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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(12): 1483-1489. |
| Expression of Inducible Nitric Oxide Synthase in the Experimental Otitis Media with Effusion. |
| Jun Myung Kang, Sang Won Yeo, Ki Hong Chang, Byung Do Suh |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. entkjm@cmc.cuk.ac.kr |
| 실험적 삼출성 중이염에서의 Inducible Nitric Oxide Synthase의 발현 |
| 강준명 · 여상원 · 장기홍 · 서병도 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
iNOSㆍ산화질소ㆍ면역 매개성ㆍ삼출성 중이염. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Ntric oxide (NO) is a short-lived biological mediator produced by diverse cell types, including inflammatory cells and epithelial cells. It may be cytotoxic to cells in high concentrations. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) expressed in macrophages produce large quantities of NO in response to inflammatory stimuli such as cytokines and lipopolysaccharide. NO is now considered to be a mediator of endotoxin induced middle ear effusion (MEE).
The author attempted to identify the expression of iNOS in immune mediated otitis media with effusion (OME).
MATERIALS AND METHOD:
Immune mediated OME was induced in rats, which were sensitized twice subcutaneously with KLH (keyhole lympet hemocyanine) and challenged with KLH into the middle ear 1 week later. We observed the development of MEE after 1, 3, 7 and 14 days following the challenge and measured nitrite (NO-2) and nitrate (NO - 3) in MEE which are oxidative product of NO. We utilized the RTPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) technique to evaluate the presence of iNOS mRNA in MEE. The immunohistochemical method was used to identify the expression of iNOS and infiltration of macrophage in middle ear mucosa.
RESULTS:
Serous MEE was developed at 3 days, and with time passed, it was changed to the mucoid type. Nitrite and nitrate were detected in MEE and iNOS mRNA was expressed in MEE. iNOS was expressed extensively with time and macrophages were diffusely infiltrated in middle ear mucosa.
CONCLUSION:
NO produced by the expressed iNOS may contribute to the development of OME, and we will be able to apply the role of iNOS and macrophage to research on pathogenesis and treatment of OME. |
| Keywords:
iNOSㆍNitric oxideㆍImmune-mediatedㆍOME |
서론
산화질소(nitric oxide；NO)는 대식세포, 호중구, Kupffer 세포, 성상세포, 미세아교세포, 관절연골세포 및 혈관평활근세포 등에서 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase：NOS)에 의해 L-arginine이라는 전구물질로부터 생성되며, 혈관의 이완, 혈압조절, 신경전달, 혈액응고, 염증반응 및 종양세포나 기생생물에 대한 숙주면역계의 방어기능 등 여러 가지 생리적 기능을 나타내고 고농도로 존재할 때 세포독성을 나타낸다.1)2)
NOS는 발현세포와 발현양상에 따라 neural NOS(nNOS), inducible NOS (iNOS), endothelial NOS(eNOS) 등으로 나누며3) 이중 유발형 산화질소 합성효소(inducible NOS：iNOS)가 삼출성 중이염의 병인에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.4) iNOS의 주된 발현세포인 대
식세포는 세포의 손상과 염증반응에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 특히 대식세포가 내독소(endotoxin)나 Tumor necrosis factor-α(TNF-α), Interleukin-1β(IL-1β) 및 Interferon-γ(IFN-γ) 등의 자극에 의해 활성화되면 iNOS 유전자가 발현되어 iNOS가 생성되며 이러한 iNOS에 의해 산화질소 및 그 산화물인 nitrite(NO - 2)와 nitrate(NO - 3)가 생성된다.5)6) 이러한 산화질소는 세포손상에 중요한 역할을 하며 최근 쥐에서 내독소로 유도된 실험적 삼출성 중이염에 NOS 길항제인 N G-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME)를 투여하여 염증이 감소함을 관찰함으로써4) 산화질소가 중이염의 발생에 중요한 매개물질로 여겨지고 있다.
