| Cytokeratin Expressions in Normal Nasal Mucosa, Nasal Polyps, Inverted Papilloma, and Squamous Cell Carcinoma Tissues. |
| Chul Hee Lee, Yang Gi Min, Kwang Hyun Kim, Kwan Taek Noh, Jin Young Kim, Chong Sun Kim, Kang Soo Lee, Chae Seo Rhee, Sang Jin Seo, Jae Koo Kang, Sung Ok Lee |
| Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Korea. |
| 정상 비점막, 비용, 반전성유두종 및 상악동암 조직에서 Cytokeratin 분포양상 |
| 이철희 · 민양기 · 김광현 · 노관택 · 김진영 · 김종선 · 이강수 · 이재서 · 서상진 · 강제구 · 이성옥 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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All epithelial cells express more than 2 cytokeratins, and their tissue distribution is determined by cellular types, location, and degree of differentiation. It is known that changes in cytokeratin expression accompany squamous metaplasia of the human nasal epithelium. We analysed cytokeratin expression patterns and their significance in normal nasal mucosae, nasal polyps, inverted papillomas, and maxillary squamous cell carcinomas using immunohistochemical staining with anti-CK4, CK8, CK10, CK13, CK17, CK18, and CK19. Nasal polyp showed the same pattern of cytokeratin expression as that of nasal mucosa. While CK10 expression was present only in the tissue of squamous cell carcinoma, CK18 and CK19 were not expressed. Specimens of Inverted papilloma expressed CK4 and CK13 only in the suprabasal layer, and CK17 in the basal and suprabasal layers. In contrast, normal epithelium expressed CK13 and CK17 only in the basal layer, and CK4 in the basal and suprabasal layers.
CK8 and CK18 were less expressed in the specimen of inverted papilloma than in the normal nasal mucosa. The expression patterns of CK10 and CK19 suggest that they may play a role in determinating the malignant change of inverted papilloma and in investigating the pathogenesis of inverted papilloma and maxillary cancer. |
| Keywords:
Squamous metaplasiaㆍCytokeratinㆍNasal polypㆍInverted papilloma |
서론
세포를 지지하는 세포골격은 액틴(actin)을 포함하는 미세필라멘트(microfilament), 튜부린(tubulin)을 포함하는 미세소관(microtubule), 그리고 중간필라멘트(intermediate filament) 등으로 구성된다. 중간필라멘트에는 상피세포에서 나타나는 cytokeratin(이하 CK), 간엽세포에서 나타나는 vimentin, 근세포의 desmin, 신경세포의 neurofilament, 성상세포의 glial filament 등이 있다. 이 중에서 산성과 중성 또는 알칼리성으로 분류할 수 있는 CK는 모든 상피세포의 가장 중요한 단백질 구조이며, 생화학적으로 그리고 면역학적으로 연관된 약 20개의 폴리펩티드로 이루어져 있다. 이러한 CK는 서로 다른 분자량과 isoelectric PH를 가지고 있다. 모든 상피는 최소한 2개 이상의 서로 다른 CK를 표현한다고 알려져 있으며, 그 조성은 상피의 종류, 위치, 세포종류, 분화단계에 따라 달라진다.9)18)22) 또한 각 상피는 CK에 의해 특징지어질 수 있고, 전체적인 CK의 구성은 형질이 전환된 후에도 변하지 않는다고 알려져 있다.9)12) 최근에는 많은 CK에 대하여 단클론성 항체들이 개발되어 상피세포에서의 CK 발현양상을 연구하는데 큰 도움이 되고 있다.
CK의 단클론성 항체들은 결정인자에 따라서, 세가지의 범주로 나눌 수 있다. 첫째로 여러 CK에 공통항원의 결정인자를 인지하는 단클론성 항체인데 이 항체들은 모든 상피세포들을 염색한다. 둘째 일부 CK에 공유되는 결정인자와 반응하는 단클론성 항체가 있다. 세번째 범주는 특정 CK 폴리펩티드에만 존재하는 결정인자와 반응하는 단클론성 항체이다. 현재에는 특정 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체가 상피세포와 종양세포의 세포형(cell type)을 결정하는데 중요한 역할을 하고 있다.21) 즉 특정 CK에 대한 단클론성 항체는 중층 또는 가중층 상피의 특징적인 CK를 전기영동으로 알아낼 수 없는 농도에서도 알아낼 수 있으며, 여러 상피세포로 이루어진 조직이나, 악성종양 조직에서 특정세포 집단을 인지할 수 있다.
