| Mutation of p53 Gene and Detection of Human Papillomavirus DNA in Larynx and Pharynx Cancers. |
| Young Hak Park, Seung Ho Jo |
| Department of Otolaryngology-HNS, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. |
| 인·후두암에서 p53 유전자 변이 및 인유두종 바이러스 DNA 검출 |
| 박영학 · 조승호 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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Mutations in the p53 tumor suppressor gene have been shown to be one of the most common genetic abnormalities in human cancers. Loss of p53 tumor suppressor gene function can occur through gene mutation or interaction with early proteins of oncogenic viruses such as E6 protein of human papillomaviruses(HPV). We studied 24 squamous cell carcinomas of the larynx(20) and hypopharynx(4) for p53 gene mutations as well as for the presence of oncogenic HPV DNA.
Exon 5 through 8 of the p53 gene were examined using polymerase chain reaction-direct sequencing methods. HPV detection was done using polymerase chain reaction amplification with HPV L1 consensus primer. HPV type was determined by the same method using HPV-16 and -18 type-specific E6 primers. The results were as follows: 1) Eight of 24 tumors(33%) had p53 mutations, one of which had 2 mutational sites. All cases of which had p53 mutations or HPV DNA detection were larynx cancer. 2) p53 genetic alteration in larynx cancer included seven missense mutations resulting in single amino acid substitutions, one nonsense mutation encoding a stop codon and one silent mutation. Six of 9(66.7%) mutations occurred in two distinct regions of the genes, codon 245-248(3 mutations) and codon 283-294(3 mutations). 3) The p53 mutational spectrum observed was characterized by G to T transversion(4 of 9), T to A transversion(2 of 9), C to A transversion(1 of 9), G to A transition(1 of 9) and C to T transition(1 of 9). 4) HPV DNA was detected in 3 of 24(12.5%) tumors. According to the type of HPV DNA, HPV-16 was detected in 1 case and HPV non-16, -18 was detected in 2 cases, one of which had p53 mutation. 5) There was no relationship between p53 mutations or HPV DNA detection and clinicopathologic parameters. These results suggest that p53 mutations may play an important role in carcinogenesis of laryngeal cancer. Further study is necessary to clarify the role of p53 mutation and oncogenic HPV infection on clinical outcome of laryngeal cancer. |
| Keywords:
p53 geneㆍHuman papillomavirus DNAㆍLarynx and pharynx cancers |
머리말
두경부종양에서 흔히 연구되고 있는 p53 유전자는 17번 염색체의 단완에 존재하고 11개의 exon으로 구성되어 있으며, 393개의 아미노산으로 구성된 53kDa의 p53 단백을 합성한다. p53 유전자의 작용기전은 DNA 손상시 활성화되어 p53에 의해 조절되는 유전자인 WAF1(wild-type p53 activated fragment 1)/Cip1(cyclin dependent kinase interacting protein 1) 유전자의 발현을 촉진하고 이것은 CDK(cyclin dependent kinase), PCNA(proliferating-cell nuclear antigen)와 결합하여 활성을 억제함으로써 DNA 합성 전에 세포주기를 정지시켜 손상된 DNA를 복구할 시간적 여유를 가지게 된다. p53 유전자에 의하여 합성되는 정상 p53 단백은 세포주기의 조절, DNA 수선, apoptosis에 관여하는 종양억제유전자 물질로 알려져 있다.20)34)
p53 유전자의 기능이 소실되는 기전은 p53 유전자의 변이에 의하거나 p53 단백과 종양유발
성 바이러스 단백과의 결합에 의한 비활성화로 생길 수 있다.34) p53 유전자 변이는 폐암31)이나 식도암18) 등에서 암의 중요한 발생 원인으로 제시되고 있다. Zhang등41)과 Li21)는 후두암의 발생 기전과 p53 유전자 변이가 연관성이 있다고 보고하였고, Boyle등5)은 두경부종양이 침윤성 암으로 진행되면서 p53 유전자 변이의 빈도가 증가한다고 하였으나 Brachman등6)은 종양의 병기 및 림프절 전이 유무와 p53 유전자 변이는 상관관계가 없다고 하여, 두경부종양에서 p53 유전자의 변이가 종양의 임상적인 병태생리와 상관이 있는지에 대하여서는 논란의 여지가 있다.
