교신저자：조재식, 501-190 광주광역시 동구 학1동 8번지  전남대학교 의과대학 이비인후과학교실 
              전화：(062) 220-6771 · 전송：(062)228-7743 · E-mail：cjscyy@chonnam.ac.kr

서     론

   두경부에서 가장 많이 발생하는 편평세포암종은 병변이 진행됨에 따라 암소(cancer nest)를 형성하는 경향이 있으며 이를 둘러 싼 암소주위막이 파괴되면 종양세포가 세포외 기질의 혈관 및 림프관을 통해 전이가 일어나게 된다. 이 기저막은 특히 IV형 교원질, laminin 및 heparan sulfate, proteoglycan 등으로 구성되어 있는에 이중 IV형 교원질이 주요 골격을 형성하고 있다. 한편 세포외 기질을 파괴하는 효소로 cathepsin, urokinase-type plasminogen activator 및 metalloproteinase계의 효소 등이 알려져 있다.¹⁾²⁾ 이중 matrix metalloproteinase중 gelatinase계에 속하는 matrix metalloproteinase-2(이하 MMP-2), matrix metalloproteinase-9(이하 MMP-9)는 gelatin과 IV형 교원질을 파괴하여 종양 침습과 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 두경부편평세포암종에서 이런 MMP의 발현과 경부 림프절 전이사이에는 밀접한 연관이 있음이 여러 보고에서 증명되었다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   두경부 악성종양의 예후를 결정하는 여러 인자 중에서도 가장 중요한 것은 경부 림프절 전이이며 또한 피막외파급(extracapsular spread, ECS)이 있으면 예후가 더욱 나쁘다고 알려져 있다.⁶⁾⁷⁾⁸⁾ 경부 림프절 전이가 있더라도 종양세포가 림프절내에 국한된 경우는 경부청소술 등의 치료를 시행하면 예후가 비교적 좋으나 종양세포가 림프절의 피막을 뚫고 주위 연부조직으로 침범한 피막외 파급이 일어난 경우에는 수술후 경부 재발률이 높으며 원격전이도 잘 일어나서 예후가 나쁜것으로 보고되었다.⁶⁾⁹⁾ 전이 림프절에서 피막외 파급은 종양세포가 커감에 따라서 결국은 피막을 뚫고 주위조직으로 진행하므로 전이 림프절의 크기가 3 cm이상인 군에서 잘 일어난다고 받아들여져 왔으나 Annyas 등¹⁰⁾의 보고에 의하면 1 cm이하인 전이림프절에서도 23%에서 피막외 파급이 있는 것으로 보고되었다. 이는 전이 림프절 피막외 파급에 단순히 종양세포의 증가외에 다른 인자가 관여함을 시사하는 것을 의미하며 이러한 림프절의 피막외 파급에 관여하는 인자를 밝히는 것이 종양의 침습기전에 대한 이해와 더불어 향후 치료에 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 보인다. 이러한 관점에서 MMP-2, MMP-9이 전이된 림프절의 피막외 파급여부에 관여를 하고 있는지에 대해서는 아직까지 연구가 미미한 상태여서 그 관련성 여부를 밝혀 보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   전남대학교병원에서 1995년 1월부터 2000년 3월까지 두경부 편평세포암종으로 진단받고 수술적으로 원발소 제거 및 경부청소술을 시행받은 46명의 환자를 대상으로 하였다. 평균연령은 58.1세였으며 남녀비는 9：1이었으며 원발병소는 구강 11명, 비강 1명, 인두 13명, 후두 21명 등이었다. 미국암협회 분류기준(AJCC, 1997)에 따른 종양의 국소병기는 T1 10명, T2 11명, T3 16명, T4 9명이었으며 임상적 병기는 제 1 기 3명, 제 2 기 6명, 제 3 기 15명, 제 4 기 22명 등이었다.

방  법
   46예의 경부청소술을 통해 채취된 시료에서 수술이 종료된 후에 림프절만을 박리하였다. 경부림프절은 림프절의 위치를 표시하고 크기를 측정한 후에 파라핀 포매괴로 제작했다. 병리조직학적으로 전이가 있는지 여부를 판정하였으며 병리조직학적으로 림프절 전이가 확인된 림프절은 70개였으며 각각의 림프절에 대해 피막외 파급이 있는지 여부를 확인하였다.
   림프절의 크기는 가장 큰 직경을 측정하여 3 cm이상인 군과 3 cm미만인 군으로 구분하여 MMP-2, MMP-9의 발현 여부를 조사하였다. 원발병소 및 전이 림프절에서 MMP-2와 MMP-9의 발현여부는 면역조직학적 염색을 통하여 확인하였다. 그리하여 원발소의 MMP-2, MMP-9의 발현과 피막외 파급과의 상관관계, 전이림프절에서 MMP-2, MMP-9의 발현과 피막외 파급과의 상관관계, 그리고 전이 림프절의 크기에 따른 MMP-2, MMP-9의 발현과 피막외 파급과의 상관관계에 대해 조사하였다.

