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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(3): 382-388. |
| Localization of Vasoactive Intestinal Polypeptide-Containing Nerve Endings in Guinea Pig Nasal Gland by Transmission Electron Microscopy. |
| Sea Yuong Jeon, Seong Ki Ahn, Jae Jun Sung, Tae Gee Jung, Eui Gee Hwang |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Gyeong-Sang National University, Chinju, Korea. |
| 기니픽 비선내 Vasoactive Intestinal Polypeptide 함유 신경종말의 투과전자현미경적 관찰 |
| 전시영 · 안성기 · 성재준 · 정태기 · 황의기 |
| 경상대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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Vasoactive intestinal polypeptide(VIP), 28-amino acid peptide extracted from porcine duodenum first, has been known as a potent vasodilator. And, VIP is also one of the important neurotransmitters in autonomic pathways affecting secretion and vascular tone of the airway. The purpose of present study is to localize the VIP-containing nerve endings in the nasal gland of the guinea pig at ultrastructural level. For immunoelectron microscopy, adult guinea pigs(300-400g B.W.) were perfused with Zamboni fixative through the aorta and the nasal septum were removed. 20nm cryosections were made for immunocytochemistry using rabbit anti-VIP and ABC methods. After DAB reaction, sections were processed for pre-embedding method, and 70nm ultrathin sections were cut. Routine uranyl acetate and lead citrate staining were employed, and immunoreactivity was observed under transmission electron microscope.
VIP-containing nerve endings were located in cytoplasmic interdigitation between acinar cells, and also found along the basal surface of the acini, excretory ducts, and myoepithelial cells as well. These findings imply that VIP might be involved in secretory activity of the nasal gland of the guinea pig. |
| Keywords:
Vasoactive intestinal polypeptideㆍNasal glandㆍTransmission electron microscopyㆍImmunocytochemistry |
서론
자율신경계에는 부교감신경의 콜린성 신경섬유와 교감신경의 아드레날린성 신경섬유외에도 신경펩타이드에 의해 조절되는 펩타이드계 신경지배가 존재함이 지난 수십년간 연구에 의해 밝혀져 왔다. 전통적인 교감 및 부교감신경계가 아닌 신경지배는 nonadrenergic-noncholinergic 신경지배라고 총칭되는데 이들에 대한 연구는 최근의 신경분야의 연구에 있어 가장 활발한 분야이다. 상기도 점막에 분포하는 펩타이드계 신경전달물질로서는 vasoactive intestinal polypeptide(VIP), neuropeptide Y, calcitonin gene-related peptide, neurokinin A, substance P(SP)등이 알려져 있다.3) 그 중에서도 VIP는 28개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 1970년에 돼지 십이지장으로부터 추출되었으며 혈관확장을 유발하는 것으로 그 존재가 처음으로 밝혀지게 되었다.15) 호흡기에서는 아드레날린성 수용체와 무관하게 기관 및 기관지 평활근, 그리고 폐 혈관 평활근을 이완시키며 호흡기 점막의 선분비를 조절하여 점액성 선분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다.4)7)8)14)15)19) VIP는 아세틸콜린과 함께 콜린성 신경섬유내에 존재하는 것으로 밝혀져 있다.5)17) 호흡기에서는 VIP 함유 신경은 상피하 결체조직, 혈관 주위, 선조직 주위에서 분포함이 밝혀져 있다.4)11)12)
전자현미경적으로 VIP 함유 신경종말의 비선내 지배부위에 대한 미세형태학적 연구는 국내에서는 보고된 바 없다. 전자현미경을 이용하여 VIP 함유 신경종말의 비선내 지배부위에 대한 미세형태학적 구조를 알 수 있다면 비선 분비기전의 연구 뿐아니라 비염 및 비알레르기에서 비즙 과다분비의 기전을 밝히는데 필요한 기본적인 단서를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
VIP 함유 신경의 존재를 밝히기위한 방법으로서는 면역조직화학적 염색법중 고도의 감수성을 가져 최근 널리 보편화되고있는 ABC법6)10)을 이용하여 VIP 함유 신경을 조직내에서 동정할 수 있으며 VIP 함유 신경종말을 관찰하기 위한 면역전자현미경법으로는 조직을 합성수지에 포매하기에 앞서 면역염색을 시행하고 조직 내 항원의 전체적인 분포를 관찰하여 보고자 하는 부위를 선택적으로 삭정하여 관찰할 수 있는 전포매 법(pre-embedding method)1)을 이용하여 신경종말내 VIP의 존재를 동정할 수 있다.
본 연구의 목적은 기니픽 비점막에서의 VIP 함유 신경에 대한 면역조직화학적 염색을 행하여 VIP 함유 신경종말의 비선내 분포를 전자현미경하에서 관찰하여 VIP 함유 신경의 비선내 지배 부위를 정확히 규명함으로써 비선의 분비기전에 있어서 VIP 신경지배의 작용기전에 대한 형태학적 단서를 찾고자 한다.
