서     론

   항균성 펩타이드는 동식물계에 널리 존재하고 있는 작은 단백질로 양이온을 띠고있으며 광범위한 항균력을 가지고 있다. Defensin은 다형핵 백혈구의 과립에서 처음 발견된 항균성 펩타이드의 일종으로 3.5~4.5 kD의 분자량을 가지고 있으며 그람 양성균과 그람 음성균에 대하여 광범위한 항균력을 가지고있다.^1-4) 또한 Defensin은 시스테인계의 위치와 이황화물의 결합에 따라 2종류, 즉 α-defensin과 β-defensin으로 나뉜다. 인체에서는 6 종류의 α-defensin이 알려져 있으며, 4가지(HD-1,-2,-3,-4)는 백혈구에서 발견되었고, 2가지(HD-5,-6)는 소장의 paneth cell에서 발견되었다.¹⁾²⁾⁵⁾ β-defensin중 human β defensin-1(hBD-1)은 말기 신장 질환 환자의 혈장 여과액에서 처음으로 추출된 후에 인체의 비뇨생식기와 폐의 점막상피에 내재되어 있는 것으로 알려져있다.^6-8) 항균력을 가지고 있는 hBD-1은 외부에 노출된 점막상피세포에 특이적으로 존재하고 있기 때문에 미생물로부터 상피와 점막표면을 보호하는데 기여하는 것으로 제시되어 왔다.
   비강점막은 호흡을 할 때 대기속에 부유하고 있는 다양한 화학물질, 생물학적 인자 그리고 물리적으로 유해한 환경물질들과 처음으로 접하는 부위이다. 비강점막은 병원체와 여러가지 잠재적 유해 물질이 대기환경으로부터 인체로 침투하는데 장벽의 역할을 제공한다. 비점막 방어기전은 상피세포, 점막하 분비선, 혈관, 그리고 점막에 있는 여러가지 염증세포에서 나오는 분비물과 분비물을 구성하고있는 단백질에 의하여 이루어진다.^9-11) 점막방어기능에 있어서 defensin의 중요한 역활에도 불구하고, 현재까지 인체의 비점막에서 hBD-1의 발현여부에 대한 연구는 거의 되어있지 않다.
   본 연구에서는 인체 비점막에서 hBD-1 mRNA의 발현과 분포를 역전사중합효소연쇄반응과 in situ hybridization 방법을 이용하여 관찰하였다.

재료와 방법

조직 준비

   비폐색으로 비중격성형술을 시행받은 5명의 환자와 융비술을 시행받은 4명의 환자로부터 하비갑개 조직을 채취하였다. 이 환자들은 모두 감염성 비질환, 알레르기, 흡연의 과거력이 없고 적어도 수술 3개월 전부터 약물복용을 하지않은 상태였다. 양성 대조군으로서 폐절제술시 얻은 기관지 점막을 사용하였다.
   수술시 채취한 하비갑개 조직을 두 부분으로 나누어 한 부분은 RNA 분리를 위해 액화질소로 얼린 후 ­70°C에 보관하였고, 다른 부분은 in situ hybridization을 위해 4°C의 4% 파라포름알데히드(pH 7.2)에 하룻밤 고정시키고, 70% ethanol로 탈수 후 파라핀블록을 제작하였다.

RNA 분리, 역전사중합효소연쇄반응과 probe 제조

   냉동된 조직(50~100 mg)을 1 ml의 TRIzol^® 시약(GI-BCO BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 균질화 시킨 후 acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction 방법으로 전체 RNA를 분리하였다.¹²⁾ 각각의 조직으로부터 추출한 전체 RNA를 2.5 U의 M-MLV reverse transcriptase(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)와 random hexanucleotide 50 pmol을 포함한 반응혼합물 20 μl와 42°C에서 60분간 역전사시켰다. 그리고 각각의 반응산물인 cDNA 1 μl를 0.125 U의 Taq DNA polymerase와 primer 12.5 pmol을 함유한 25 μl의 혼합물과 증폭시켰다. 중합효소연쇄반응에 사용한 oligonucleotide primer는 다음과 같이 합성하여 사용하였다：hBD-1 sense primer 5'-GACCACTATAACTGCGTCAGCAG-3'과 antisense primer 5'-AAAAAGTTCATTTCACTTCTGCGTC-3'(1~23과 134~158). cDNA를 94°C에서 1분간, 58°C에서 2분간, 72°C에서 3분간을 40회 반복하여 증폭시켰으며, 연쇄반응의 산물인 158염기쌍의 특이성은 예상되는 크기와 DNA염기배열순서(sequencing)에 의해 확인하였다. 역전사중합효소반응에서 hBD-1 primer 또는 역전사 효소를 생략한 경우를 음성대조군으로 하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응산물의 양적변화를 표준화(normalization)하기 위하여 glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase(G3PDH：502 bp)의 mRNA발현을 hBD-1 mRNA와 함께 확인하였다. 사용된 G3P-DH의 primer는 다음과 같다：sense(5'-ATCTTCCAGGAGCGAGATCC-3'), antisense(5'-ACCACTGACACGTTGGCAGT-3').
   cDNA 분절은 pCR II TOPO vector(Invitrogen Corp., Carlsbad, USA)에 subcloning하였다. RNA probe를 제작하기 위해 정제된 plasmid를 HindIII와 T7 polymerase promoter를 이용하여 in vitro transcription하여 antisense probe를 제작하였고, EcoRV와 SP6 promoter로부터 전사하여 sense probe를 제작하였다. 그후 Riboprobe Gemini II kit(Promega, Madison, Wisconsin, USA)를 이용하여(α^-35S) UTP(Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA)를 각각의 probe에 부착시켰다.