저자들은 세포성 면역을 유발시키는 물질로 밝혀진 Keyhole Limpet Hemocyanine(KLH)를 이용하여 휜쥐에서 실험적으로 삼출성 중이염을 유발시켜 중이 저류액 내에서 산화질소 산화물인 nitrite(NO 2 -)와 nitrate(NO 3 -)를 측정하고 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 iNOS mRNA의 발현을 측정하였다. 또한 iNOS 및 대식세포에 대한 단클론항체를 이용한 면역조직화학적 방법으로 중이점막에서의 iNOS 발현 및 대식세포의 침윤을 관찰하여 삼출성 중이염의 발생과 진행에서 산화질소 및 iNOS의 역할과 iNOS 발현 세포중의 하나인 대식세포의 역할을 밝히고자 본 연구를 시행하였다.
재료 및 방법
재료
실험동물
체중 150 g 내외의 건강한 흰쥐를 사용하였으며 수술현미경 하에서 외이도 및 중이의 질환이 없음을 확인하였다. 수술시 마취제로 ketamine(30 mg/kg), xylazine(6 mg/kg)을 근육 주사하였으며 필요에 따라 유지량으로 최초 용량의 반을 추가 주사하였다. 전신감작 후 우측 고막을 통해 중이강 내에 KLH 를 추가 주입한 후 1, 3, 7, 14일이 경과한 흰쥐 각각 8마리씩 총 32마리를 실험군으로 하였으며, 좌측 귀의 중이강에는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS) 20 μl를 주입하여 우측 귀에 KLH를 주입한 것과 비교하였다. 2마리는 정상 대조군으로, KLH로 두 번에 걸친 전신감작 후 1, 3, 7, 14일이 경과한 흰쥐 각각 2마리씩 총 8마리를 전신감작 대조군으로 설정하였다.
항원(KLH)의 추출
KLH는 ammonium sulfate precipitate로써 Pacific Biomarine Laboratories(Venice, CA, USA)에서 구입하였다. KLH 현탁액을 투석막안에 넣고 인산 완충식염수 800 ml에 담근 후 4℃에서 48시간동안 방치하였다. 그 후 KLH 를 4℃에서 3,500 rpm으로 30분간 원심분리한 후 pellet은 폐기하고 상층액을 다시 36,000 rpm으로 2시간동안 원심분리시켰다. 침전된 pellet을 인산완충식염수에 녹인 후 4℃에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 정제된 KLH 항원으로 본 연구에 사용하였다. 상층액은 BCA protein assay kit(Pierce, USA)를 이용하여 농도를 측정한 후 실험에 사용할 때까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
방법
동물감작
전신감작은 KLH(20 mg / ml) 1 mg을 인산완충식염수 450 μl와 섞은 후 동량의 complete Freund's adjuvant로 유화시켜 흰쥐의 등에 피하 주사하였다. 2주 후 KLH(20 mg /ml) 1 mg과 인산완충식염수 450 μl를 섞은 후 동량의 incomplete Freund's adjuvant로 유화시켜 흰쥐의 등에 2차로 피하 주사하였다. 2차 전신감작 1주일 후에 KLH 400 μg을 수술현미경 하에서 glass micropipette을 이용하여 고막을 통해 우측 중이강 내로 주입하였고 좌측 중이강 내로는 인산완충식염수 20 μl를 주입하였으며 천공된 고막은 gelfoam 으로 막았다(Fig. 1).
중이저류액의 수집
마취상태에서 흰쥐의 후이개 부분을 절개하여 골포를 노출시킨 후 그 첨부에 작은 구멍을 뚫어 인슐린 주사기로 중이 저류액을 채취하였다. 그 다음 세포배양액(RPMI 1640, Grand Island, NY, USA) 0.1 ml로 중이강을 세척하여 하고실과 골포에 남아있는 중이 저류액을 채취하고 실험에 사용할 때까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
산화질소 산화물의 측정
Nitrite의 측정
중이 저류액을 동량의 10 mM Dithiothreitol(DTT)로 희석한 후 각각 400 μl씩 분주하고 Griess reagent을 이용하여 Diazo chromophobe가 생기는 것을 spectrophotometer(UV-240, Graphicord, Shimadzu, Japan)로 530, 540, 550 nm에서 absorbance를 측정하였다. Griess reagent로는 먼저 0.2 N Hcl 25 ml에 2% sulfanil amide(Sigma) 0.5 g을 녹인 용액을 각각 200 μl씩 넣고, 곧이어 증류수 25 ml에 0.8% N-(1-Naphthyl)- ethylenediamine(Sigma) 0.2 g을 녹인 용액을 각각 200 μl씩 넣은 후 10분간 방치하였다. Standard curve는 sodium nitrite(Sigma)를 0.1 μM 농도부터 1000 μM 농도까지 측정하여 linear regression analysis를 이용하여 만든 후 각 검사물의 absorbance와 비교하여 그 양을 정량하였다. 대조군으로 인산완충식염수를 이용하였고 통계학적 처리는 Student's t-test로 하였다.