연구 재료 및 방법
1. 조직의 처리
실험동물은 체중 300∼400gr의 외견상 건강해 보이는 12주된 기니픽을 사용하였다. Ketamine hydrochloride(Ketalar(r), 75mg/kg)와 xylazine hydrochloride(Rompun(r), 10mg/kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 전신마취시키고 전 흉벽을 절개하여 심장을 노출시켰다. 노출된 기니픽 심장의 좌심실을 통하여 대동맥에 16게이지 침을 고정시킨후 0.9% 생리식염수를 0.5ml/g로 관류시키고 곧이어 Zamboni(PH7.3, 4℃) 고정액 2ml/g으로 관류고정시켰다. 비배부의 중앙에서 피부로부터 골막까지 약 2cm 정도 수직절개하여 비강을 노출시킨 후 비중격의 점막에 손상을 주지 않도록 주의하면서 비중격을 조심스럽게 박리하여 3×5mm 크기의 절편을 취하였다. 조직절편을 4℃ Zamboni 고정액에 6시간 더 침습고정한 후 인산완충용액(0.1M PBS)에 5분간씩 3회 세정하고, 25% sucrose 첨가 인산완충용액(0.1M PBS)에 24시간 세정하였다. 조직절편은 OCT compound에 포매하여 동결시키고, cryostat로 20μm 두께의 연속 냉동절편을 제작하여 gelatin coated slide에 올려 냉동보관하였다.
2. 면역조직화학적 염색
냉동절편을 실온에서 건조시켜 PBS로 세정한 후, 항체 투과성을 증가시키기위하여 10%, 25%, 그리고 50% ethanol에 각각 2분동안씩 탈수와 함수과정을 거쳤다. 조직절편을 1차 증류수로 1분간 세정한 후, 0.5% periodic acid에 실온에서 10분간 처리하여 내인성 peroxidase의 활성을 억제시켰다. 다시 1차 증류수로 1분간 세정하고 PBS에 5분간씩 3회 세정한 후 정상혈청용액(3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin)에 실온에서 3시간 처리하였다. 이어서 희석한 1차항체(1：16,000 rabbit anti-VIP serum, Chemicon)에 실온에서 15시간이상 반응시켰다. PBS로 5분간 6회 세정한 후, 2차항체(biotinylated anti-rabbit goat IgG in 3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin in PBS)에 실온에서 1시간 처리하였다. 다시 PBS로 6회 세정한 후, avidin-biotin-complex(Vectastain ABC reagent(r), Vector)에 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS로 5분간씩 6회 세정한 후, 기질액(0,025% diaminobenzidine, 0,04% nickel chloride, 0,03% hydrogen peroxidase in PBS) 내에서 4분간 정색반응시켰다. 조직절편을 PBS로 5분간씩 6회 세정한 후, 4℃에서 24시간 이 용액에서 세정하였다.
양성대조군으로 십이지장 근위부를 사용하였으며, 음성대조군으로 1차 항체를 첨가하지 않은 각 조직의 절편을 사용하였다.
3. 면역전자현미경적 염색
표본의 제작은 전포매법(pre-embedding method)을 적용하였다. 면역조직화학적 염색법으로 처리하여 VIP 함유 신경섬유를 정색시킨 후, 표본절편의 검색상 그 염색의 정도가 양호하다고 판단된 절편들을 1% osmium tetroxide에 1시간 동안 후고정(post-fixation)하였다. 이 조직을 60% ethanol로 10분, 70% ethanol로 10분, 80% ethanol로 10분, 90% ethanol로 10분, 95% ethanol로 10분, 그리고 absolute ethanol로 10분간 2회 탈수시켰다. 이렇게 탈수시킨 조직을 epoxy 수지(Epon 812)에 60℃에서 2일간 중합반응시켜 포매하였다. 포매된 절편을 광학현미경으로 관찰하여 VIP 함유 신경이 많이 분포하는 비선을 찾아 삭정한 후 Ultracut-E(r)(Reichert-Jung, Germany)을 사용하여 70nm 두께의 초박절편(ultrathin section)을 제작하였다. 초박절편은 투과전자현미경(Hitachi, H-600, Japan)으로 75KV에서 관찰하고 다시 uranyl acetate에 20분간, lead citrate에 10분간 전자염색한 후 재관찰하였다.
결과
표본절편의 광학현미경하 관찰에서는 VIP 양성 면역반응을 보이는 신경섬유가 비선내와 비선주위, 분비관주위, 그리고 소혈관, 특히 sinusoids의 벽을 따라 분포하고 있음을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
투과전자현미경하 관찰에서는 VIP 양성 면역반응을 보이는 신경종말은 선방(acinus)의 기저막 및 선방세포들간의 세포간극(intercellular space)을 따라 분포하였으며 근상피세포(myoepithelial cell)의 기저막과 분비관의 기저막을 따라서 분포하였다(Fig. 2-4). 신경종말과 접하고 있는 선방세포들은 원형의 핵, 과립상 소포체 및 핵상 분비과립(supranuclear secretory granule)들을 가진 전형적 장액성 세포였으며, 인접 선방세포와는 그 세포막이 특징적으로 상호 감입교합(interdigitation)하고 있었다. 과립성 응집상을 보이는 VIP 양성 면역반응산물은 소포(vesicle)들을 가진 신경종말내에 국한되어 존재함이 관찰되었다(Fig. 5).