면역조직화학적 염색 및 양성 반응의 판정
   10% 중성 완충포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 포매괴를 5 μm 두께로 박절하여 Probe-on 슬라이드에 부착시켜 건조시킨 다음 염색에 사용하였다. 염색은 Probe-on 슬라이드를 맞대어 생기는 capillary gap action의 원리를 응용하여 개발된 Microprobe System(Fisher, Pittsburgh, USA)를 이용하였다.
   파라핀 절편이 부착된 슬라이드를 탈파라핀과 함수과정을 거쳐 내재성 과산화효소의 불활성화를 위하여 endoblocker에 5분간 부치시킨 후 완충액으로 세척하고 일차항체인 MMP-2을 30분간 부치시킨후 세척하였다. 동일한 방법으로 MMP-9은 60분간 부치시킨후 세척하였다. 일차항체로는 MMP-2(Neomarkers, MS-806-P1, 1：30), MMP-9(CHEMICON, 20070942, 1：300)을 사용하였다. 일차항체의 검출을 위한 이차항체는 biotinylated antimouse IgG(Sigma, St. Louis, USA)를 이용하여 7분간 작용시키고 검출계로는 Streptavidin-Horseradish Peroxidase(Research Genetics, Huntsville, USA)를 7분간 작용시키고 발색은 완충액으로 수세를 한 후 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC：Zymed, SanFrancisco, USA)를 7분간 작용시켜 적갈색이 양성반응이 나타나도록 하여 헤마톡실린으로 대조 염색을 시행한 후 양성반응을 관찰하였다. 염색의 전 과정에 있어서 부치온도는 45°C로 하였다.
   면역조직화학적 염색을 시행한 슬라이드를 광학현미경하에서 검색하여 종양세포의 세포질에 희미하거나 또는 강하게 발현되는 경우를 모두 양성으로 판정하였고, 일차항체로 처리하지 않은 음성대조군과 같이 염색이 전혀 되지 않은 경우를 음성으로 판정하였다(Figs. 1 and 2).

통계학적 분석
   각 군의 변수를 Chi-square test로 분석하고 p값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.

결     과

원발소에서의 MMP-2, MMP-9의 발현과 림프절 전이
   총 46예중 원발소에서의 MMP-2의 양성 발현률은 71%(32/46)이었다.
   원발소의 MMP-2의 발현은 술후 병리조직학적으로 경부 림프절 전이가 없는 것으로 확인된 12예중 4예(33%)에서 양성반응으로 관찰되었고, 림프절전이가 있는 34예중 28예(82%)에서 양성으로 관찰되어 원발소에서 MMP-2가 발현된 군에서 발현되지 않는 군에 비해 림프절전이가 잘 일어나는 것으로 나타났다(p＝0.006).
   또한 원발소에서의 MMP-9의 양성 발현률은 60%(27/46)이었으며 경부림프절 전이가 없는 12예중 2예(17%)에서 양성반응으로 관찰되었고, 림프절 전이가 있는 34예중 25예(73%)에서 양성으로 관찰되어 원발소에서 MMP-9이 발현된 군에서 발현되지 않는 군에 비해 림프절전이가 잘 일어나는 것으로 나타났다(p＝0.04)(Table 1).

전이 림프절의 크기와 피막외 파급
   병리조직학적으로 확인된 70개의 전이 림프절 중 3 cm이상의 림프절은 12개, 3 cm미만의 림프절은 58개였다.
   전이 림프절 중 피막외 파급이 병리조직학적으로 증명된 것은 19개로 이 중 3 cm이상은 5개, 3cm미만은 14개 림프절이었다.
   3 cm이상의 림프절 중 42%(5/12), 3 cm미만의 림프절 중 24%(14/58)에서 피막외 파급이 증명되어 전이림프절의 크기가 3 cm이상인 경우가 3 cm미만인 경우보다 피막외 파급이 많았지만 통계학적으로 유의하지는 않았다(p＝0.220).

