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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(1): 69-75. |
| Experimental Study on TGF-beta1 Gene Expression in Cholesteatoma. |
| Chul Won Park, Young Ho Jang, Kyung Tae, Sun Kon Kim, Kyung Chul Lee |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hangyang University, Seoul, Korea.
2Samsung Medical Center, Kangbuk Samsung Hospital, Seoul, Korea. |
| 진주종 조직에서의 TGF-β의 발현에 관한 연구 |
| 박철원1 · 장영호1 · 태 경1 · 김선곤1 · 이경철2 |
| 한양대학교 의과대학 이비인후과학교실1;삼성의료원 강북삼성병원 이비인후과2; |
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| ABSTRACT |
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Cholesteatoma is composed of hyperproliferative keratinizing epithelium in the middle ear cavity. Its pathogenesis of destruction is not clear, and thus many theories such as pressure effect of cholesteatoma, enzymatic destruction from monocyte, cytokines including interleukin, tumor necrosis factor, and etc, are reported. Recently, several cytokines, tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha) and beta(TNF-beta), epithelial growth factor(EGF), transforming growth factor-beta(TGF-beta), interleukin-1(IL-1) and 6(IL-6), were immunolocalized in cholesteatoma. Of these, overexpression of EGF, TNF-alpha, IL-1 and 6 in cholesteatoma tissue have been suggested to correlate with bony destruction, but TGF-beta has been hypothesized to correlate with osteoclast inhibitory function. Here, to examine the potential role of TGF-beta in the pathogenesis of cholesteatoma and its bone destruction, I investigated gene expression in cholesteatoma tissue as well as in the normal postaural skin using RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) technique, and obtained the following results. 1) In 13 cases of cholesteatoma, TGF-beta1 band was expressed at 474bp size marker site in 12 cases, while in 13 cases of normal postaural skin it expressed in 8 cases. 2) All of 12 cases which were expressed TGF-beta1 had granulation tissue and in 9 cases, there were bone destruction, but there was no granulation tissue and bone destruction in one case which was not espressed TGF-beta1. 3) In all cases of over 1 year disease history, TGF-beta1 expression were noted. However, in cases of under 1 year disease history, there was no expression. In conclusion, the higher expression of TGF-beta1 in cholesteatoma than normal postaural skin suggest that TGF-beta1 plays a major role in proliferation and growth of cholesteatoma as well as protective effect for bone destruction by cholesteatoma. But quantative test will be needed to clarify this point. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍTGF-betaㆍCytokineㆍmRNAㆍRT-PCR |
서론
중이강내에 각질화 상피세포의 과다증식으로 생기는 진주종이 골파괴를 일으키는 병인론은 아직 정확한 기전이 규명되어 있지 않다. 그러나 지금까지 보고에 의하면 진주종 팽창에 의한 골흡수, 단핵구 조직세포에서 분비하는 여러 효소에 의한 골흡수, 그리고 Interleukin(IL), Tumor necrosis factor(TNF) 등 여러 생물학적 요소에 의한 골파괴세포의 활성 등이 보고되고 있다.
지금까지 TNF-α와 β, Epithelial growth factor(EGF), Transforming growth factor-β(TGF-β), IL-1와 6등이 면역학적 염색방법을 통해 진주종 조직내에서 국소확인 되었으며 이중 EGF, TNF-α, IL-1과 6등은 골파괴와 관계된다고 보고되어 왔으나 TGF-β는 골파괴 세포를 억제하여 진주종 성장을 억제하리라 생각되고 있다. 이에 저자는 진주종 조직에서의 TGF-β 발현 정도 및 이의 골파괴에 대한 기능을 알아보는 기초 자료를 얻고자 수술시에 얻은 진주종 조직과 정상 후이개 피부 조직에서 TGF-β의 발현 정도를 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 관찰하고 이를 통해 진주종의 골파괴 정도와 비교하고자 한다.
연구대상 및 방법
1. 조직채취
한양대학병원 이비인후과에서 만성 진주종성 중이염으로 진단받고 수술받은 16명의 환자에서 수술시에 얻은 진주종 조직과 정상 후이개 피부 조직을 얻어 Eppendorf tube에 넣은 즉시 영하 70℃에 보관하였다.
