서     론

   사람의 정상 기도에는 호흡시 유입되는 먼지나 병적인 균들로부터 기도를 보호하는 점액섬모계가 있다. 그러나 천식, 만성 기관지염, 급·만성 비염 또는 낭성섬유증 등과 같은 질환에서는 배상세포의 수가 증가하고, 점막하선내의 점액세포들이 비후되어 점액의 과다분비를 일으키게 된다. 점액의 과다분비는 점액섬모계에 장애를 초래하여 유해한 세균들의 증식에 의한 조직의 손상을 유발한다.
   정상 기도에 존재하는 분비세포는 기도 상피층에 위치한 점액세포, 장액세포 및 Clara세포 등과 점막하선의 점액 및 장액세포 등이 있으나 질병이나 자극이 가해지는 상태에서는 몇 가지의 이행성 표현형(transitional phenotype) 등이 발견되기도 한다.¹⁾ 점액세포는 점액을 분비하고, 리소자임, 락토페린 또는 단백질분해효소 억제제 등과 같은 장액성 분비물들은 장액세포에서 분비된다.²⁾³⁾
   주된 점액 당단백질인 점액은 점액섬모계를 통한 사람의 기도 상피 보호 역할을 하며, 많은 폐질환과도 밀접한 관계를 가지고 있다. 기도 상피에서 확인된 여러 가지 사람 점액유전자가 성공적으로 분리 확인되면서 점액의 분자생물학적 조성이 밝혀지게 되었다.^4-5) 점액은 약 10~30 MDa정도의 크기를 가지고 있으며, 서로 이황화결합에 의해 연결된 구조로 되어있다.^1-3) 점액의 핵심 펩타이드는 중심부에 serine, threonine 및 proline이 풍부한 다양한 수의 반복되는 염기서열 부분을 가지고 있다.⁶⁾ 또한 점액은 핵심 펩타이드 주위에 무수한 당화를 이루고 있어서 기존의 연구방법으로는 한계점이 있었다. 그러나 최근, 사람에서 밝혀진 9가지의 점액유전자(MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8)중^4-5)7-12) MUC1, MUC2 및 MUC7은 완전한 유전자배열이 알려졌으나 나머지 6가지는 부분적으로만 배열순서가 알려져 있다. 각각의 점액유전자는 특이한 조직분포양상을 보이며, 특정조직에서는 한가지이상의 유전자가 발현된다.¹³⁾
   지금까지 많은 연구기관에서 기도분비물의 조절이 어떠한 기전에 의하여 이루어지는가를 밝히기 위하여 지속적인 노력을 기울이고 있으나 정확한 조절기전이 아직 명확하게 알려지지 않고 있으며, 더욱이 하기도 점액의 발현양상에 대한 연구와 비교하여 비강 및 부비동을 포함한 상기도에 대한 연구는 미흡한 실정이다.¹⁴⁾
   비용은 천식 및 알레르기 비염에 흔히 동반되며, 만성 부비동염을 유발하는 양성 종물이다. 비용이 동반된 만성 부비동염 환자에서 나타나는 점액성 비루는 대부분 비용이 상악동 및 사골동의 개구부를 폐쇄함으로서 부비동내에 염증이 유발되어 발생하는 것으로 생각되지만 각종 염증성 매개체에 노출되는 비용의 상피세포 자체도 어느 정도 분비물 증가에 기여할 가능성이 있다고 생각된다.
   이에 연구자는 사람의 정상 하비갑개 및 비용의 상피세포에서, 점액성 분비물의 표본으로써 점액과, 장액성 분비물의 표본으로써 리소자임의 양을 정량하고, 또한 이들의 mRNA에 어떠한 발현 차이가 있는지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

조직 표본 채취

   정상 조직으로는 각각 10명의 정상 성인 지원자 두군의 하비갑개로부터 긁어 채취한 상피세포를 모아 사용하였으며, 비용은 만성 부비동염으로 비용적출술 및 비내 사골동수술을 시행한 환자에서 채취하였다. 정상군은 비증상이나 비용, 또는 알레르기 증상이 없었으며, 지난 6개월간 흡연이나 스테로이드 호르몬제제, 항히스타민제 또는 점막수축제를 복용한 과거력이 없었다. 또한 대조군 6명의 비용을 동반한 만성부비동염 환자 역시 혈중 호산구수의 증가가 없었고, 총 혈청 면역글로불린 E는 정상범주이었으며, 방사알레르고소르벤트 시험와 피부반응검사상 음성을 보였다.