이비인후과 영역에서 CK에 대한 연구는 주로 이과영역에서 이루어졌으며 특히 진주종 상피에서의 발현양상을 통해 진주종의 기전에 관해 이해하고자 하는 많은 연구가 있었다. 반면에 호흡상피 특히 비점막 상피에서의 CK의 발현 및 그 의미를 분석한 연구는 거의 없었다. 그 일부의 연구 중에는 호흡상피에서 CK의 종류에 따라 이 정점성(bimodality)이 존재한다는 보고가 있었으며10), 정상 비점막의 편평상피화생(squamous metaplasia)과정에서 CK의 종류에 따라 특징적인 분포양상을 보인다고 하였다.17)
본 연구에서는 정상 비점막 및 비점막에서 발생한 병적조직 중에서 비용, 반전성 유두종, 악성 상악동암 조직을 채취하여 이들 조직에서의 CK 분포양상과 비용, 반전성유두종, 편평상피암과 일반적인 편평상피화생 과정과의 연관성을 알아보고 특정한 CK의 사용이 세포단계에서 세포의 분화정도 및 조직의 기원을 예측하는데 도움이 될 수 있는지 알아보았다.
연구재료 및 방법
1. 조직 표본 채취
정상 비점막 조직은 비중격만곡증 환자중에서 비중격교정수술시 이학적 소견에 의해 정상적 비갑개의 소견을 보이는 10명의 하비갑개에서 채취하였다. 비용은 만성부비동염에 대한 부비동 내시경수술시 12명의 환자에서 채취하였고, 반전성유두종과 상악동암 조직은 각각 반전성유두종 환자 4명과 상악동암 환자 3명으로부터 수술시 채취하였다. 피부조직에서의 CK 발현양상은 중이염 수술시 환자의 이개 뒷쪽에서 채취하여 관찰하였다.
채취한 정상 비점막 10개, 비용 12개, 반전성유두종 4개, 상악동 편평상피암 3개의 조직에서 2개의 2×2 mm의 조직을 잘라내어 10% 포르말린에 고정 후 파라핀 블록을 만들었다.
2. 면역조직화학 염색
표본의 염색은 Avidin-biotin peroxidase complex(ABC)법을 이용하였다.
파라핀 포매 조직을 3∼5μm의 두께로 박절한 후 xylene으로 처리하여 파라핀을 제거하고 100%, 95%, 70% ethanol로 처리하여 재수화(rehydration) 시키고 증류수로 씻은 후에 pepsin으로 37 oC에서 5분간 처리하여 항원을 노출시켜 즉시 증류수와 PBS(phosphate buffered saline)용액으로 15분간 씻었다. 10 mM citric acid로 채워진 플라스틱 용기에 슬라이드를 넣고 5분씩 2번 microwave oven에서 처리하고 0.3% H 2O 2 로 10분간 처리하였다. LSAB(r) kit(DAKO, Glostrup, Denmark)에 들어있는 차단제(blocking agent)를 조직절편 위에 떨어뜨린 후 30분간 반응시켰다. 적절한 농도로 희석한 일차항체를 실온에서 2시간 반응시키고 완충용액으로 다시 15분간 씻었다. 2차항체(연결항체)를 30분간 반응시킨 후 ABC를 30분간 반응시키고 완충용액으로 15분간 씻었다. 기질발색제(substrate-chromogen) 용액을 슬라이드 조직 위에 떨어뜨려 3분간 반응시킨 후 증류수로 씻고 Meyer’s hematoxylin으로 대조염색을 시행하여 광학현미경(Laborlux K, Leica, Stgallen, Switzerland)하에서 관찰하였다. 염색할 때마다 음성대조군으로 일차항체 대신 완충용액으로 반응시켰다.
일차항체로는 CK4(Sigma, St. Louis, USA), CK8(Sigma, St. Louis, USA), CK10(DAKO, Glostrup, Denmark), CK13(Sigma, St. Louis, USA), CK17(DAKO, Glostrup, Denmark), CK18(Sigma, St. Louis, USA), CK19(DAKO, Glostrup, Denmark)에 대한 단클론성 항체를 사용하였다.