In situ hybridization
   In situ hybridization 단계는 Matsushita 등이 기술한 방법을 약간 변형하여 시행하였다.¹³⁾ 3-aminopropyl triethoxysilane으로 코팅한 유리슬라이드에 4 μm 두께의 조직절편을 부착시키고 1 μg/ml proteinase K로 37°C에서 40분, 0.25% acetic anhydride로 실온에서 10분간 처리하고, 2×sodium citrate buffer(SSC)에서 간단히 세척한 후, 점차적으로 상승계 에탄올로 탈수하고 공기중에서 건조하였다. 정제된 probe를 l×Denhart 용액, 50% deionized formamide, 0.3 M NaCl, 20 mM Tris, pH8.0, 5 mM EDTA, 0.5 mg/ml yeast tRNA, 80 μg/ml denatured salmon sperm DNA, 10 mM sodium phosphate, 10% dextran sulphate, 0.1 M dithiothreitol이 포함된 혼합용액에 12000~20000 cpm/μl 농도로 희석시키고 각각의 조직슬라이드에 probe가 포함된 hybridization 용액을 100 μl씩 점적하였다. 그 다음 슬라이드를 가습장치에서 50°C에서 48시간동안 hybridization하였다. Hybridization후 조직절편을 ribonuclease 용액과 농도가 감소하는 standard saline citrate에서 철저히 세척함으로써 비특이적 반응을 감소시켰다. 일부의 조직 절편을 hybridization하기 전에 ml당 RNase A 200 μg으로 37°C에서 1시간동안 처리함으로써 음성대조군으로 간주하였다. 반응이 끝난 조직슬라이드는 공기건조시킨 후 Kodak NTB 2 emulsion에 반응시켰다. 그후 실온에서 빛을 차단한 상자에서 수직으로 위치시켜 건조시킨 다음 흡수제를 넣은 차광상자에서 3주간 4°C에서 반응시켰다. 그리고 Kodak D-19 현상액으로 현상하고 Permount(Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ)로 봉입하여 광학 현미경(dark field)으로 관찰하였다.

결     과

   비중격성형술과 융비술시 채취한 모든 하비갑개 조직에서 G3PDH mRNA의 발현이 확인되었고, 각각의 표본에서 158 bp로 예상되는 크기를 갖는 전사체가 증폭되었다. 그리고 양성대조군으로 사용한 기관지 점막에서도 역시 158 bp로 예상되는 크기를 갖는 전사체가 증폭되었다(Fig. 1).
   in situ hybridization에 의해 분석된 hBD-1 mRNA는 조직절편을 antisense probe로 hybridization했을 때 hybridization signal은 하비갑개 점막의 상피층과 점막하 분비선에 국한되어 매우 풍부하게 발현하였다(Fig. 2A). Sense hBD-1 riboprobe(Fig. 2B)로 hybridization 시키거나 antisense probe(Data not shown)로 hybridization 하기전 RNase로 처리한 경우에는 signal이 관찰되지 않았다.