상피세포층의 분리

   비용은 즉시 1% pronase가 첨가된 이동용 배양액(DME：F12＝1：1)에 넣어 냉장 보관하였다. 16~18시간후 상층액을 조심스럽게 채취하였고, 적혈구, 섬유아세포 및 혈관내피세포 등을 제거하기 위해 플라스틱 용기에 평판한 후 37°C 배양기에서 1시간 처치하였으며 다시 상층액만을 채취한 후 원심분리기를 이용하여 상피세포만을 얻었다.

점액과 리소자임의 면역학적 검출 및 정량

   사람의 정상 하비갑개와 비용으로부터 효소를 이용하여 분리한 상피세포의 수를 센 후 세포여액으로 만들어 일정 세포수당 세포내의 점액과 리소자임 양을 정량하였다. 분리된 세포들을 1% Tween-20(Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 1 mM EDTA 및 protease inhibitors(Complete, Berhringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)가 첨가된 50 mM Tris buffered saline으로 세척하여 세포막을 파괴하고, 수초간의 초음파분해처리를 거친 후 Gray 등이 기술한 immunoblot assay를 이용하여 점액과 리소자임을 검출하였다.¹⁵⁾ 순수 인체점액(generous gift from Dr. Davis CW, University of North Carolina, NC, USA)과 리소자임(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 표준으로 사용하였으며, 점액은 단클론성 항점액항체 H6C5(a gift from Dr. C.W. Davis)를, 리소자임은 다클론성 항리소자임 항체(DAKO, Carpintera, CA, USA)를 이용하여 검출하였다. 세포에서 채취한 준비물과 표준들은 일정한 비율로 희석하여 니트로셀룰로스막에 이동시켜 일차항체와 반응시킨 후 horseradish peroxidase conjugated goat antimouse IgG 또는 antirabbit IgG에 반응시켰으며, chemilumi-nescence(ECL kit；Amersham, Bucking-hamshire, UK)로 발광시켰다. 이후 직선회귀분석을 이용하여 표준곡선을 그린 후, 각 검사물의 발색정도와 비교하여 정량하였다. 리소자임 항체의 특이성은 Western blot으로 검증하였다. 세포수는 세포들을 단세포로 만든 후 혈구계측기를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 평균±표준편차로서 나타냈으며, 통계처리는 student's t-test를 이용하였다.