정상적인 p53 단백은 인유두종 바이러스(human papillomavirus;이하 HPV) E6 단백과 같은 종양 바이러스 단백과 결합하여 비활성화되어 p53 단백이 분해됨으로써 기능을 상실하는 수도 있다.29) 또한 특정한 종류의 HPV가 정상세포에서 악성 형질변형을 유도할 수도 있다는 것이 밝혀짐으로써 암 발생의 주요 원인의 하나로 간주되고 있다.40) 특히 HPV-16의, 18은 악성종양과 연관되어 있으며 HPV-16의 E6 단백은 p53 단백과 결합하여 p53 단백의 작용을 소실시킨다.38) Lorincz등22) 은 자궁경부암의 종양 조직에서 HPV DNA가 80%이상 검출되고 자궁경부의 상피내 종양과 침윤성 자궁경부암에서 HPV-16, -18의 검출율이 높아 자궁경부암의 발생과 HPV가 연관성이 있을 것이라고 하였다. 또한 HPV-6, -11이 후두유두종15)에서, HPV-16은 설암, 편도암, 인두암, 후두암8)에서 검출되어 두경부종양의 발생과 HPV가 연관성이 있을 가능성이 제시되고 있으나 두경부종양 발생에서 HPV의 역할 및 의의에 대하여 정확히 알려져 있지 않다.
이에 저자들은 후두암 20례와 하인두암 4례 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction;이하 PCR)-직접 염기서열 결정법을 이용하여 p53 유전자 변이를 검색하고 HPV DNA 검출 유무를 관찰하여 한국인의 인·후두종양에서 p53 유전자 변이의 특징을 규명하고 p53 유전자 변이와 HPV DNA 검출이 인·후두종양의 암화기전과 임상적 진행에 연관된 인자에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다.
대상 및 방법
1. 대상
실험대상은 1993년 7월부터 1996년 3월까지 가톨릭대학교 강남성모병원 이비인후과에서 인·후두의 편평상피암으로 진단받고 수술을 받았던 24례의 환자에서 수술후 적출된 종양의 피라핀 포매조직을 이용하였다. 후두암이 20례, 하인두암이 4례였다. 성별은 남자가 23명, 여자는 1명이었다. 연령분포는 40세에서 72세로 평균 60세였다. 환자의 임상적 병기는 American Joint of Cancer Committee의 분류방법4)을 따라 결정하였다.
2. 방법
1) p53 유전자의 변이 검출
(1) DNA 추출
종양 DNA 추출은 Goelz등 14)의 방법을 변형시켜 이용하였다. 파라핀에 포매된 인·후두암 조직으로부터 5μm두께의 절편을 얻어 hematoxylin-eosin 염색을 한후 광학 현미경하에서 종양세포가 70%이상인 조직을 표시하였다. 표시된 종양조직의 크기에 따라 5~10개의 절편을 만들고 xylene을 처리하여 파라핀을 제거하였다. 광학 현미경상에서 표시한 조직을 참고로 하여 종양조직 부위를 긁어 모아 1.5ml tube에 넣고 용해용액(50mM Tris-HCI(pH8.8), 0.5mM EDTA(pH8.0), Tween 20 0.5%, proteinase K 500μg/ml)을 가하여 37℃에서 18시간 처리하였다. 100℃에서 5분간 가열하여 proteinase K를 불활성화시킨 후 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 정상 DNA 추출은 혈액에서 DNA extraction kit(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 추출하여 음성 대조군으로 사용하였다.
(2) p53 유전자의 exon별 PCR
PCR primer는 Buchman등 9)이 보고한 염기 서열을 인용하여 합성하였다(Clontech, CA, USA)(Table 1).
PCR은 template DNA(100ng/μl) 4μl, 0.2mM의 각 dNTP들, 10×PCR buffer 5μl, 25pM의 upstream primer와 downstream primer, Taq polymerase 1unit와 증류수를 섞어 총 50μl의 양이 되게 한 후 Thermal cycler(Perkin-Elmer, CA, USA)에서 시행하였다.