Nitrite＋nitrate의 측정
Nitrate는 Aspergillus에서 얻은 0.1 U /ml의 nitrate reductase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 이용하여 nitrite로 환원시킨 뒤 Griess reaction을 이용하여 측정하였다. Nitrate reductase의 조효소로 50 μM NADPH(Calbiochem, Darmstadt, Germany)를 이용하여 2시간 동안 반응시켰다.
역전사 중합효소 연쇄반응
RNA분리 및 cDNA합성
수집된 중이 저류액 100∼300 μl를 RNA ZOL TM-B 용액(Bioteck Laboratory, Texas, USA) 1 ml로 균질화시킨 후 chloroform 200 μl로 처리하여 유기용매층의 DNA와 변성된 단백질을 제거하였다. 수용액층의 RNA는 동량의 isopropanol로 처리한 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전 회수하였다. 추출된 전체 RNA 5μl에 random hexamer(100 pmol/μl) 2 μl와 증류수 7.5 μl를 섞어 60℃에서 5분간 반응시킨 후 15 mM dNTP 2 μl, murine leukemia virus reverse transcriptase(Boehringer Mannheim, Germany) 20 U, RNase inhibitor(50 U/μl) 0.5 μl, 5X reverse transcription buffer 4 μl와 섞어 37℃에서 1시간, 70℃에서 10분간 반응시켰다.
중합효소 연쇄반응
iNOS의 sense primer의 염기서열은 5-CACAAGGCCACATCGGATTTC -3'로 antisense primer는 5-TGCATACCACTTCAACCCGAG-3'(size of PCR products：741 bp)이 되도록 하였고, β-actin의 sense primer의 염기서열은 5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'로 antisense primer는 5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'(size of PCR products：202 bp)이 되도록 각각의 primer를 (주) 바이오니아에 주문 제작하였다. PCR은 합성된 cDNA 2.5 μl에 15 mM dNTP 2.5 μl, paired primer(25 pmol/μl), Taq 중합효소(5 U/μl, Boehringer Mannheim, Germany) 0.5 μl, 10X PCR 완충액을 최종 50 μl되게 섞은 후 Thermal Cycler(Perkins-Elmer Corp, USA)을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 하여 총 30회 시행하였다. 0.5 μg/μl ethidium bromide를 혼합한 1X trisboric acid-EDTA(TBE) 완충액으로 1% agarose gel을 만든 후, PCR 반응물 7.5 μl와 100 base pair size marker 3 μl를 100 V 직류하에서 1시간 동안 전기영동한 후 260 nm 자외선하에서 사진으로 기록하였다. 음성 대조군으로 cDNA대신 증류수를 사용하였고 RT-PCR 산물은 PCR fragment의 sequencing(dsDNA Cycle Sequencing System, GIBCO BRL)에 의해 확인하였다.