점액과 리소자임 mRNA 검출을 위한 reverse transcription polymerase chain reaction

   Northern blot은 리소자임 mRNA의 발현을 확인하기에는 신뢰도가 낮으며, 점액유전자의 검출 역시 점액 메시지의 과다분산으로 인하여 정확한 결과를 얻을 수 없기 때문에 본 연구에서는 Guzman등이 기술한 방법에 따라 RT-PCR을 사용하였다.¹⁶⁾ Oligonucleotide primers는 MUC1 (Genbank accession #J05582, 388 bp, 5' primer：TCTCACCTCCTCCAATCAC；3' primer：GAAATGGCACATCACTCAC)；MUC2(Genbank accession #L21998, 440 bp, 5' primer：TGCCTGGCCCTGTCTTTG；3' primer：CAGCTCCAGCATGAGTGC)；MUC4(Genbank accession #AJ000281, 466 bp, 5' primer：TTCTAAGAACCACCAGACTCAGAGC；3' primer：GAGACACACCTGGAGAGAATGAGC), MUC5AC(Genbank accession #U06711, 680 bp, 5' primer：TCCGGCTCATCTTCTTCC；3' primer：ACTTGGGCACTGGTGCTG)；MUC5B(Genbank accession #Z72496, 338 bp, 5' primer：ACTCCAGAGACTGTCCACAC；3' primer：TACCACTGGTCTGTGTGCTA)；MUC7(Genbank accession #L132283, 209 bp, 5' primer：CCACACCTAATTCTTCCC；3' primer：CTATTGCTCCACCATGTC)；MUC8(Genbank accession #U14383, 239 bp, 5' primer：ACAGGGTTTCTCCTCATTG；3' primer：CGTTTATTCCAGCACTGTTC)；리소자임(Genbank accession #J03801, 350 bp, 5' primer：CTCTCATTGTTCTGGGGC；3' primer：ACGGACAACCCTCTTTGC)에 대하여 이미 발표된 염기배열을 이용하여 primer를 제작하였다(Table 1). RT-PCR의 조절유전자로는 335 bp의 β2 microglobulin(β2M) oligonucleotide amplimers(Clontech Laboratory, CA, USA)를 사용하였다. RT-PCR은 Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하여 시행하였으며, 간단히 방법을 소개하면 total RNA(1 μg/20 μl reaction volume)를 random hexanucleotide primers와 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 점액과 리소자임을 위해서는 역전사반응의 40%, β2M에는 4%를 사용해 각 0.2 mM의 프라이머를 이용해 증폭시켰다. PCR에서 염화마그네슘의 적당한 농도를 최적화한 후 변성은 95°C에서 1분간, 달굼온도는 MUC4, MUC7, MUC8 및 리소자임은 55C, MUC2, MUC5AC 및 β2M은 60°C에서 1분간, 신장은 72°C에서 1분간 시행하였다. PCR 산물은 50 ng/ml ethidium bromide를 함유하는 2% Seakem agarose gel(FMC, Rockland, ME, USA)에서 전기영동으로 분리하여 폴라로이드 55 필름으로 사진을 찍었다. 상기 기술된 각 배양조건에서 각 유전자의 mRNA 발현을 비교하기 위해 비교역학분석을 시행하였다. PCR의 직선범위는 PCR 횟수당 발현강도를 정량하여 정하였다. MUC2의 직선범위는 27~35회, MUC4는 27~40회, MUC5AC는 32~40회, MUC5B는 23~29회, MUC7과 MUC8은 32~40회, 리소자임은 25~30회, β2M은 26~30회에서 얻어졌다. 최종 산물이 mRNA로부터 생기고 genomic DNA의 오염이 없었다는 것을 증명하기 위해 RT 반응에서 reverse transcriptase를 생략함으로써 음성대조군으로 삼았으며, RT-PCR의 특이성은 PCR fragment의 sequencing(dsDNA Cycle Sequencing System, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA)으로 확인하였다.

결     과

세포내 점액 및 리소자임의 양

   비용의 상피세포 10⁶개당 세포내 평균 점액의 양은 2918.0 ±1931.9 μg으로 정상 하비갑개에서 채취한 상피세포 10⁶개당 세포내 평균 점액의 양인 1001.5±263.8 μg에 비하여 2.9배가 높은 것으로 나타나 의미있는 결과를 보였다(p<0.05)(Fig. 1). 그러나 세포내 평균 리소자임의 양은 비용의 상피세포 10⁶개당 56.6±28.1 μg으로 정상 하비갑개 상피세포의 34.4±20.3 μg에 비하여 의미 있는 차이는 없었다(Fig. 2).

점액과 리소자임 mRNA의 발현

   MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC8 및 리소자임 mRNA가 정상 하비갑개 및 비용의 상피세포에서 모두 발현되었다. 비용상피 세포에서는 대조군인 정상 하비갑개 상피세포에서 보다 MUC2 mRNA가 6례중 3례, MUC8 mRNA가 6례중 5례에서 현저하게 증가되어 있었다. 그러나 다른 점액유전자에서는 뚜렷한 차이는 관찰할 수 없었다(Fig. 3).