PCR 조건은 exon 5에서는 94℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 1분으로 35회 시행하였으며 처음 95℃는 3분, 마지막 72℃는 3분간 처리하였고, exon 6, 7, 8에서는 annealing 온도를 60℃로 하여 같은 방법으로 시행하였다. 반응액 중 5μl를 2% metaphore agarose gel에서 전기영동하였고 전기영동된 gel은 0.5mg/ml ethidium bromide 용액에 15분간 염색후 자외선하에서 검색하였다.
(3) 증폭 산물의 염기서열 결정
염기서열 결정은 Sanger등28)의 방법으로 PCR에서와 동일한 primer를 사용하여 Sequenase PCR product sequencing kit(USB, OH, USA)를 이용하여 증폭산물의 염기서열을 결정하였다.
① PCR 산물의 전처리
PCR 산물 5μl를 1.5ml tube에 넣은 후 exonuclease I 1μl(10U/μl), shrimp alkaline phosphatase 1μl(2U/μl)를 넣은 후 37℃에서 15분간 반응시켜 과량의 primer와 dNTPs를 제거한 후 80℃에서 15분간 반응시켜 효소들을 불활성화시켰다.
② 염기서열 결정
전처리된 PCR 산물 5μl, primer(10pmol) 1μl, 증류수 4μl를 혼합하여 100℃에서 2분간 가열 후 얼음물에서 5분간 식히는 annealing reaction후 얼음 속에 보관하였다. 표본 하나 당 4개의 1.5ml tube를 만들어 G, A, T, C를 표시한 후 각각의 tube에 termination mix [ddG termination mix(80μM dNTPs, 8μM ddGTP, 50mM NaCl)] 2.5μl를 넣은 후 37℃에 두었다. Annealing시킨 template-primer 혼합액에 0.1M DTT 1μl, 1:5로 희석한 labeling mix 2μl(α- 35 S) dATP(10μM) 0.5μl, reaction buffer 2μl, sequenase 2μl를 섞어 상온에서 2분간 반응시킨 후 3.5μl씩 각각의 termination mix에 분주하여 37℃에서 5분간 반응후 정지용액 4μl를 넣어 반응을 정지시켰다. 20 x glycerol tolerant gel buffer(216gm Tris base, 72gm Taurine, 4gm Na 2 EDTA·2H 2O/1000ml) 4ml, acrylamide 4.56gm과 N,N'-methylenebisacrylamide 0.24gm으로 만든 40% 용액 12ml, urea 40gm을 녹여 80ml의 gel을 만들고 0.45μm filter를 사용하여 여과한 다음 10% ammonium persulfate 400μl와 TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenedi-amine) 40μl를 넣어 gel을 만들었다.
반응이 끝난 표본을 100℃에서 2분간 변성을 시켜 3.5μl씩 gel에 분주한 다음 1500V, 55W, 35A로 2시간 동안 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 filter paper로 옮겨 gel dryer로 80℃에서 2시간 건조시킨 후 casette에 놓고 X-ray 필름을 덮어 상온에서 48시간 지난후 필름을 현상하여 관찰하였다.
2) 인유두종 바이러스의 중합효소 연쇄반응
HPV DNA의 증폭은 Manos등 24)이 고안한 L1 open reading frame중 450bp를 증폭할 수 있는 L1 consensus primer를 이용하였다. HPV DNA가 검출된 경우에는 HPV-16, -18의 아형을 알아보기 위하여 한국생명공학연구소에서 주문 합성한 206bp를 증폭할 수 있는 HPV-16 E6 primer와 419bp를 증폭할 수 있는 HPV-18 E6 primer를 이용하였다(Table 2). PCR은 추출된 DNA 5μl에 0.2mM dNTP, PCR 10×buffer 10μl, 0.5mM consensus primer, 2.5unit Taq polymerase와 증류수를 섞어 100μl가 되도록 하였다.
Thermal cycler(Perkin-Elmer, CA, USA)에서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 처리과정을 40회 반복하였다. 양성 대조군으로 HPV-16, -18 DNA 5μl를 표본 DNA로, 음성대조군으로는 조직 대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 각각 사용하였다. 증폭산출물중 10μl를 2% agarose gel(Boehringer Manheim, Germany)에서 전기영동한 후 ethidium bromide(Boehringer Manheim, Germany) 용액으로 30분간 염색하였다.