원발소에서의 MMP-2, MMP-9의 발현과 전이 림프절 피막외 파급과의 연관성
   원발소의 MMP-2가 양성인 군에서 전이림프절의 피막외 파급은 28%(12/42)이었고 MMP-2 음성인 군에서는 피막외 파급이 25%(7/28)이어서 연관성은 없었다(p＝0.742).
   원발소의 MMP-9이 양성인 군에서 전이림프절의 피막외 파급은 33%(10/31), MMP-9 음성인 군에서는 피막외 파급이 25%(9/39)에서 있어서 통계학적으로 연관성은 없었다(p＝0.391)(Table 2).

전이림프절에서의 MMP-2, MMP-9의 발현과 전이림프절 피막외 파급과의 연관성
   피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 53%(10/19)이며, 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 27%(14/51)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2발현율이 통계학적으로 유의하게 높았다(p＝0.048).
   피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 47%(9/19)이며 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 20%(10/51)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9의 발현율이 통계학적으로 유의하게 높았다(p＝0.020)(Table 3).

전이 림프절중 최대직경이 3 cm미만인 림프절만을 대상으로 하였을 때(n＝58)
   피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 50%(7/14)이며 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 27%(12/44)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2발현율이 통계학적으로 유의하게 높았다(p＝0.02).
   또한 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 43%(6/14)이며 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 18%(8/44)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9발현율이 통계학적으로 유의하게 높았다(p＝0.03)(Table 4).

전이 림프절 중 최대직경이 3 cm이상인 림프절만을 대상으로 하였을 때(n＝12)
   피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 60%(3/5)이며 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-2의 양성발현율은 29%(2/7)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-2발현율이 높았지만 통계학적으로 유의하지는 않았다(p＝0.32).
   또한 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 60%(3/5)이며 피막외 파급이 없는 전이 림프절에서의 MMP-9의 양성발현율은 29%(2/7)로 피막외 파급이 있는 전이 림프절에서의 MMP-9발현율이 높았지만 통계학적으로 유의하지는 않았다(p＝0.32).

