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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(1): 91-97. |
| Effects of Leukotriene D4 on Ultrastructure of Nasal Mucous Membrane in Guinea Pigs. |
| Seong Ho Cho, Joong Saeng Cho, Do Young Jang, Chang Il Cha, Sung Mahn Lee |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul, Korea.
2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Kangnam General Hospital, Public Corporation, Seoul, Korea. |
| 기니픽 비강내 Leukotriene D<sub>4</sub> 투여가 비점막 미세구조에 미치는 영향에 관한 연구 |
| 조성호1 · 조중생1 · 장도영1 · 차창일1 · 이성만2 |
| 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실1;지방공사 강남병원 이비인후과2; |
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| ABSTRACT |
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The aim of this study was to evaluate effects of leukotriene D4(LTD4) on the nasal airway. Fifteen guinea pigs were divided into two groups;10 for experimental group and 5 for control group. Two l of 10(-5)mol LTD4 was administered to both nasal cavities in experimental group and same volume of normal saline in control group. Transmission electron microscopy was performed to investigate ultrastructural change of the nasal mucosal membrane in LTD4 administered guinea pigs. Infiltration of neutrophils and eosinophils from the capillaries were seen in the perivascular space. In the capillaries, some endothelial cells degenerated and intercellular spaces of the cells were widened, especially 6 hours later. Degranulated mast cells and neutrophils were found in the lumen of the capillaries. Several red blood cells with low electron density were seen in the shrunken vessels. The giant mitochondriae with inclusion bodies were observed. The results of this study suggest that leukotriene may be a potent mediator to induce biphasic response in the nasal passage of guinea pigs. |
| Keywords:
Leukotriene D4ㆍUltrastructure of noseㆍBiphasic reactionㆍAllergic rhinitis |
서론
알레르기 항원의 수용성 부분이 비점막내로 침입하여 임파조직으로 이동하면 비점막 국소 또는 국소 임파절에서 면역글로블린 E(immunoglobulin E；IgE)항체가 생산되어 혈액속으로 흡수된다. 흡수된 IgE항체는 전신혈류로 순환되어 비점막등에 존재하는 염기성 세포, 즉 비만세포와 호염기구의 표면에 결합하여 감작이 성립된다. 감작된 개체에서 동일 항원이 국소에 challenge되면 세포 표면에서 일어나는 세포특이적 면역반응에 의하여 비점막 비만세포에서 분비된 히스타민 등의 화학매개체가 유리되어 혈관, 신경 및 분비선을 자극하여 3대 주증상으로 불리우는 재채기, 분비항진, 비폐쇄 등의 아나필락시스 반응이 발생한다. 히스타민, 류코트리엔(leukotriene；LT), 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor；PAF), capsaicin에 의한 신경 반사 등이 이런 기전에 관여하고13)17)19) 이런 물질을 국소점막에 자극할 경우 더욱 심한 비점막 종창과 과민반응이 일어나게 된다.14) 호흡기 알레르기 질환에서 항원으로 유발 반응 검사를 할 경우 시간적 차이를 두고 뚜렷이 구분되는 즉시형 반응과 후기 반응이 일어나게 되는데17) 그 기전은 현재까지 확실히 알려져 있지 않다.
