 나타나는 경우를 +, 염색반응이 안나타나는 경우를 0으로 정하여 비교 관찰하였다.
결과
1. MAA 반응
대조군의 상악동 점막에서는 상피세포의 섬모층과 배세포의 세포질에 중등도의 발색반응(++)을 보였으나, 고유층 선조직과 결체조직에는 반응이 없었다(Fig. 1-A). Influenza A 바이러스에 감염된 점막은 대조군에 비하여 섬모층에서 다소 약한 반응(+)을 보이나 배세포에는 반응이 관찰되지 않았다. 고유층 선조직과 결체조직에도 대조군과 마찬가지로 반응이 나타나지 않았다(Fig. 1-B).
2. WGA 반응
대조군의 상악동 점막에서는 상피세포의 섬모층에 강한 발색반응(+++)을 보이며, 결체조직과 배세포의 세포질 상층부에 중등도(++)의 반응을 보였으나 고유층 선조직에는 반응하지 않았다(Fig. 2-A). Influenza A 바이러스에 감염된 점막은 상피세포의 섬모층에 강반응(+++)을 보이고 대조군에 비하여 배세포의 현저한 증식 및 비후와 함께 세포질에 강한 발색반응(+++)을 보였다(Fig. 2-B).
3. SNA 반응
대조군, Influenza A 바이러스 감염군 모두 상피세포의 섬모층에서 약반응(+)을 보이고, 배세포, 결체조직 및 고유층 선조직 등에서는 반응하지 않았다(Fig. 3-A, B).
4. PNA 반응
대조군 상악동 점막에서는 상피세포의 섬모층과 배세포에서 약반응(+)을 보였고, 고유층 선조직과 결체조직에는 반응이 없었다(Fig. 4-A). Influenza A 바이러스에 감염된 상피세포의 섬모층과 배세포에는 대조군에 비하여 현저히 증가된 강반응(+++)을 보였다(Fig. 4-B)(Table 2).
고찰
당단백 당잔기 말단부에 존재하는 sialoglycoconjugates의 조직내 분포를 파악하기 위하여 최근 WGA, MAA, SNA 등의 렉틴이 널리 이용되고 있다. 특히 MAA는 Neu5Ac(α2,3)Gal의 당사슬에 친화력을 갖는 반면, SNA는 Neu5Ac(α2,6)Gal/GalNAc에 친화력을 보임으로써18) 각각의 렉틴에 대한 조직내 반응성의 정도를 살피면 sialic acid를 갖는 sialoglycoconjugates의 당사슬에 대한 비교검토가 가능하다. 대부분의 sialic acid는 당잔기가 serine 혹은 threonine과 결합하는 O-결합형일 경우, Galactose와 α2,3 배당결합(glycosidic bond)을 하거나 GalNAc과 α2,6 배당결합을 이루어 점액형 당단백의 형태를 이루며, asparagine과 결합하는 N-결합형일 경우에는 대부분 Galactose와 α2,6 배당결합을 하는 혈장형 당단백 형태를 보인다.16) 또한 Neu5Ac(α2,3)Gal와 Neu5Ac(α2,6)Gal는 α2,6 결합의 자유로운 회전에 비하여, α2,3 결합이 비교적 제한된 회전을 갖는 물리적 기능의 차이로 인하여 Neu5Ac(α2,3)Gal가 점액에 점탄성을 제공하는데 보다 효과적임이 밝혀졌다.14)
Sialic acid의 국소화에 관한 연구로 국내에서는 권 등1)이 MAA와 SNA를 이용하여 백서 비점막의 sialic acid의 발현시기를 연구하여 SNA는 태아에서 성체에 이르기까지 상피세포에 발현되지 않으나, MAA는 생후 5일부터 강반응을 보였다고 하여 Ueno등23)이 쥐(BALB/c)의 중이점막에서 MAA가 배세포와 점막하 점액분비세포에는 반응하나 SNA는 반응을 보이지 않았다는 보고와 일치한다. 이와 같은 결과는 쥐의 비점막과 중이점막 배세포에서 sialic acid가 분비되며 당사슬은 Neu5Ac(α2,3)Gal임을 시사한다. 그러나 친칠라의 이관점막과 중이점막은 SNA에 반응하여 Neu5Ac(α2,6)Gal/GalNAc의 당사슬을 갖고22), 설치류(mouse, rat, hamster)의 기관호흡상피의 섬모와 배세포는 Neu5Ac(α2,3/6)Gal의 당사슬을 갖는다는 보고도 있다.16) 최근 Ueno등21)은 백서 비점막에서도 호흡점막과 후각점막의 sialoglycoconjugates가 서로 다른 조성을 갖는다고 하였고, 그외 여러 학자의 연구 보고6)15)19)에 의하면 종과 종, 같은 종이라도 기관과 조직, 미세하게는 세포간의 차이에 따라 당화전이효소(glycosyltransferase)의 분포가 다르므로 표현되는 복합당질의 조성과 분포에도 차이가 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서는 정상 상악동점막에서 배세포의 점액과 상피세포의 섬모가 MAA와 WGA에 반응을 보이고, SNA에는 약반응을 보임으로써 당사슬 말단부의 당서열이 주로 Neu5Ac(α2,3)Gal일 것이라고 생각되었다.