고     찰

   세포외 기질, 기저막의 분해가 종양세포의 침윤 및 전이과정에 매우 중요하며 이런 기저막 및 세포외 기질의 분해를 위해서는 특이한 단백분해효소가 필요하다. 이런 단백분해효소에는 serine protease, cysteine protease, metalloproteinase 등이 있고 최근 수년간 metalloproteinases에 대한 관심이 증대되어 왔다.¹⁾²⁾ 이 효소는 현재까지 최소 17가지 종류가 알려졌으며 collagenase, gelatinase, stromelysins, membrane-type MMP 등으로 분류된다.¹⁾²⁾ 이 중 Gelatinase계에 속하는 MMP-2, MMP-9은 교원질 원섬유와 기저막의 제 4 형 교원질을 분해시켜 종양의 침습기전에 가장 중요한 단백분해효소로 알려져 있다.¹⁾
   이들 MMP는 전구상태로 분비되며 활성화되기 위해서는 단백분해과정이 필요한 데 MMP 활성의 발현은 유전자 전사의 과정, 활성 전구상태에서 활성화, 특이 tissue inhibitor(TIMP) 등 여러 단계에서 조절되며 이 MMP와 TIMP(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases)의 국소에서의 균형(local balance)이 종양의 침윤 및 전이에 중요한 인자인 것으로 알려져 있다.¹⁾¹¹⁾
   현재까지 MMP-2, MMP-9의 발현이 증가함에 따라 종양의 침윤 및 전이가 증가하며 이 효소의 활성을 억제시킴으로써 종양의 침윤 및 전이를 감소시킬 수 있는 것으로 보고되었다.¹³⁾¹⁴⁾ Kurahara 등³⁾은 면역조직화학적 염색을 시행하여 MMP-1, 2, 9의 발현이 높게 나온 경우 세포외 기질의 염색이 감소함을 보고했으며 전이된 환자의 경우 MMP-1, 2, 3, 9 등의 발현이 높옴을 보고하였다. Kawamata 등⁴⁾은 rat의 방광종양세포를 이용한 실험에서 MMP들(특히 MMP-2)의 발현이 림프절 전이와 연관이 있고, 원격전이장소에서의 종양세포의 혈관외 유출이 증가한다고 보고하였다. 본 연구결과에서도 경부 림프절 전이가 있는 경우 원발소의 MMP발현률이 높은 것으로 나타났으며 이러한 결과는 최근 여러 연구자에 의한 연구 결과가 일치한다.^5)11)12) 두경부종양에 있어 림프절 전이는 예후에 중요한 인자로 잘 알려져 있으나 단순히 림프절 전이 유무이외에도 전이 림프절의 피막외 파급유무가 예후에 매우 중요한 인자임이 보고되었다.^6)7)8)9)15) Johnson 등⁶⁾이 177명을 근치적 경부청소술후 후향적으로 분석한 결과 경부 림프절 전이가 있더라도 림프절 전이가 림프절내에 한정된 군은 조직학적으로 림프절 전이가 없었던 군과 생존률이 차이가 없는 것을 보고하였고 Myers 등¹⁵⁾도 경부전이가 없었던 군과 전이가 있더라도 림프절 내에 국한된 경우는 5년 생존률이 각각 75%, 50%이며 전이 림프절의 피막외 파급이 있는 경우 5년생존률이 30%이며, 전이 림프절내 피막외 파급이 있었던 경우에서는 경부 전이 및 원격전이율이 피막외 파급이 없었던 경우에 비해 높음을 보고하였다.
   또한 Kalnins 등¹⁶⁾은 피막외 파급여부는 전이 림프절의 크기와 연관되어 있음을 보고하였고 Annyas 등¹⁰⁾도 림프절의 크기가 1 cm이하인 경우 23%에서 피막외 파급이 있고 3 cm이상인 경우 74%에서 피막외 파급이 있어 림프절의 크기가 증가할수록 피막외 파급이 잘 되는 것을 보고하였다. 본 연구에서도 림프절의 크기가 3 cm이상인 군에서는 42%에서, 3 cm미만인 군에서는 24%에서 피막외 파급이 있는 것으로 나타나 림프절의 크기가 클 수록 피막외 파급이 잘 일어나는 것으로 나타났지만 증례수가 제한되어 있고 통계학적으로 유의하지는 않아 더 많은 증례수를 대상으로 한 연구가 필요하다. 하지만 본 연구결과에서 나타났듯이 3 cm미만일지라도 24%에서 피막외 파급이 있고 Johnson 등⁶⁾의 보고에서도 3 cm이하 림프절의 65%에서 피막외 파급이 있어 전이 림프절이 피막외 파급을 일으키는 데 있어서 림프절 크기로 나타나는 림프절내 종양세포의 양적인 증가이외에 비록 전이림프절의 크기가 작더라도 림프절내에서 피막외 파급을 일으키는 생화학적 변화가 있을 것으로 추정되어 세포외 기질을 분해하여 종양의 침윤, 전이와 연관되 있는 것으로 알려진 MMPs의 발현과 특히 3 cm미만인 전이 림프절에서의 피막외 파급과의 상관성을 조사해 보았다. 본 연구결과 원발소의 MMP-2, MMP-9 발현과 전이 림프절의 피막외 파급과는 유의한 상관관계가 없었으며 전이림프절의 MMP-2, MMP-9의 발현과 전이림프절 피막외 파급은 유의한 상관관계가 있음을 알 수 있었다.
   특히 3 cm미만의 전이림프절에서도 피막외 파급이 있는 림프절은 MMP발현이 잘 일어나는 것으로 나타났다. 본 연구에서 피막외 파급이 전이 림프절의 MMP의 발현과는 상관관계가 있지만 원발소의 MMP발현과는 연관성을 찾을 수 없었던 점은 단백효소인 MMP가 paracrine방식으로 인접한 조직에 영향을 미치기 때문인 것으로 단순하게 해석할 수도 있겠지만 종양의 침윤 및 전이과정에는 MMP같은 단백분해효소의 단순한 양 뿐만이 아니라 그 억제 효소와의 상호작용 및 국소에서의 균형(local balance)이 중요한 인자이며 MMP를 포함한 여러 세포외 기질분해효소들의 종양의 침윤 및 전이과정에서의 역할이 상세하게 밝혀져 있지 않아서 그 결과에 대한 해석은 쉽게 내릴 수 없을 것으로 사료된다. 또한 MMP이외에도 피막외 파급유무에 영향을 미칠 수 있는 다른 인자들 예를 들면 종양 원발소의 위치, 종양의 병기, N병기, T병기 등과 다변량 분석이 필요하지만 피막외 파급이 증명된 림프절의 수가 적어 다변량 분석를 시행하지 못한 점이 있으며 추후 더 많은 증례를 대상으로 한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   두경부 편평세포암종으로 진단받고 수술적으로 원발소 제거 및 경부청소술을 시행받은 46명의 환자를 대상으로 면역조직화학적으로 원발소 및 전이 림프절의 MMP-2,-9의 발현과 전이 림프절의 피막외 파급과의 연관성을 규명해 보고자 본 연구를 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
   원발소에서 MMP-2,-9이 발현된 군에서 림프절 전이가 잘 일어났다. 원발소의 MMP-2,-9의 발현과 전이 림프절의 피막외 파급간에는 유의한 상관관계가 없었다. 전이 림프절의 MMP-2,-9의 발현과 전이림프절의 피막외 파급간에는 유의한 상관관계가 있었다. 특히 전이 림프절의 크기가 3 cm미만의 림프절에서도 유의한 상관관계가 있었다.
   본 연구결과 MMP-2,-9의 발현이 림프절 전이뿐만 아니라 피막외 파급과도 상관관계가 있으며 종양의 침윤 및 전이과정과 밀접한 연관이 있는 것으로 사료된다.