LT은 과립세포의 세포막에서 생산되는 물질로 기도 점막에서 면역계와 혈관계에 작용하여 임파구의 유주 및 혈관 투과성을 증가시켜 알레르기성 비염이나 천식의 발병기전에 관여하고 있다. 최근 기관지 천식에서 즉시형 반응 뿐 아니라 후기 반응에서 LT이 관여한다고 알려져 있지만19) 알레르기 비염에서 LT의 역할에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 이들 물질 투여전과 투여후 30분, 3시간, 6시간에 음향비강통기도 검사를 시행하였다. 그 결과 LTD4용액을 투여한 실험군에서 투여후 30분 및 6시간에 비강 면적이 현저히 감소하는 것을 관찰하였다.1)
본 연구는 기니픽의 비강에 leukotriene D4(LTD4)를 투여한 후 투과전자현미경을 이용한 미세구조의 변화를 경시적으로 관찰하여 비강의 알레르기 반응에서 LT의 역할과 작용기전을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
실험동물로는 육안으로 관찰하여 건강해 보이고 비강이 깨끗한 체중 380∼420g의 Hartley종 기니픽 15마리를 사용하여 이 중 10마리를 실험군, 5마리를 대조군으로 하였다. 모든 동물에서 sodium pentobarbital(Nembutal(r))을 체중 kg당 30mg씩 복강내 주입하여 마취를 시행한 후 실험군에서는 LTD4용액(Ono社, Tokyo, Japan)을 생리식염수로 희석하여 10 -5mol 농도의 용액으로 만들어 micropipette(Eppendorf Varip-ette 470, Germany)으로 2μl를, 대조군에서는 생리식염수 2μl를 양측 비강에 투여하였다. 이 실험군에서 각 시간 대에 동물을 단두하여 비중격 및 비갑개에서 조직 절편을 채취하여 미세구조의 형태학적 변화를 관찰하였다.
비중격 및 비갑개에서 채취한 점막을 2.5% glutaraldehyde 용액에 전고정시킨 후 1% 오스민산 용액에 2시간 재고정하고 에타놀로 단계적 탈수를 시킨 후 propylen oxide로 정명시켰다. 그후 epon으로 포매하여 두께 1μm로 박절한 다음 toluidine blue로 염색하여 관찰 부위를 결정하여 40∼60μm로 초박절편을 만든 후 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 전자염색한 후 투과전자현미경(HS-9, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
결과
미세구조의 변화는 LTD4 투여 30분후 혈관벽의 수축이 일어났으나, 혈관벽의 미토콘드리아는 특이한 변화가 없었다. 저전자밀도의 적혈구가 혈관내에 보여 혈관에 허혈이 일어나고 있음을 알 수 있었다(Fig. 1). 또 혈관주위에 봉입체(inclusion body)를 보이는 거대 미토콘드리아를 볼 수 있었다(Fig. 2). 비점막 혈관 내피세포는 일부가 변성을 보였고(Fig. 3), 혈관벽 내외부에 호중구가 보였으며(Fig. 4), 혈관밖으로 호산구가 이동하는 것이 관찰되었다(Fig. 5). 모세 혈관내에서는 탈과립후의 비만세포가 관찰되었고(Fig. 6), Charcot-Leyden crystal로 생각되는 콜로이드 물질을 탐식한 세포가 관찰되었다(Fig. 7). 투여 6시간에 내피세포간 간격이 넓어진 것을 볼 수 있었고(Fig. 7). 6시간에는 투여 30분후와 비슷한 변화가 일어났는데 혈관 내피세포의 간격이 넓어진 소견이 보였고(Fig. 8), 호중구가 혈관밖에서 관찰되었다(Fig. 9).
고찰
lshizaka10)에 의하여 알레르기의 항체가 1gE 라는 사실이 발견된 이래 알레르기성 비염의 기초와 임상에도 급격한 진전이 있어서 진단과 치료에 많은 도움을 주고 있으나 아직도 해결하여야 할 문제들이 많이 남아 있는 실정이다. 알레르기성 비염을 가진 환자에서 증상이 일으나려면 우선 항원이 존재하고 개체가 아토피 소인을 가지며 비점막의 병적 감수성이 항진되는 등 여러가지 요소가 필요하다. 비점막에는 비만세포가 존재하며 또 호산구, 호중구, 림프구 및 형질세포 등이 있고 상피하층에는 분비선, 혈관 등이 분포되어 있어 이들 각종 세포와 구성성분들은 일련의 관련성을 보여 각종 감염성 질환이나 알레르기 반응에 있어서 조직학적 변화와 증상발현을 유발시키게 된다.