면역조직화학염색
중이저류액을 수집한 후 4% paraformaldehyde(pH 7.4)로 심장관류를 통해 고정한 후 측두골을 절취하여 동일고정액으로 4℃에서 하룻밤 후고정하였다. 표본을 10% EDTA 용액에서 4주간 탈회한 후 30% sucrose에 하룻밤 담구어 cytoprotection하고 Cryotome(Shandon, USA)으로 9 μm 두께의 연속절편을 만들어 ProbeOn slide(Fisher Scientific, PA, USA)에 부착하였다. 연속절편을 단계적으로 농도를 낮춘 에탄올을 이용하여 함수화하고 증류수로 세척하였다. 3% H 2O 2-methanol 용액에 30분간 처리한 후 1% Triton X-100에 30분간 처리하였으며 희석된 정상 말 혈청과 1시간동안 반응시킨 다음 일차 항체로 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다. 인산완충식염수로 세척한 후 이차 항체인 biotinylated anti-mouse IgG(Vector Laboratories, USA)와 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며 avidinbiotin-peroxidase complex 용액(Vector Laboratories, USA)으로 2시간동안 반응시켰다. 발색제로는 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB；Sigma, St. Louis, USA)을 사용하였고 상온에서 3분간 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. Hematoxylin으로 대조염색을 한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 일차항체로는 항대식세포 단클론항체(Mouse antirat macrophage；Biosource, California, USA)와 항iNOS 단클론항체(Mouse antirat iNOS；Transduction Laboratories, Kenturky, USA)를 각각 1：500, 1：100으로 희석하여 사용하였다.
결과
중이저류액의 발생
전신감작 대조군과 실험군의 인산완충식염수를 주입한 중이강 내에는 모두 중이 저류액이 관찰되지 않았다. 중이강의 국소면역 후 1일째에는 중이 저류액이 관찰되지 않았고, 3일째에
는 8귀 중 8귀(100%)에서 장액성 중이 저류액이 관찰되었으며, 7일째와 14일째에는 8귀 모두에서 100% 점액성 중이 저류액이 관찰되었다.
산화질소 산화물 측정
중이 저류액이 관찰된 3일, 7일, 14일 군의 8귀 중 6귀의 중이 저류액에서 산화질소 산화물을 측정하였다. 장액성인 3일째의 중이 저류액은 90.6±10 μM로, 점액성인 7일째의 60±7 μM와 14일째의 67±6 μM 보다 높게 측정되었다(p<0.05)(Fig. 2).
iNOS에 대한 RT-PCR
중이 저류액이 관찰된 각군의 8귀 중 2귀씩 총 6귀에서 RT-PCR을 시행했으며 6귀 모두에서 iNOS mRNA 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
iNOS 및 대식세포의 면역조직화학염색
정상대조군, 전신감작 대조군 및 수술 대조군의 중이점막에서는 iNOS의 발현이 관찰되지 않았다. 국소면역 후 1일째에는 상피하층의 일부 염증세포 와 일부 상피세포에 발현되었으며 3일째에는 상피하층의 많은 염증세포와 많은 상피세포에 발현이 되었다. 7일째와 14일째에서는 3일째와 비슷한 양상을 나타냈지만 좀더 광범위한 발현양상을 나타내었다(Fig. 4). 대식세포는 1일째에 상피하 조직에 일부 국소적인 침윤을 나타내었으며, 3일째부터는 상피하 조직에 광범위한 침윤을 나타내었고 7일째와 14일째에는 비후된 상피하 조직에 좀더 심한 침윤 양상을 나타내었다(Fig. 5).
고찰
산화질소는 작고 비교적 불안정하며 독성이 있는 free radical 중의 하나로서 신경 전달, 혈압의 조절 및 혈소판 응집억제, 종양세포나 세포내 기생생물에 대한 숙주 면역계의 방어기능 및 체내의 염증반응 등에 관여하는 것이 알려져 있다.1)2) 감작된 동물의 대식세포는 많은 양의 nitrite나 nitrate를 생산할 뿐 아니라 정상 동물에서 얻은 대식세포 일지라도 시험관 내에서 내독소나 cytokine 등으로 자극하면 산화질소의 산화물들이 상층액에서 증가된다. 5)6) 최근에는 산화질소와 그 산화물들 및 반응성 산소대사물들이 여러 가지 염증성 조직손상 시에 손상반응의 매개물로서 중요성이 커지고 있으며 대식세포가 내독소나 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) 및 Interferon-γ(IFN-γ) 등의 자극에 의해 활성화되면 superoxide(O 2 -)와 과산화수소 등과 같은 반응성 산소대사물들(reactive oxygen species)을 분비하게 되는데, 이것들에 의해서 대식세포 활성화가 더욱 진행되고 