양성 결과로 나온 검체를 HPV-16, -18 E6 primer를 이용하여 같은 방법으로 증폭한 다음 HPV-16은 206bp, HPV-18은 419bp 위치에 형광띠가 나타나는 것을 양성으로 하여 아형을 분리하였다. Size marker는 123bp size marker(Gibco, Germany)를 사용하였다.
3) 자료분석과 통계처리
p53유전자 변이와 HPV DNA 검출 유무에 따른 각군의 발생빈도의 차이는 X2-검정을 이용하였고 표본수가 적은 경우에는 Fisher's exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의수준을 p<0.05 범위로 정하였다.
결과
1. p53 유전자의 돌연변이
유전자의 돌연변이는 24명중 8명(33%)에서 관찰되었으며 모두 후두암환자였다. 후두암의 발생부위는 성문상부가 4례로 가장 많았다. 하인두암에서는 돌연변이를 관찰할 수 없었다.
돌연변이의 exon별 분포는 exon 5가 2례, exon 6이 1례, exon 7이 3례, exon 8이 3례였고 성문상부암 1례에서는 exon 6과 8에서 동시에 돌연변이가 관찰되었다. 돌연변이의 codon별 분포는 codon 153에서 294사이에서 나타났고 codon 245~248과 codon 283~294에서 각각 3례의 돌연변이가 관찰되었다(Table 3).
p53 유전자의 돌연변이 9례는 모두 1개의 염기가 치환되는 점돌연변이만 관찰되었다. 돌연변이의 종류는 transversion이 7례(78%), transition이 2례(22%)였다. Transversion 7례중 4례가 G-T, 2례가 T-A, 1례가 C-A변이를 나타내었으며 transition 2례는 G-A, C-T변이가 각각 1례씩이었다.
돌연변이 9례중 7례가 아미노산 복제서열이 바뀌는 missense mutation이었다. 성문상부암 1례는 exon 8의 codon 285에서 GAG가 TAG로 바뀌어서 아미노산이 stop codon으로 바뀌는 nonsense mutation이 나타났고, 성문암 1례는 codon 294에서 GAG가 GAA로 바뀌는 G-A transition을 나타내었으나 아미노산이 바뀌지 않는 silent mutation이었다(Table 3, Fig. 1, 2).
2. HPV DNA의 검출
HPV L1 consensus primer를 사용한 PCR에서 24례 중 3례(12.5%)에서 HPV DNA가 검출되었으며 부위별로는 성문암에서 2례가 나타났고 성문상부암에서 1례가 검출되었다. HPV 아형에 따른 검출빈도는 HPV-16이 성문상부암 1례(4.2%)에서 검출되었으며, HPV-16, -18 이외의 형이 성문암 2례(8.3%)에서 검출되었다(Table 4, Fig. 3). 이중 성문암 1례에서는 HPV-16, -18 이외의 형인 DNA가 검출되며 동시에 codon 157에서 GTC가 TTC(Val-Phe)로 바뀌는 G-T transversion이 나타났다.
3. 임상 및 병리조직학적 특징과의 상관관계
임상 및 병리소견으로 제 I, II 병기의 초기암이 4명, 제 III, IV 병기의 진행암이 20명이었고 발생 부위는 성문상부에서 12명으로 가장 많았다.
제 I, II 병기의 초기암 4명중 p53 유전자 변이가 1례(25%), HPV DNA검출이 1례(25%)에서 나타났고 진행암 20명중에선 p53 유전자 변이가 7례(35%), HPV DNA검출이 2례(10%)에서 관찰되었다.
경부 림프절전이는 24명중 16명에서 있었으며 경부 림프절전이가 있는 16명중 p53 유전자변이는 6례(37.5%), HPV DNA 검출은 1례(6%)에서 나타났고, 경부 림프절전이가 없는 8명 중 p53 유전자 변이는 2례(25%), HPV DNA 검출은 2례(25%)에서 관찰되었다.
치료후 재발은 3례에서 있었고 3례중 1례에선 p53 유전자 변이를 보였으며 p53 변이가 있는 군 8례에서 1례(12.5%)가 재발하였고 p53 변이가 없는 군 16례에서 2례(12.5%)가 재발하여 p53 유전자 변이와 두경부종양의 재발과는 무관하게 나타났다(Table 4).