비만세포와 호염기구의 표면에는 IgE항체의 Fc부분에 강한 친화력을 가진 수용체가 있으며 알레르기 반응은 항원과 IgE의 결합으로부터 시작한다. 또 다양한 임상적 증상은 화학매개체에 의해서 일어나게 된다. 화학매개체는 비만세포나 호염기구 안에 미리 형성되어 있는 매개체와 새로이 생성된 매개체로 대별되며 히스타민, 중성 단백효소, 호산구 및 호중구 유주인자 등이 전자에 속한다. 후자에 속하는 물질들은 세포막의 인지질에서 유래한 아라키돈산의 대사물질로서 이의 산화대사에는 cyclo-oxygenase 경로와 lipoxygenase 경로가 관여한다. 비만세포 및 호염기구에 있어서 cyclo-oxygenase 경로의 주요산물은 프로스타그란딘 D2 이고 lipoxygenase 대사물로는 hydroperoxy-eicosatetraenoic acid(HPETE)와 이로부터 유도된 LT들과 5-hydroxyeicosatetraenoic acid(5-HETE)가 있는데 LTC 4, LTD4 및 LTE 4는 slow-reacting substance of anaphylaxis(SRS-A)의 가장 중요한 성분이다. 1930년 Harkavy8)가 SRS 또는 SRS-A라고 불리는 생물합성물질이 천식환자의 객담에서 측정되어 이 물질이 기관지 수축을 유발시키는 인자라고 보고한 이래, 감작된 동물의 기관지에 항원을 자극시켰을 때 이와 유사한 물질이 유리되어 이 물질이 알레르기 반응에 관여할 것으로 추측되었다.12) Brocklehurst2)는 비면역자극에 의하여 유리되는 SRS와 면역자극에 의하여 유리되는 SRS가 상이하여 후자를 SRS-A로 명명할 것을 제창하였다. 그 후 SRS-A는 아토피성 질환에 깊이 관여하는 물질로 주목되어 광범위한 연구가 시작되었다. Jakschik등11)은 SRS-A가 아라키돈산의 전구체인 lipoxygenase계 대사산물일 가능성을 지적하였으며 Brogeat등3)에 의하여 LTC 4의 구조가 발표된 이래 그 본태가 LTC 4, LTD4와 LTE 4인 것으로 밝혀졌다. 이 LT들은 비만세포, 호염기구 이외에 호산구, 대식세포, 혈소판 등에서 생산되며 기관지 수축, 혈관 투과성항진, 기도 분비항진 등의 작용을 가지며 LTB 4는 대식세포에서 생산되어 호중구에 대한 유주기능 및 탈과립작용을 한다.
아토피성 환자에서 기인항원으로 유발반응을 실시할 경우 수초내에 소양감, 재채기, 비루의 증상을 보인 후 코막힘 증상이 일어나는 즉시형 반응에서 분비물중 히스타민, 키닌, 프로스타글린딘 D 2, LTC 4, LTD4, LTE 4 및 tryptase 가 상당량 포함되어 있음이 증명되었다.4)5)
이중 프로스타글란딘 D2와 tryptase가 모두 증가된 소견과 환자의 비점막을 채취하여 항원에 노출시켜 조직 내에서 비만세포의 탈과립현상과 배양액 내에 화학매개체들이 증가함을 밝힌 Gomez등7)의 소견은 이 반응에서 비만세포가 깊이 관여한다는 것을 시사하고 있다. 또 일정시간 경과후 나타나는 후기반응은 소아환자 특히 하기도 질환에서 빈번히 나타나게 되는데 이때 분비물에서 히스타민, 키닌, LTC 4의 농도가 다시 증가하게 되나 prostaglandin D2는 변화가 없는 소견을 나타내고 있다.15)16)