현미경 관찰은 상피세포에서 기저세포와 기저상층세포를 구분하여 관찰하였고 염색정도에 따라서 약양성(weak, ＋), 중등도(moderate, ＋＋), 강양성(strong, ＋＋＋)으로 구분하였다.
결과
각 표본에서의 면역조직화학 염색에 의한 CK의 분포는 다음과 같았다(Table 1).
1. 정상 비점막
CK13(Fig. 4A), CK17(Fig. 5A)은 특징적으로 상피층의 기저세포에 강하게 염색되었다. CK8(Fig. 2A-1, 2A-2), CK18(Fig. 6A-1, 6A-2)은 기저상층에 분포하였고 점막하 분비선의 상피세포에 특징적으로 강하게 염색되었다. CK4(Fig. 1A)는 상피 전층에 걸쳐 중등도로 염색되었고 CK19(Fig. 7A)도 상피전층에 걸쳐 염색되었으나 CK4보다 강한 염색성을 보였다. 또한 CK19는 분비선의 상피에도 강한 염색을 나타내었다. CK10 (Fig. 3A)은 상피세포에 염색되지 않았다.
2. 비용
CK13(Fig. 4B), CK17(Fig. 5B)은 비점막에서와 같이 기저층에 강하게 염색되었다. CK8(Fig. 2B), CK18(Fig. 6B)도 비점막에서와 같이 기저상층의 원주형 세포에 주로 분포하였고 염색강도에 있어서는 정상 비점막과 비교하여 차이가 없었다. CK4(Fig. 1B)는 상피 전층에 걸쳐 약하게 염색되었다. CK10(Fig. 3B)은 염색되지 않았다. CK19(Fig. 7B)는 정상 비점막에서와 같이 상피 전층에 염색이 되었으나 염색성은 정상 점막보다 약하였다.
3. 반전성유두종
CK17(Fig. 5C)은 유두종 상피 전층에 걸쳐 강한 염색을 보인 반면 CK4(Fig. 1C), CK13(Fig. 4C)은 기저 상층에서 강한 반응을 보였다. CK8(Fig. 2C) 및 CK18(Fig. 6C)은 기저상층에서 약한 염색을 보였고 CK10(Fig. 3C)은 염색되지 않았다. CK19(Fig. 7C)는 유두종 상피 전층에 중등도로 염색되었다.
4. 상악동 편평상피암
CK17(Fig. 5D)은 상피 전체에 걸쳐 강한 염색을 보인 반면 CK10(Fig. 3D)은 케라틴을 형성하는 상피조직에서만 강한 염색반응을 보였다. CK8(Fig. 2D), CK18(Fig. 6D)은 염색되지 않았다. CK19(Fig. 7D)도 상피세포에 염색되지 않았다.
5. 후이개표피
CK10은 기저상층에 고루 분포하였고, CK17은 상피의 전층에 걸쳐서 염색되었다. 반면 CK4, 8, 13, 18, 19는 분포하지 않았다.
고찰
CK4는 59kD의 분자량을 가지는 폴리펩티드로 본 연구에서 정상 비점막과 비용에서는 상피 전층에 약하게 염색된 반면 반전성유두종에서는 상피의 기저상층에 국한하여 강하게 염색되었다. CK4는 주로 비각화편평상피와 이행상피에 분포한다.21) Van Blitterswijk등20)과 Broekaert등2)은 CK4를 중이점막에서 관찰하였다고 보고하였으나 Vennix등23)과 Nagle등11)은 기관지의 섬모상피에 분포하는 CK4가 중이점막상피에는 나타나지 않는다고 보고하였다. Stosiek등17)은 비점막의 편평상피화생의 개념을 설명하면서 중층원주형상피 및 비각화중층상피의 기저상층에서 CK4의 발현이 증가됨을 보고하였다. 이는 본 연구에서 반전성유두종의 경우에 기저상층에 특징적으로 강한 염색을 보이는 것과 일치되는 소견이라 할 수 있다.