고찰
p53 단백은 1979년 발견된 핵내에 존재하는 인단백질로 simian 바이러스 40(SV 40)의 large T antigen과 결합하는 단백으로 발견되었으며, p53 유전자는 처음엔 과발현된 형태로 발견되었기 때문에 암유전자로 생각되었으나 후에 우성으로 작용하는 종양억제유전자로 판명되었다.13) p53 유전자에 의해 합성된 p53 단백의 작용은 세포 손상시 G1-S 이행 단계에서 세포주기는 지연시켜 DNA 손상을 교정하면서 apoptosis에도 관여하며20), DNA 손상시에 활성화되어 p53 유전자에 의해 조절되는 유전자인 WAF1/Cip1의 발현을 촉진하고 이것은 CDK, PCNA와 결합하여 활성을 억제함으로써 DNA 합성 전에 세포 주기를 정지시켜 손상된 DNA를 복구할 시간적 여유를 가지게 한다.10)11)16)39)
p53 유전자의 작용 소실기전은 정상 p53 대립인자의 하나 혹은 둘 모두가 소실되어 세포내 농도가 낮아지는 경우, nonsense mutation에 의해 p53 tetramer가 형성되지 못하는 경우, p53 대립인자 하나가 missense mutation을 일으켜 정상 p53으로만 구성된 tetramer의 농도가 낮아지는 경우, HPV E6 단백질이나 Adenovirus E1b와 같은 바이러스 종양단백이 p53 단백과 결합하여 작용을 나타내지 못하는 경우 등이 있다.34)
p53 유전자의 작용 소실의 주된 기전인 p53 유전자의 돌연변이는 일반적으로 exon 5, 6, 7, 8에 분포하고 두경부종양에선 exon 7에서 흔히 나타나며 특히 codon 238~248 부위에서 hot spot을 이루고 있는 것으로 알려져 있다.5)21)23)30)41) 또한 지역과 발표자에 따라서 많은 차이를 보여 미국의 경우 exon 76), 일본의 경우 exon 5 및 827), 영국의 경우 exon 412)에서 p53 유전자 변이가 흔히 발견되었으며 이러한 차이는 음주, 흡연 등의 발암인자와 지역적인 특수성에 의하여 유발되었을 가능성이 있다.12) 본 연구에 따르면 총 9례의 p53 유전자 변이 중 exon 7과 exon 8에서 각각 3례씩 발견되어 외국의 보고된 경우와 차이가 있었으며 이는 한국에서의 인종, 생활습관 등의 지역적인 특수성에 의하여 p53 유전자 변이의 위치가 다르게 나왔을 가능성을 시사한다.
또한 hot spot을 이루는 돌연변이 부위도 종양에 따라 차이가 있는데 간암의 경우 p53 유전자의 codon 249에서는 돌연변이가 흔하게 일어나나 두경부종양의 경우 codon 249에서는 거의 돌연변이가 없으며 codon 238~248 부위에서 hot spot을 이루고 있다.12) 본 연구에서 codon 249에는 돌연변이가 나타나지 않았고 codon 245에서 248사이에서 3개의 점돌연변이를 보여 저자들의 경우도 다른 연구들과 마찬가지로 codon 238~248이 hot spot을 이루고 있는 것으로 생각된다.
두경부암에서 p53 유전자 변이의 빈도는 Brachman등6)은 53%, Boyle등5)은 43%에서 나타난다고 하여, 저자들의 인·후두암에서의 결과인 33%보다는 높았다. 그러나 후두암만의 p53 유전자 변이의 빈도는 45%로 Zhang등41)의 33%, Li21)의 32%보다는 높았고, Brachman등6)의 75%보다는 낮았다. 한편 하인두암 4례에선 유전자 변이가 나타나지 않았다. 이는 Brachman등6)이 보고한 두경부종양에서 p53 유전자 변이의 부위별 출현 빈도가 구강(73%), 후두(75%), 하인두(13%) 순으로 하인두에선 p53의 유전자 변이가 적게 나타난 것과 일치한다고 할 수 있다.
p53 유전자 변이의 가장 흔한 돌연변이형은 G to A, G to T, A to G이며 두경부암에선 44%, 후두암에선 46%에서 이와 같은 돌연변이형이 나타난다고 보고되고 있으며41) 본 실험 결과에서는 9례중 5례(56%)에서 G to A, G to T 변이가 일어났고 A to G 변이는 없었다.