미생물 살균효과와 세포용해기능 등을 나타낸다.7) 또한 자극된 대식세포에서는 산화질소합성이 증가하고 그 산화물인 nitrite와 nitrate도 증가되며, 반응성 산소 대사물인 superoxide와 산화질소가 반응하여 peroxynitrite(ONOO-)를 형성하는데8) 이것들이 단백질의 tyrosine기를 질소화(nitration)시키고 sulfahydryl기를 산화시키며 세포막 지질을 과산화시켜서 세포손상에 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다.9)10) 저농도의 산화질소에서는 대부분의 superoxide가 SOD(superoxide dismutase)와 반응하지만 iNOS의 발현에 의해 산화질소가 고농도로 존재하면 superoxide는 산화질소와 반응하여 강력한 산화제인 peroxynitrite를 형성하게 된다.10)
산화질소 합성효소(NOS)는 L-arginine을 전구물질로 이용하여 산화질소를 만들며 여러 다양한 세포에서 여러 가지 자극에 의해 발현되어서 산화질소를 생산하는데 각각의 세포마다 자극되는 시간과 신호전달체계 및 산화질소 생산양이 다르다.1)3) 예로 신경세포와 혈관내피세포는 calcium에 의존적인 cNOS(constitutive NOS)를 발현하여 자극에 대해 즉시 소량의 산화질소를 생산한다. 반면에 대식세포, 설치류의 EMT-6 선암세포, 간세포 및 활성화된 호중구 등에서는 여러 가지 cytokine과 내독소의 자극에 반응하여 iNOS(inducible NOS)를 발현하며 4~18시간의 지연기를 거쳐 많은 양의 산화질소를 생산한다.6)11) 최근 산화질소가 내독소로 유도된 실험적 삼출성 중이염의 중요한 매개물질이며 이러한 산화질소의 생성에 NOS중에도 iNOS가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.4) 중이염의 발생에서 산화질소가 고농도로 존재하여 세포독성을 나타내고 세포내 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)의 증가를 통한 혈관내피세포의 혈관외 유출, 호중구 이동 및 기도 상피세포의 점액분비를 자극함으로써 중이염을 매개하는 것으로 생각되고 있다.4)12)13)
정상 중이강내의 점막에는 림프조직이 없고, 상주하는 백혈구도 매우 적어 일차면역반응은 약하지만 감작된 숙주에서는 항원에 대한 면역반응이 활발하고 말초혈액으로부터 림프구의 유입도 잘 일어난다.14) 저자들은 세포성 면 역을 유발시키는 물질로 알려진 KLH를 이용하여15) 흰쥐에서 실험적으로 삼출성 중이염을 유발시켰다. 본 연구에서 KLH로 중이강의 국소면역 후 1일째에는 중이 저류액이 관찰되지 않았고 3일째에는 모든 귀에서 장액성 중이 저류액이 관찰되었으며, 7일째와 14일째에는 모든 귀에서 점액성 중이 저류액이 관찰되었다. 중이 저류액 내의 산화질소 산화물은 산화질소를 측정하는 유용한 방법중의 하나인16)17) Griess reagent를 이용하여 측정하였으며, 3일째의 장액성 중이 저류액은 90.6±10 μM로 점액성인 7일째의 60±7 μM와 14일째의 67±6 μM 보다 높게 측정되었고 이러한 농도는 cytokine 등으로 자극된 대식세포나 상피세포 배양액의 농도와 비슷하게 검출되어 iNOS 발현에 의한 산화질소 생성을 시사하였다.16)17) 장액성 중이 저류액이 점액성 보다 높게 측정된 이유는 알 수 없었으며 아마도 화학적으로 비교적 불안정한 산화질소 산화물이 시간이 지남에 따라 화학적인 반응으로 감소하는 것이 하나의 원인이 될 수 있으리라 생각된다. 중이 저류액에서 iNOS 유전자의 전사(transcription)과정을 확인하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. RT-PCR을 시행한 중이 저류액 6예 모두에서 iNOS mRNA의 발현을 확인 하였고 이러한 결과는 중이 저류액 내의 대식세포 및 활성화된 호중구 등과 같은 염증세포 내에 iNOS mRNA의 발현을 의미하며 이러한 iNOS의 발현이 중이 저류액 내의 산화질소 생성에 기여하리라 생각된다. 중이점막의 iNOS에 대한 면역조직화학적 염색에서 국소면역 후 1일째에는 상피하층의 일부 염증세포와 일부 상피세포에 발현되었으며 3일째에는 상피하층의 많은 염증세포와 많은 상피세포에 발현이 되었다. 7일째와 14일째에서는 3일째와 비슷한 양상을 나타냈지만 좀더 광범위한 양상을 나타내었다. iNOS가 3일째부터 광범위한 발현 양상을 나타낸 것은 대식세포의 침윤이 3일째부터 광범위한 침윤을 나타내고 실험적 삼출성 중이염에서 TNF-α와 같은 cytokine이 3일째부터 발현율이 높게 나왔다는 보고와15) 일치하고 있다. 만성비염 조직의 상피세포와 cytokine으로 자극된 기관지 상피 세포에서 iNOS가 발현되었다는 사실로 미루어 볼 때,16)18) 상피세포의 광범위한 iNOS발현은 활성화된 대식세포나 림프구에서 분비된 cytokine에 의한 것으로 생각할 수 있다.