1. Mignatti P, Rifkin DB. Biology and Biochemistry of Proteinase in Tumor Invasion. Physiol Rev 1993;73:161-87.

2. Liotta LA. Tumor invasion and metastasis; role of the extracellular matrix. Cancer research 1986;46:1-7.

3. Kurahara S, Shinohara M, Ikebe T, Nakamura S, Beppu M, Hiraki A, et al. Expression of MMPs, MT-MMP and TIMPs in squamous cell carcinoma of the oral cavity: correlations with tumor invasion and metastasis. Head & Neck 1999;21:627-38.

4. Kawamata H, Nakashiro K, Uchida D, Harada K, Yoshida H, Sato M. Possible contribution of active MMP2 to lymph-node metastasis and secreted cathepsin L to bone invasion of newly established human oral squamous cancer cell lines. Int J Cancer 1997;70:120-27.

5. Kim SH, Cho JS, Lim SC, Baik J, Park CS. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 in the cervical lymph node metastasis of the head and neck squamous cell carcinoma; a clinicopathologic study. Korean J Otolaryngol 1998;41:1041-6.

6. Johoson JT, Myers EN, Bedetti CD, Barnes EL, Schramm VL, Thearle PB. Cervical lymph node metastasis: incidence and implications of extracapsular carcinoma. Arch Otolaryngol 1985;111:534-7.

7. Johnson JT, Barnes EL, Myers EN, Schramm VL, Borochovitz D, Sigler BA. The extracapsular spread of tumors in cervical node metastasis. Arch Otolaryngol 1981;107:725-9.

8. Hirabayashi H, Koshii K, Uno K, Ohgaki H, Nakasone Y, Fujisawa T, et al. Extracapsular spread of squamous cell carcinoma in neck lymph nodes: prognostic factor of laryngeal cancer. Laryngoscope 1991;101:502-6.

9. Snyderman NL, Johnson JT, Schramm VL, Myers EN, Bedetti CD. Extracapsular spread of carcinoma in cervical lymph nodes: impact upon survival in patients with carcinoma of the supraglottic larynx. Cancer 1985;56:1597-9.

10. Annyas A, Snow GB, Van Slooten EA. Prognostic factors of neck node metastasis: their impact on planning a treatment regimen. Presented at a meeting of the American Society of Head and Neck Surgeons, Los Angeles, April 6, 1979.

11. O-Charoenrat P, Rhys-Evans PH, Eccles SA. Expression of matrix metalloproteinase and their inhibitors correlates with invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2001;127:813-20.

12. Kawata R, Shimada T, Maruyama S, Hisa Y, Takenaka H, Murakami Y. Enhanced production of Matrix metalloproteinase-2 in human head and neck carcinomas is corrected with lymph node metastasis. Acta Otalaryngol 2002;122:101-6.

13. Polette M, Ckavel C, Muller D, Abecassis J, Binninger I, Birembaut P. Detection of mRNAs encoding collagenase 1 and stromelysin 2 in carcinomas of the head and neck by in situ hybridization. Invasion Metastasis 1991;11:79-83.

14. Alvarez OA, Carmichael DF, DeClerck YA. Inhibition of collagenolytic activity and metastasis of tumor cells by a recombinant human tissue inhibitor of metalloproteinases. J Natl Cancer Inst 1990;82:589-95.

15. Myers JN, Greenberg JS, Mo V, Roberts D. Extracapsular spread. a significant predictor of treatment failure patients with squamous cell carcinoma of the tongue. Cancer 2001;15:3030-6.

16. Kalnins IK, Leonard AG, Sako K, Razack MS, Shedd DP. Correlation between prognosis and degree of lymph node involvement in carcinoma of the oral cavity. Am J Surg 1997;134:450-4.