CK8과 18은 유사한 분포를 보이며9)17)20), 이는 주로 단순형상피에 특징적으로 분포하고7)13), 중층형상피에는 반응하지 않는 것으로 알려져 있다.22) 이는 기관지의 상피에 약하게 염색되는 것으로 알려져 있고21), Van Blitterswijk등20)은 중이 점막에 CK8, 18이 모두 존재한다고 보고하였으나, Broekaert등2)은 CK8은 중이 점막에 존재하지 않는다고 하였다. Stosiek등17)은 가중층원주상피의 원주형 세포에 염색되지만 기저세포에는 염색되지 않는다고 하였고 중층원주상피에서는 염색성이 약해진다고 보고하였다. 본 연구에서도 정상 비점막과 비용을 주로 구성하고 있는 가중층원주상피형에서 원주형세포 및 기저세포의 사이사이에 위치하는 세포발(foot process)에 염색되고 특히 점막하의 분비선 상피에 강하게 염색됨을 알 수 있었다. 그러나 중층형상피로 이루어진 반전성유두종이나 편평세포암에서는 아주 약한 염색을 보였다.
CK17과 CK10은 각화상피의 특징적인 CK로 Troyanovsky등19)은 CK17이 후두, 기관, 기관지와 같은 가중층상피의 기저층에 분포한다고 보고하였다. 또한 Stosiek등17)은 비점막의 편평상피화생과정에서 CK17의 발현은 어느정도 유지하는데 이는 호흡상피의 기저세포나 편평상피화가 진행된 후의 기저세포 모두 강한 발현을 보인다는 것을 의미함으로써 편평상피화 과정에서 기저세포가 중요한 역할을 함을 간접적으로 시사하는 소견이라고 하였다. 본 연구에서 비점막과 비용의 기저 상피에만 강한 염색을 보였고 반전성유두종 및 편평상피암에서는 상피 전층에 강한 염색을 보여 기저층에는 지속적으로 강하게 염색되는 소견이었다. CK10은 각화상피의 기저상층에 분포하며2)20)23), 각질의 형성이 왕성한 편평상피암에서 강하게 염색되었다.
CK13은 비각화중층상피에 특징적으로 반응하며 그 이외에 가중층원주상피의 기저층에 존재하지만 각화중층세포나 단순형상피에는 존재하지 않는다.4)5) Stosiek등17)은 가중층원주형상피 이후의 단계부터 CK13이 나타날 수 있다고 하였다. 본 연구에서는 비점막과 비용종에서 기저세포에 강한 염색을 보임으로써 Stosiek등의 연구에서 가중층상피의 기저상층에 약한 반응을 보인다는 소견과는 맞지 않으나, Huszar등5)과 Geiger등4)의 보고에서는 CK13과 16에 대한 복합형 항체인 K8.12를 사용하였을 때 가중층상피의 기저층에 염색된다는 것과 CK16이 중층상피에서 나타난다는 사실을 고려해 볼때 이들의 보고와는 일치된 소견이라 할 수 있다.
CK19는 단순형상피 및 중층상피의 기저층에 주로 분포하며2)3), 본 연구에서도 비점막 및 비용의 상피전층과 분비선 상피에 분포하였고 편평세포암에서는 분포하지 않았다.
CK4, 13은 중층편평상피의 주로 상층에 분포하였다. CK4는 반전성유두종의 기저세포에는 발현하지 않는 것으로 미루어 정상 및 비용종의 기저세포와는 다른 특성을 가지고 있고, 이것이 반전성유두종의 상피세포가 상피 아래쪽으로 침윤하는 특성과 관련이 있을 가능성이 있다. CK13은 비점막의 기저세포가 염색되는 양상에서 중층편평상피에서는 기저상층으로 이동하는 양상을 보임으로써 이는 병변이 기저세포로부터의 편평상피화생의 과정을 거쳐 진행하였을 가능성을 시사한다고 할 수 있다. 특히 편평세포암에서 기질로의 침윤이 강한 부분에서는 중층상피 형태가 무너짐으로써 상피내에서의 특징적인 염색양상도 나타내지 못하였다. 또한 CK13은 각질의 형성을 보이는 일부 피부조직에서는 발현되지 않는다.16) 따라서 종양조직이 비점막과 피부조직의 경계부위에 형성되어 있거나 광범위할 경우 조직의 기원을 예측하는데 어느정도 도움을 줄 수 있을 것이다.