Influenza A 바이러스에 감염된 점막은 염증세포의 침윤, 섬모의 소실 및 섬모세포의 탈락, 배세포의 증가 등, 형태학적 변화가 일어나며 이러한 변화는 감염 7일 후에 가장 심하고 4주가 지나면 회복된다.2) 본 연구에서는 형태학적으로 섬모 소실 및 섬모세포의 탈락의 정도가 가장 심하였던 감염 후 7일에 조직을 채취하여 렉틴의 반응성을 관찰하였다. 그 결과 정상군에 비하여 배세포의 수는 증가하였으나 세포질내 MAA에 대한 반응성은 떨어지고 섬모층의 반응도도 섬모의 부분적 소실과 함께 감소하였다. 이러한 원인으로는 우선 influenza A 바이러스표면에 다량 존재하는 neuraminidase에 의하여 점막표면의 sialic acid가 제거되어 렉틴의 반응성이 감소한 것으로 생각할 수 있다. 이러한 가정은 galactose와 반응하는 렉틴인 PNA의 반응성이 정상대조군에 비하여 바이러스 감염군에서 증가되는 것을 보아 뒷받침 할 수 있다. Neuraminidase는 장내세균이나 폐렴구균같은 박테리아에서 분비되는 효소로서 당사슬 말단부의 sialic acid를 파괴하는 기능이 있는 것으로 알려졌으나4), influenza A 바이러스나 parainfluenza 바이러스의 표면에도 다량 존재하는 것으로 밝혀져 최근 이 효소의 역할에 대한 연구가 계속되고 있다.10) 두번째로는 influenza A 바이러스의 DNA가 숙주세포의 DNA에 작용하여 sialoglycoconjugates의 당사슬 구조를 변화시킨 것으로 생각할 수 있다. 즉 말단부 당질이 sialic acid와 같이 당사슬 말단부 당질을 이루는 fucose와 같은 다른 당질로 대체되어 MAA의 반응성이 감소했다고 가정할 수 있는데 이는 만성 상기도감염이 있는 환자의 점액당단백에서 fucose와 sialic acid의 구성비(S/F ratio)를 측정하여 정상 대조군보다 낮은 결과를 보고한 Yasuoka등24)의 주장과도 일치한다.
점액성 당단백에 주로 반응하여 상피 표면 점액분포의 추적자로 사용되는 WGA의 반응성은9)20) 정상 점막군에서 상피세포 표면과 배세포에 강반응을 보이고, internal GlcNAc와 hyaluronic acid에도 일부 반응하기 때문에8) 결체조직에도 양성반응을 보였다. 바이러스에 감염된 점막군에서는 배세포의 증식과 비대에 따라 분비되는 분비과립의 증가에 의하여 상피표면과 배세포가 강하게 반응하였다. SNA는 반응성의 변화를 관찰할 수 없었는데 이는 당사슬 말단부 감당(oligosaccharide)의 당사슬이 주로 MAA에 반응하는 Neu5Ac(α2,3)Gal으로 구성되었고 influenza A 바이러스 감염이 Neu5Ac(α2,6)Gal에는 별 영향을 미치지 않기 때문일 것으로 생각된다.
일반적으로 각종 병적 상황에서는 sialic acid의 양이 감소하는 것으로 알려져 있으나7)12)13) 이는 주로 악성종양과 같은 조직내 변성이 있는 경우이고, influenza A 바이러스에 감염된 부비동점막에서 sialoglycoconjugates의 형태학적 변화에 관한 본 연구는 바이러스 혹은 병원균의 상악동점막 침입에 있어서 sialoglycoconjugates의 생리학적 역할을 재조명하고 상악동점막의 염증성 변화에 대한 sialoglycoconjugates의 방어기능에 중요한 단서를 제공한다고 생각된다.
결론
1) 정상대조군에서는 섬모와, 배세포에서 MAA와 WGA의 반응이 관찰되었으나 SNA와 PNA에는 미약한 반응을 보였다.
2) Influenza A 바이러스 감염군의 상피조직에서 MAA의 반응성은 섬모와 배세포에서 감소하였으나, WGA의 반응성은 세포표면의 섬모와 배세포에서 반응성의 변화가 없었다.
3) Influenza A 바이러스 감염군의 상피세포의 섬모와 세포질에 대한 PNA의 반응성은 정상대조군의 반응성에 비하여 증가한 소견을 보였다.
4) SNA는 정상점막과 influenza A 바이러스, 폐렴구균에 감염된 점막 모두에서 섬모층에만 약한 반응을 보였다.
이와 같은 결과로 미루어 가토상악동 점막표면과 배세포 분비과립에서 sialic acid를 갖는 sialoglycoconjugates의 말단부 당서열은 주로 Neu5Ac(α2,3)Gal로 구성되었으며, 상악동 점막이 influenza A 바이러스에 감염되면 상피표면의 sialic acid는 감소되어 sialic acid를 포함하는 sialogylcoconjugates가 바이러스 수용체로서 작용을 하고 있다는 것을 암시하였고 향후 본 연구 결과를 뒷바침하기 위하여 전자현미경을 이용한 세포질 차원에서의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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