지역별 p53 유전자의 염기치환양상은 미국의 경우 두경부암의 63%에서 G-T transversion이 나타나며30) 일본의 경우 G-A transition이 50%에서 나타난다.27) 또한 종양별로 염기치환양상의 차이는 대장암에서는 G:C to A:T transition이 많은 반면, 폐암과 간암에서 G:C to T:A transversion이 많다고 보고되어 있으며17), 저자들의 경우에는 G-T transversion이 9례중 4례(44%), T-A 2례, C-T 1례, C-A 1례, G-A 1례에서 나타났다. 이 결과는 지역적으로는 일본보다 오히려 미국에서의 p53 유전자 변이 양상과 유사했으며 종양별로는 폐암의 경우와 유사하게 G-T transversion이 많이 나타났다. 폐암에서는 p53 유전자의 변이가 흡연에 의한 benzopyrene에 의해 G-T transversion이 흔히 일어난다고 알려져 있고 이와 같은 결과는 두경부암에서도 흡연에 의한 benzopyrene이 유전자 변이를 일으켜 종양의 발생에 중요한 유발인자가 될 수 있음을 나타낸다.5)12)23)30)
p53 유전자의 변이 종류에는 missense mutation, nonsense mutation, 결손(deletion)이 있다. Harris와 Hollstein17)에 의하면 p53 유전자 변이의 85%가 하나의 염기가 치환되는 missense mutation이라고 하였으며 저자들의 결과에서도 9례중 7례(78%)가 missense mutation이었고 1례는 codon 285에서 GAG가 TAG로 변하여 stop codon으로 바뀌는 nonsense mutation이었으며 1례는 codon 294에서 GAG가 GAA로 바뀌는 G-A transition이었으나 아미노산이 바뀌지 않았으며 codon 294에서 현재까지 polymorphism이 보고된 예가 없는 것으로 보아 silent mutation으로 생각된다.
p53 유전자의 작용소실은 p53 유전자의 변이 이외에도 HPV DNA E6 종양단백과 같은 바이러스 종양단백이 정상 p53 단백과 결합하여 초래될 수 있다. 인유두종 바이러스(HPV)는 70 여종의 아형으로 구성되는 Papovaviridae과에 속하는 DNA 바이러스로 HPV 6, 11형은 후두유두종 등의 양성종양과 관련이 있고 HPV 16, 18형은 자궁경부와 항문암의 발생과 연관되어 있다. HPV가 p53 유전자 기능소실에 관여하는 기전은 정확히 규명되지는 않았지만, HPV가 세포내에 감염되면 바이러스에 의해 표지화된 변형유전자 E6 및 E7 종양단백을 만들고 이중 E6 단백은 p53 단백과 결합하여 p53을 분해시킴으로 종양을 유발할 것으로 생각되고 있다.29)
최근 Brandsma와 Abramson8), Ishihashi등19)은 두경부 편평상피암 환자에서 HPV 16의 검출을 시행하여 설암의 18%, 편도암의 29%, 인두암의 13%, 후두암의 5%에서 양성율을 보고하였다. 김과 서1)는 후두암 환자에서 28.5%의 HPV DNA 검출율을 보고하였고 선과 서2)는 후두암 환자에서 HPV DNA는 22.2%, HPV-16은 7.3%, HPV-18은 2.9%의 검출율을 보고하였다. 저자들은 24례중 3례(12.5%)에서 HPV DNA를 관찰하였고 그중 1례(4.2%)에서 HPV-16 아형을 검출할 수 있었다.