고     찰

   기도분비물은 크게 점액성과 장액성의 두 가지 구성요소로 나눌 수 있다. 점액은 대표적인 점액성 분비물로 점액성 과립으로 불리는 Periodic Acid-Schiff(PAS) 양성 과립들로부터 유래되는 것으로 생각되고 있다. 점액성 과립은 두 가지 다른 세포 군에서 발견되는데, 표피상피층의 배세포와 점막하선에 위치하는 점액세포들이다.¹⁾ 이 두 가지 세포들은 서로 다른 생리적 기전에 의하여 조절되며, 서로간의 점액분비에 대한 상관관계는 아직 확실하게 밝혀지지 않았다. 이와 반면에 장액세포들은 점액세포와는 분비물의 조성이 다른데 점액분비물에 비하여 탄수화물이 적고 씨알릭산이 적거나 거의 없으며, 정상적으로 리소자임, 락토페린, 분비성 면역글로불린 A, 알부민 및 글리코사미노글리칸 등을 분비한다.^17-19) 이러한 기도분비물들은 공기유입에 따른 이물질이나 인체에 유해한 미생물 등으로부터 기도를 보호하는 근본적인 역할을 한다. 기도로 유입된 이물질이나 유해한 미생물들은 기도점막에서 분비물에 싸여 섬모운동에 의한 점액 및 장액층의 이동을 따라 기도 외부로 배출된다. 그러나 만일 어떠한 생화학적 변화에 의하여 이러한 기도분비물들의 양이나 조성의 변화가 일어나고, 섬모운동의 장애가 동반되면 다양한 기도질환을 야기하게 된다.²⁰⁾
   점액 당단백질은 높은 분자량을 가진 복합당질로 점액 단백질의 척추구조에 수많은 올리고당류의 사슬을 가지고 있어서 전자현미경상으로는 약 200~1000 nm의 서로 다른 길이를 가진 긴 세사처럼 보인다.²¹⁾ 그러나 가장 독특한 점액의 구조적 특징은 역시 같은 배열을 가진 영역이 반복적으로 존재하는 것이다.²²⁾
   조직학적으로 비용의 표면 점막 상피층은 호흡기 상피와 유사한 형태이며 부분적인 편평상피화와 함께 점액 배세포 수의 증가 및 다양한 정도의 염증세포 침윤을 보이는 양성종물로 천식, 알레르기 진균성 부비동염, 만성 비염 및 부비동염, 낭성섬유증 등 매우 다양한 질환에서 관찰된다. 비용의 발생원인은 정확하게 밝혀지지 않았으나 유전적인 요인이나 만성적인 부비동의 염증 또는 비용 상피층의 과다한 나트륨 및 수분의 재흡수와도 관계가 있을 것으로 생각되고 있다. 비용을 동반하는 만성 부비동염에서는 비용이 상악동이나 사골동의 개구부를 폐쇄시켜 부비동내의 음압을 발생시키므로 점막으로부터 과다한 분비물이 분비되고 이것의 저류에 따른 이차적인 부비동염을 초래하지만, 지속되는 염증에 의하여 비용이 다양한 종류의 염증성 매개체에 노출되어 비용 상피세포도 과다한 분비물 증가에 기여할 가능성이 있다고 생각하였다.
   최근 점액유전자의 발견으로 다양한 기도상태에서 점액유전자의 발현에 대한 연구가 가속화되고는 있으나 아직 점액유전자의 정확한 역할은 확실하게 밝혀지지 않고 있다. 점액의 발현정도, 전사후나 해독후의 변형 및 서로 다른 점액간의 상호작용 등과 같은 점액 성질의 변화에 영향을 주는 몇 가지 요소들이 있을 것으로 생각되어지며, 또한 투과성, 항균작용 및 점도 등도 점액의 종류나 양에 의하여 영향을 받을 것으로 생각되고 있다.²³⁾ 그러므로 비강생리의 이해는 물론이고 사람의 기도에서 점액의 과다분비나 조성 변화 등과 동반되는 다양한 기도질환의 새로운 치료법 개발을 위하여 기도에서 발현되는 점액을 연구하는 것이 중요하다.
   본 연구에서는 10⁶개의 비용 상피세포당 점액성 분비물인 점액과 장액성 분비물인 리소자임의 세포내 양을 정량한 결과 사람의 정상 하비갑개 상피세포에 비하여 세포내 점액의 양이 2.9배의 뚜렷한 증가를 보였으나 장액성 분비물인 리소자임은 의미 있는 차이가 없었다. 이는 염증성 매개체에 의하여 점액성 분비물은 증가하나 장액성 분비물은 변화가 없다는 것을 의미한다. 만성 염증시 점액성 분비물의 증가는 분비물의 점도를 증가시키고, 점도 증가는 점액의 저류를 일으키며, 저류된 점액이 다시 염증을 초래하는 악순환이 반복되는 것으로 생각한다. 이러한 결과는 비용상피세포 자체가 만성 부비동염에서 점액의 분비증가에 일부 기여한다는 것을 의미한다. 다음 단계로, 증가된 비용 상피세포내의 점액이 과연 어떠한 점액유전자에 의하여 유발된 것인가를 알아보기 위하여 RT-PCR을 이용하여 비용 상피세포와 대조군인 사람의 정상 하비갑개 상피세포에서 점액유전자 및 리소자임 mRNA의 발현양상을 비교하였다.
   지금까지 비점막,⁶⁾²³⁾ 비점막 상피세포²⁴⁾ 또는 배양된 비점막 상피세포¹⁴⁾에서 점액유전자의 발현이 보고되어 있다. 특히 Aust 등은 in situ hybridization을 이용하여 비점막과 점막하 선조직에서 MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B 및 MUC7이 발현됨을 보고하였는데, 여러 상피 세포들에서 산발적으로 MUC1과 MUC4가 발현되는 반면, MUC2와 MUC5AC는 배세포에서만 발현되며, MUC5B와 MUC7은 점막하 선조직에서 주로 발현되는 유전자임을 보고하였다.¹⁶⁾ 그러나 본 연구의 결과에 따르면 두 군에서 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7 및 8의 발현이 확인되었으며, 그 중 MUC2와 MUC8이 대조군에 비하여 비용상피세포에서 강하게 발현되었으므로, 비용 상피세포에서 점액의 증가는 MUC2와 MUC8이 관여하고 있을 가능성을 의미한다. 비용 상피세포에서 MUC2 mRNA가 정상조직에 비하여 강하게 발현되는 것은, 염증유발 물질인 TNF-β가 MUC2 mRNA의 발현을 증가시킨다는 보고가 있어²⁵⁾ 비용 상피세포가 다양한 염증성 매개체에 노출되기 때문으로 생각된다. 또한 비용 상피세포에서 MUC8 mRNA의 증가는 임상질환에서 MUC8 mRNA가 증가될 수 있다는 매우 의미있는 결과로 사료된다. 그러나 아직 MUC8-특이적 항체가 없고 유전자 배열도 다 밝혀져 있지 않아 MUC8 mRNA의 정확한 기능은 알 수 없으나 향후 MUC8 mRNA의 조절기전과 MUC8 cDNA의 유전자배열을 밝히는 것이 중요할 것으로 생각한다.