본 교실에서 시행한 바 있는 연구에서는 Yamagiwa 20)에 의하여 개량된 음향비강통기도검사에 따라서 LTD4투여후 비강의 용적 변화를 측정한 바 주입후 30분 및 6시간에 현저히 그 측정치가 감소하였다.1) 이 소견은 LTD4 투여 30분 및 6시간 후에 일어나는 이상성 현상(biphasic phenomenon)을 시사하였다. 이러한 소견은 Lshii등,9) Wieslander등19)이 기니픽의 기관지에 LTD4를 분무주입하였을 때 10분에서 1시간사이에 즉시형 반응과 3시간에서 7시간 사이에 후기 반응이 일어나는 것을 보고한 소견과 유사하여 비강에서도 이상성 형상이 일어날 수 있고 이런 현상에 있어서 LTD4가 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 이러한 면적변화의 기전을 규명하기 위해 전자현미경으로 미세구조의 변화를 관찰하였다. 그 결과 혈관이 수축되면서 전자밀도가 적은 적혈구를 보이는 소견은 허혈현상이 일어나고 있는 증거이고, 또 봉입체(inclusion body)를 함유하고 있는 거대 미토콘드리아들이 세포질 내에 출현하는 소견들은 LTD4에 의하여 급성 염증이 일어나고 있는 것을 시사하고 있다. 혈관 내피세포의 변성과 그 간격이 넓어져 있는 소견은 혈관 내부의 각종 물질들이 쉽게 혈관 밖으로 이동될 가능성을 시사하며 호중구 및 호산구가 혈관내부에서 밖으로 이주하는 소견이 관찰되어 내피세포의 변화가 이들 세포들의 이주에 관련성이 있는 것으로 생각된다. Rapoport18)는 뇌혈관에서 혈관투과성이 증가될 경우 혈관내외의 삼투압 차이에 의하여 내피세포 자체가 수축되지만 과도한 혈액성분이 유출될 경우 내피세포가 팽창되는 현상을 관찰하고 두 경우 모두에서 내피세포의 간격이 넓어지면서 혈액 성분이 쉽게 빠지는 것을 밝혔다. 따라서 본 연구에서의 내피세포자체와 간격의 변화는 LTD4의 혈관에 대한 투과성 항진에 의한 것으로 생각된다.
혈관 내에는 풍부한 과립을 가지고 있는 세포가 관찰되었는데 일반적으로 과립세포중 비만세포와 염기세포는 전자현미경적 소견으로 감별하는데 전자가 후자보다는 세포자체가 크고 세포질내에 풍부한 과립을 포함하고 있는 것으로 알려져6) 있으므로 본 연구에서 관찰된 과립세포는 비만세포로 추측된다. 기관지 천식에서 보이는 Charcot-Leyden crystal과 유사한 콜로이드 물질을 탐식한 것으로 보이는 세포가 관찰되었는데 이 세포는 호산구의 과립물질이 퇴화되면서 형성되는 것으로 알려져 있다. 최근 알레르기 반응에 있어서 호산구의 역할이 주목을 받고 있는데 그것은 호산구내에 포함되어 있는 과립 단백이 조직을 파괴하는 특성이 있고, 자극에 의하여 LTC 4 및 PAF 등의 화학 매개체를 분비하여 알레르기성 염증을 증폭 내지 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.6) 본 연구의 결과는 비강에서도 과민반응의 이상성 현상이 일어날 수 있고, 이때 LTD4가 관여하는 것을 시사하고 있다. 또 LTD4를 기니픽의 비강에 투여후 전자현미경 관찰에서 비만세포, 호산구, 호중구 등이 혈관으로부터 유출되어 비점막내에서 이들 세포들이 후기 반응의 기전에 관여할 것으로 생각된다.
결론
비강내 알레르기 반응에서 LTD4의 역할을 알아보기 위하여 기니픽의 비강에 LTD4를 투여한 후 경시적으로 투과 전자 현미경을 통해 미세구조의 변화를 관찰하였다.
투과 전자 현미경 관찰에서 LTD4 주입 후 30분 및 6시간에 일부 혈관의 허혈현상이 보였고, 혈관 내피세포의 변성과 그 세포간 간격이 넓어졌으며 호산구, 호중구 등이 혈관에서 혈관 밖으로 이동하는 소견이 관찰되었으며, 비만세포가 혈관 내에서 관찰되었다.
이상의 결과는 비강에서도 즉시형 반응과 후기 반응으로 구분되는 이상성 현상이 일어나며 이 현상에서 LTD4가 중요한 역할을 할 것이라는 증거를 제시하고 비만세포·호산구·호중구 등이 후기반응의 병태 생리에 주로 관여할 것으로 생각된다.
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