CK8, 18은 가중층상피에서는 원주형세포에 주로 분포하며 중층상피형으로 갈수록 약한 반응을 보이므로 이는 세포단계에서 기저세포로부터의 중층상피화생을 뒷받침하는 소견이라고 볼 수 있다. 또한 반전성유두종과 상악동암에서는 상피세포의 기저상층세포가 CK8 및 CK18의 특성이 적거나 없는 세포로 구성되는데, 이는 반전성유두종이나 상악동암의 기저상층세포가 정상 조직의 기저상층세포와는 다른 특성을 가지고 있고 이것이 병변의 발생과 관련이 있을 가능성이 있다.
CK17은 비점막부터 편평상피암에 이르기까지 기저세포에는 지속적으로 강한 반응을 보이고 비점막에서 기저세포에서만 발현하였으나 중층상피로 갈수록 기저상층에도 분포함으로써 역시 기저세포에서의 중층상피화생 과정을 시사한다고 할 수 있다. CK17이 반전성유두종과 상악동암의 기저상층에 분포하였으나 정상 점막의 기저상층에는 분포하지 않는 것은 이들 병변의 기저상층세포가 정상의 그것과는 다른 특성을 보임을 의미한다.
CK13은 정상 비점막조직에서 기저층에 분포하였으나 반전성유두종에서는 기저상층에 분포하였고, CK17은 정상점막에서 기저세포에 분포하였으나 반전성유두종에서는 기저층 및 기저상층 세포 모두 분포하였고, CK4는 정상 점막에서 상피 전층에 분포하였으나 반전성유두종에서는 기저상층에 분포하고 CK8이나 18은 정상 점막에는 기저상층의 세포에 분포하였으나 반전성유두종에서는 기저상층에 약하게 분포하였다. 또한 그 반대의 결과를 보이는 경향은 없었다. 이상의 결과로 반전성유두종은 기저상층의 세포가 정상조직의 기저층의 세포로 구성되어있고 기저층 세포의 성질을 어느정도 가지고 있음을 시사한다. 또한 이것은 반전성유두종의 기저상층의 세포들도 덜 분화되고 증식하는 성향을 가지고 있음을 의미한다. 근본적으로 반전성유두종의 기저층 세포들은 정상조직의 그것과는 다른 특징, 예를 들어 덜 분화되고 증식하는 능력이 강한 세포로 구성되어 있음을 의미한다. 따라서 반전성유두종은 기저세포의 이상으로 출발하였을 가능성이 있다.
본 연구에서 CK19가 반전성유두종과 같은 중층상피에서 전층에 발현되고 CK4의 경우 가중층상피에서 기저세포에도 분포함은 다른 몇몇 보고2)17)와는 차이점이 있다. Sano등14)은 동일한 상피에서 같은 종류의 CK에 대한 발현에 차이가 날 수 있는 가능성에 대하여 언급하면서 몇 가지 점을 지적하였다. 첫째, 사용하는 항체의 상품명에 따라 반응성이 다를 수 있고 둘째, 채취한 조직의 상태에 따라 반응이 달라질 수 있고 세째로 CKepitope의 masking으로 위음성 반응이 나왔을 가능성이다. 또한 파라핀 포매시 발생하는 열로 인해 항원구조의 변성이 생길 수 있는 가능성도 있다.10)16) 실제로 이를 증명하기는 어려울 것이나 여러개의 조직에 대해서 동일한 결과가 나왔을 때는 위의 가능성들을 생각해 볼 수 있겠다. 본 연구에서의 펩신처리나 microwave oven에 처리한 것은 epitope의 발현을 증강시키기 위한 과정이다.
결론
반전성유두종과 상악동편평상피암의 기저세포 또는 기저상층세포는 정상 점막의 그것과는 다른 특성을 보이고 이러한 특성의 변화는 병변의 발생과 관련이 있을 가능성이 있다. CK10, 19는 반전성유두종과 상악동암에서 염색에 차이가 있으므로 반전성유두종의 악성변화에 대한 지표로 이용할 수 있는 가능성이 있다. 이러한 결과는 향후 반전성유두종 및 상악동 편평상피암의 병인 연구에 도움을 줄 것으로 생각된다.
또한 비점막과 비점막에서 기원한 병적조직에서 CK의 다양한 반응양상은 CK의 선택적 사용을 통해 세포단계에서의 분화정도 및 피부상피와 호흡상피의 경계에 있거나 조직의 기원을 알기 어려운 종양의 조직기원을 예측하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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