결     론

   사람 정상 하비갑개와 비용조직으로부터 상피세포를 분리하여 두조직에서 10⁶개의 상피세포내에 점액과 리소자임의 양을 immunoblot으로 비교한 결과 비용 상피세포에서 점액의 양이 2.9배의 의미 있는 증가를 보였으나 장액성 분비물인 리소자임은 의미 있는 차이가 없었다. 이는 만성 염증성 매개체에 의해 점액성 분비물은 증가하나 장액성 분비물은 변화가 없다는 것을 의미하며, 비용 상피세포 자체가 만성 부비동염에서 점액성 분비물 증가에 일부 기여한다는 것을 의미하므로 다음 단계로 증가된 비용 상피세포내의 점액이 과연 어떠한 점액유전자에 의하여 유발된 것인가를 알아보기 위하여 RT-PCR을 이용하여 비용 상피세포와 대조군인 사람의 정상 하비갑개 상피세포에서 점액유전자 및 리소자임 mRNA의 발현양상을 비교한 결과 두조직에서 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7 및 8의 발현이 확인되었으며, 그 중 MUC2와 MUC8이 대조군에 비하여 비용상피세포에서 강하게 발현되었으므로, 비용 상피세포에서 점액의 증가는 MUC2와 MUC8이 관여하고 있을 가능성을 의미한다. 비용 상피세포에서 MUC2 mRNA가 정상조직에 비하여 강하게 발현되는 것은, 비용 상피세포가 다양한 염증성 매개체에 노출되기 때문으로 생각하며, 또한 MUC8 mRNA의 증가는 임상질환에서 MUC8 mRNA가 증가될 수 있다는 매우 의미있는 결과로 사료된다. 그러나 아직 MUC8-특이적 항체가 없고 유전자 배열도 다 밝혀져 있지 않아 MUC8 mRNA의 정확한 기능은 알 수 없으나 향후 MUC8 mRNA의 조절기전과 MUC8 cDNA의 유전자배열을 밝히는 것이 중요 할 것으로 생각한다.

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