혈관 속의 단핵세포가 조직 내로 이동하여 대식세포가 되며 국소염증이 없는 경우는 무작위로 혈관 밖으로 이동하지만 국소염증에 의한 화학주성이 있을 때 염증조직으로의 선택적 이동이 일어나게 된다. 대식세포의 화학주성 인자로는 C5a, FMLP(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine), IFN-γ와 같은 lymphokine 및 국소염증조직의 MIF(macrophage migration inhibition factor) 등이 있으며, 국소 염증조직의 활성화된 대식세포는 활성산소대사물, 산화질소, 혈소판활성인자 및 프로스타글라딘 같은 염증 매개물질과 TNF와 같은 cytokines등을 분비함으로써 염증반응을 증폭시키며 이러한 대식세포는 세포성 면역에서의 주된 작용세포이다.19) 본 실험에서 대식세포는 3일째부터 주로 상피하 조직에 광범위한 침윤을 나타내었고 이것은 면역반응으로 인한 여러 cytokine의 영향으로 생각되며 중이점막의 활성화된 대식세포는 iNOS를 발현하고 또한 여러 cytokine을 분비하여 2차로 상피세포의 iNOS 발현을 자극함으로써 산화질소 생성에 관여하는 것으로 생각할 수 있다.
이상의 결과로 KLH로 감작시킨 흰쥐에서 발생한 면역매개성 삼출성 중이염의 중이저류액에서 산화질소 산화물과 iNOS mRNA의 발현을 알 수 있었고 중이 점막 내에서도 iNOS의 발현과 iNOS의 주된 발현세포인 대식세포의 침윤을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 사실로 미루어 중이 점막 내 활성화된 대식세포 및 호중구 등에 의해 iNOS가 발현되고 이러한 iNOS에 의해 형성된 산화질소가 삼출성 중이염의 발생에 중요한 매개물질로 생각되며 이것은 향후 삼출성 중이염을 치료하는 데에 임상적인 적용을 시도해 볼 수 있으리라 생각된다.
결론
저자들은 세포성 면역을 유발시키는 물질로 알려진 KLH를 이용하여 흰쥐에서 삼출성 중이염을 유발시키고 최근 삼출성 중이염의 발생에 중요한 매개 물질로 알려진 산화질소의 생성과 이러한 산화질소를 만드는 iNOS의 발 현을 관찰하였다. 중이 저류액 내에 산화질소 산화물의 농도가 의의있게 검출되었으며 RT-PCR을 이용하여 iNOS mRNA의 발현을 확인하였다. 면역조 직화학적 방법을 통해 중이 저류액이 관찰된 3일군부터 iNOS는 상피하층의 많은 염증세포와 상피세포에 발현되었으며 대식세포의 광범위한 침윤이 관찰되었다. 이는 삼출성 중이염의 발생에 있어서 iNOS의 발현에 의한 산화질소 생성이 중요한 역할을 하며 이러한 산화질소 생성은 부분적으로 대식세 포의 침윤과 관계가 있음을 알 수 있었다. 향후 추가적인 연구를 통해 중이염의 발생기전에 대한 이해와 치료 및 예방에 도움이 되리라 생각된다.
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