고     찰

   미생물의 비점막 침입시 상피세포와 그 분비물이 방어작용을 한다고 하는 것은 이미 잘 알려져있다. 인체의 비즙에는 점막 상피와 점막하 분비선으로부터 분비된 lysozyme, lactoferrin, secretory leukoprotease inhibitor, secretory IgA 등과 같은 많은 항균 물질이 존재하고 있으며, 이러한 물질들이 외부의 균들로부터 일차적으로 점막을 방어하고 있다.^9-11) 본 연구는 최근 발견된 항균성 물질인 hBD-1 mRNA가 인체의 비점막에서도 발현된다는 것을 제시하였다. 이러한 결과는 코로 흡입시 비점막을 경유하여 체내로 침입하는 여러가지 생물학적 인자를 제거하는데 hBD-1 이 작용할 수 있다는 가능성을 암시한다.
   In situ hybridization 결과 hBD-1 mRNA는 주로 하비갑개 점막의 상피층과 점막하 분비선에 분포하고 있다는 것이 관찰되었다. 이러한 소견은 폐, 요로생식기계, 구강점막, 타액선 등에서 발견된 것과 마찬가지로 대기속에 부유하고 있는 병원균에 의하여 지속적으로 자극받는 장기중의 하나인 인체 비점막의 상피층에 hBD-1 mRNA가 내재되어 있음으로써 역시 인체방어기전에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.^7)8)14) hBD-1이 기관점막조직과 일차배양된 기관지 상피세포에서는 발현되지만 기관지세척액에서는 발견되지 않았다.⁷⁾¹⁵⁾ 따라서 폐의 기관지점막의 방어기전에 있어서 hBD-1의 중요성을 이해하는데는 아직까지 미진한 부분이 남아있다. 인체의 비점막방어기전에 있어서 hBD-1의 기여를 평가하기 위해서는 이 물질이 비점막에서 분비된 비즙에서 검출되는지에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   Krisanaprakornkit 등¹⁶⁾은 정상 치은 점막과 염증성 치은 점막을 이용하여 중합효소연쇄반응으로 hBD-1 mRNA의 발현량을 분석했을 때 차이가 없었다고 하였고, 배양된 치은 상피세포를 cytokine이나 병원균으로 자극하였을 때에도 hBD-1 mRNA 발현이 증가하지 않았다고 하였다. 따라서 hBD-1은 염증반응시 조직에서 유발되어 양적변화를 일으키는 것이 아니고 조직내에 내재된 상태로 정상적인 치은 상태를 유지하는 역할을 할 것으로 제시되고 있다. 한편 점막조직에서 hBD-1의 항균 기능에 대한 간접적인 증거는 다음과 같은 연구결과로 알 수 있다. Nude mice의 피부에 이식한 상피세포를 이용한 연구에서 antisense oligonucleotide를 주입한 군에서 상피세포로부터 분비된 분비물의 항균작용이 억제되었으며, 낭포성 섬유증 환자에서 만성 세균성 감염이 있을 때 hBD-1 작용은 감소한다.¹⁷⁾ 시험관에서 hBD-1은 대장균에 대하여 항균 작용을 나타내었으며 이러한 실험결과는 이 펩타이드가 비뇨생식기계에서 점막방어 물질로 작용한다는 것을 시사한다.⁸⁾ 또한 유핵세포군에서 발현된 hBD-1은 대장균, 녹농균, 황색포도상구균에 대하여 항균작용을 보였으며, 그리고 아데노바이러스 접종시 유핵세포가 파괴되지 않았다.¹⁸⁾
   최근 연구에 의하면 비부비동염 환자의 비강 세척액에서 선분비 단백질인 lysozyme과 lactoferrin이 비정상적으로 증가되었으며, 이러한 결과는 만성 염증시 비점막으로부터 항균성 물질의 분비가 증가한다는 것을 제시한다.¹⁹⁾ 재발성 혹은 만성 부비동염을 가진 환자의 점막을 면역조직학적으로 분석하였을 때 lysozyme과 lactoferrin에 대한 양성반응이 역시 증가하였으며, 특히 배세포, 상피세포, 그리고 새로 형성된 비정형적인 형태를 띠는 분비선에서도 면역반응이 관찰된다.²⁰⁾ 반대로 Kurono 등²¹⁾이 보고한 바에 따르면 만성 부비동염 환자에서 비점막에 대한 S.pyogenes의 접착성이 유의하게 증가된 것을 볼 수 있었고 특히 M protein에 대한 secretary IgA의 활동도가 결핍된 경우 S.pyogenes의 접착성이 증가되었다고 한다. 이러한 연구결과에 따르면 항균성 물질의 분포나 활동도의 변화가 직접적인지 혹은 간접적인 영향에 의하여 발생하는지는 명확하지 않지만, 비점막의 상피세포에 대한 병원균의 친화도와 연관이 있는 것으로 생각된다. 그러므로 급성이나 만성 부비동염의 경우 hBD-1의 발현이나 활성도에 변화가 있는지 밝히는 것이 중요하다. 즉 hBD-1의 항균활성 기전의 이해와 급성 또는 만성 비부비동염에 따라 활성도가 어떻게 변하는가에 대한 연구가 앞으로 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   인체 하비갑개 점막에서 hBD-1 mRNA가 발현되었으며, in situ hybridization 방법으로 비점막의 상피층과 점막하분비선에서 발현되는 것을 발견하였다. 따라서 hBD-1이 인체의 비점막에서 비점막을 보호하는 방어역할을 한다고 생각된다.

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