고안
비선에 분포하는 신경지배에 관한 미세형태학적 연구는 아직 초보적인 단계이고 비알레르기 및 혈관운동성 비염에서 비선 과다분비기전에 관여하는 주요 신경 펩타이드는 VIP와 substance P 등이 보고되어 있다.9) 국내에서 비선내에 분포하는 신경지배에 대한 연구는 전 등2)이 substance P 함유 신경의 비선내 신경지배부위를 보고하였다. 그러나 VIP 함유 신경의 비선내 신경지배 부위를 밝힌 미세형태학적 연구결과는 아직 보고되지 않았다.
본 연구를 통하여 기니픽에는 VIP 함유 신경종말이 선방의 기저막, 선방세포들간의 세포간극, 그리고 근상피세포의 기저막과 분비관의 기저막을 따라 분포하고 있음을 밝혔다. Yokoyama등20)의 보고에 의하면 기니픽 비선은 모두 장액선으로 구성되어있고, 비선의 선방세포는 인접한 선방세포와 그 세포막이 상호 감입교합하는 특징을 가졌으며 비선내 신경종말은 이 선방세포의 상호 감입교합된 세포질 돌기사이에 형성된 세포간극에서 관찰되고 신경종말내에는 여러가지 소포들이 관찰된다고 하였다. 본 연구에서 관찰한 VIP 함유 신경종말이 접하고있는 선방세포들은 접하고 있지 않는 선방세포들과의 형태학적 차이가 없는 일반적인 선방세포였으며, VIP 함유 신경종말의 분포양상은 Yokoyama등20)이 기술한 비선내 신경종말의 분포와 일치하였다.
면역전자현미경법은 감수성 즉 항원의 염색성을 높이면 조직의 미세구조가 잘 보존되지 않는 서로 상반되는 기술적 어려움이 있다. 항체의 투과성을 높이는 기법들로서는 triton X를 사용하거나 반복 동결 해동 기법(repetaed freeze and thawing method)16), 그리고 연속 탈수 및 함수 기법(serial dehydration and hydration method)1) 등이 제시되고 있다. Triton X를 사용하거나 반복 동결 해동 기법 등은 조직의 항체의 투과성을 증가시키는 반면 미세구조가 잘 보존되지않는 단점을 가지고 있다. 본 연구에서도 triton X와 반복 동결 해동 기법을 이용하여 보았으나 미세구조의 보존이 불량하여 채택하지 않았다. 따라서 본 실험에서는 연속 탈수 및 함수 기법을 사용하여 상대적으로 강한 염색성과 미세구조가 잘 보존된 결과를 얻을 수 있었다(Fig. 6). 그러나 전술한 항체의 투과성을 높이기 위한 세가지 기법을 사용하지 않은 면역전자현미경법은 염색성이 현저히 떨어져 본 실험에서는 채택하지 않았지만 미세구조의 보존은 가장 우수하였다(Fig. 7). 또한 조직내 침투성이 낮아 전포매법에서는 부적절한 것으로 되어 있는 ABC 법은 감수성이 뛰어나므로18) 항원성이 낮은 신경종말의 동정에는 오히려 유리할 수 있다고 사료된다.
선 분비기전에 있어 아세틸콜린은 주로 선방세포의 분비에 관여하고 VIP는 주로 선방주위의 혈관확장에 관여하는 것으로 알려져있다.9) 그러나 최근의 연구 결과들을 보면 호흡기에 있어 VIP가 염소 이온 수송을 촉진시키며 또한 점막하 선에서 cyclic AMP 형성을 촉진시킴으로써 선 분비기전에 직접적으로 관여한다고 보고되어 있다.3)13)19) 본 연구의 결과에서도 VIP 함유 신경종말이 선방 및 근상피세포의 기저막을 따라서 분포하고 선방 세포간극내에서 관찰되는것은 VIP가 선방세포의 분비에 직접적으로 작용할 것이라는 추측을 뒷받침해주는 형태학적 단서라 사료된다.
앞으로는 비점막의 혈관내 VIP 함유 신경지배부위를 밝히는 미세형태학적 연구도 이루어져야하며 이들은 비알레르기 및 비염에서 비즙과다분비기전을 밝히는데 필요한 형태학적 지견으로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
결론
ABC법과 전포매법을 이용한 면역전자현미경법으로 기니픽 비선내 VIP 신경지배의 부위를 관찰하였다. VIP 양성 면역반응을 보이는 신경종말은 선방의 기저막 및 선방세포간의 세포간극을 따라 분포하였으며 근상피세포의 기저막과 분비관의 기저막에서도 관찰되었다. 이와 같은 소견은 VIP가 비선 분비기전에 있어 직접적인 조절 기능을 갖고 있다는 형태학적 단서가 된다고 사료된다.
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