자궁경부암에서는 HPV DNA가 검출되지 않은 자궁경부암에서 p53 유전자 변이가 많았으며, HPV 양성 자궁경부암에서는 정상형 p53 유전자를 가지고 있었다.25) 즉 p53 기능소실은 p53 유전자 변이와 정상 p53 단백이 HPV의 종양유발성 단백과 결합에 의하여 일어나는 2개의 다른 기전이 있다는 것을 시사한다. Brachman등6)은 두경부암에서 53%의 p53 돌연변이와 10%의 HPV DNA 양성율을 보고하였으며 HPV DNA 양성에서 p53 돌연변이가 나타나지 않았다고 보고하였다. 그러나 저자들의 경우 HPV-16, -18이외의 형이 검출된 1례에서 p53 유전자 변이가 나타났으며 이것은 Anwar등3)의 보고와 같이 HPV 감염 이전에 먼저 p53 유전자가 변이된 것으로 설명할 수 있겠다.
p53 유전자 변이는 유방암32)과 폐암26)에서 환자의 생존율을 감소시키는 예후인자와 관련이 있다고 하나 전립선암33)에서는 p53 유전자 변이가 예후인자와 관련이 없다고 한다. Boyle등5)은 두경부종양이 침윤성 암으로 진행하면서 p53 유전자의 변이가 증가한다고 보고하였으나, Field등12)과, Brachman등7)에 의하면 일반적으로 두경부종양에서 p53 유전자 변이는 종양의 임상적 양상 및 예후와 연관이 없다고 하였다. 저자들의 연구에서는 대상의 선정에서 초기암이 4명, 진행암이 20명으로 진행암이 훨씬 많아서 통계학적으로 비교하는 데는 어려움이 있으나 p53 유전자 변이는 초기암이 4례중 1례(25%), 진행암이 20례중에 7례(35%)로 나타났고, HPV DNA 검출율은 초기암이 4례중 1례(25%) 진행암이 20례중 2례(10%)로 HPV DNA 검출율은 초기암에서, p53 유전자 변이율은 진행암에서 높게 나타났으나 통계학적으로 유의하지는 않았다. 또한 경부 림프절전이와 p53 유전자 변이 및 HPV 검출율과는 통계학적으로 유의한 상관관계는 없었다. 치료후 재발은 3례(12.5%)였으며 수술후 추적기간이 짧아 p53 유전자 변이와 재발율을 비교하는 데는 어려움이 있었다. 이상의 결과에서 p53 유전자 변이는 후두암의 암화기전에 관련되어 있을 것으로 생각되나, p53 유전자 변이와 HPV DNA 검출이 인·후두종양에서 임상적 진행에 연관된 인자에 어떠한 영향을 미치는지를 정확히 규명하기 위해서는 좀더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
맺음말
인·후두암의 발생과 p53 종양억제 유전자 변이 및 HPV DNA 검출과의 관계를 알아보기 위하여 20례의 후두암과 4례의 하인두암의 파라핀 포매조직에서 DNA를 추출한 후 PCR을 통해 exon 5, 6, 7, 8을 증폭하고 직접염기서열 결정법으로 p53 유전자의 돌연변이를 검색하였다. 또한 추출된 DNA를 HPV DNA primer로 PCR을 하고 HPV DNA 검출 유무를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 20례의 후두암과 4례의 하인두암중 후두암 8례(33%)에서 p53 유전자의 점돌연변이를 관찰할 수 있었으며 1례에서는 2군데에 점돌연변이가 있었다.
2) p53 유전자의 점돌연변이가 관찰된 부위는 exon 5가 2례, exon 6이 1례, exon 7이 3례, exon 8이 3례였으며 codon별로는 codon 245~248, codon 283~294에서 각각 3례로 hot spot을 이루고 있었고 missense mutation이 7례, nonsense mutation이 1례, silent mutation이 1례에서 나타났다.
3) 염기서열의 변화는 transversion이 7례(78%), transition이 2례(22%)였으며 transversion에는 G to T가 4례, T to A가 2례, C to A가 1례였고 transition은 G-A, C-T 변이가 각각 1례였다.
4) HPV DNA는 3례(12.5%)에서 검출되었으며 이중 HPV-16 아형은 1례(4.2%)에서 나타났으며 HPV-16, -18이외의 형에 감염된 1례에서 p53 유전자의 점돌연변이가 관찰되었다.
5) p53 유전자 변이 및 HPV DNA 검출과 후두암의 임상적 진행사이에는 특별한 관계를 관찰할 수 없었다.
이상의 결과에서 p53 유전자의 변이는 후두암의 발생기전에 관련되어 있을 것으로 사료되나 인·후두암의 진단 및 예후판정과 같은 임상적 응용을 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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