2. Total RNA의 추출
Total RNA를 추출하기 위해 약 100mg의 조직을 멸균된 Eppendorf tube에 옮긴 후 RNA의 손실을 막기위해 RNAse inhibitor인 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 구성된 solution D(guanidine thiocyanate, DEPC-dH 2O, sodium citrate, sarcosyl)를 첨가하고 motor homogenizer로 균질화시켰다.
RNA를 침전시키기 위해 균질화된 조직에 2M sodium acetate(pH 4)를 넣고 protein을 제거하기위해 phenol과 chloroform을 혼합시켰다. 여기서 얻은 재료를 10,000gram, 4℃에서 20분간 원심분리한후 상층부위를 새 tube에 옮기고 핵산침전이 잘 되도록 isopropanol을 첨가하여 영하 20℃에서 1시간 이상 침전시킨후에 다시 isopropanol을 첨가하고 원심분리하였다. 75% ethanol을 첨가하고 원심분리하여 깨끗이 정제후에 얻어진 RNA pellet을 1시간동안 건조후 50μl의 DEPC dH 2O에 부유시켰다. 추출된 RNA pellet을 증류수로 100배 희석하여 spectrophotometer로 260nm에서 OD(optimal density)값을 구하였다.
3. Reverse transcription(역전사)
Messenger RNA(mRNA)에서 complementary DN A(cDNA)를 합성하는 reverse transcription을 위해 추출된 RNA 2μg에 8μl dH2O를 혼합후 70℃에 10분간 보온하였다. dNTP(nucleotide), RNASIN(RNAse inhibitor), MMVL-RT(reverse transcriptase), DTT, random Hexamer, 5x RT buffer를 혼합후 37℃에서 90분간 보온후 95℃에서 10분간 반응시켜 mRNA를 cDNA로 reverse transcription시켰다.
4. PCR(polymerase chain reaction：중합효소 연쇄반응)
cDNA를 PCR로 증폭시키는 과정으로 reverse transcription과정에서 얻은 cDNA 5μl에 각각 50pmole의 primer, 1.25U Taq polymerase, 10x PCR buffer, 200μM dNTP, 1.5mM MgCl 2, dH 2O를 혼합하여 반응시켰는데 primer로는 TGF-β1에 specific한 sense primer와 antisense primer를 사용하였고(Table 1), 반응조건은 denaturation(변성반응)을 위해 95℃에서 1분, annealing(결합반응)을 위해 65℃에서 30초, extension(연장반응)을 위해 72℃에서 1분으로 하였고 모두 40cycle을 시행하였다.
5. Electrophoresis(전기영동)
PCR로 증폭된 cDNA를 전기영동시키는 과정은 1.5% agarose gel에 5μl/ml Ethidium bromide염색을 한후 10μl의 PCR 반응물과 2μl gelloading buffer을 넣고 0.5x TAE buffer에서 75Voltage로 시행하여 474bp의 TGF-β1 band를 관찰하였다.
실험반응의 정확성을 확인하기 위해 β-actin primer를 이용하여 RT-PCR을 시행후 band를 관찰하였고 양성대조군으로 nasal polyp를 관찰하였고 음성대조군으로는 cDNA 대신 dH 2O를 사용하였다.
6.Chart review
진주종의 파괴 정도를 보기 위해 환자 chart를 조사하여 유병기간, 수술소견상 골파괴 또는 이소골 미란, 육아조직을 검토하여 TGF-β 발현 정도와 비교 분석하였다.
결과
16개의 진주종 조직중 OD값이 1.5이상인 13개의 조직과 정상 후이개 피부조직에서 RT-PCR을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 13개의 진주종 조직중 12개에서 474bp size marker 부위에 TGF-β1 band가 발현되었으나 정상 후이개 피부조직에서는 13개의 조직중 8개에서 band가 보였다(Table 2).
2) 실험의 정확성을 위해 실시한 β-actin의 발현은 진주종 조직 및 정상 후이개 조직 모두에서 1000bp size marker부위에 band가 잘 관찰되었고, 양성 대조군으로 실시한 비용조직에서의 TGF-β1의 발현은 2개 모두에서 양성으로 나타났으며 음성대조군에서는 band가 관찰되지 않았다(Fig. 1).
3) 진주종의 유병기간에 따른 TGF-β1의 발현은 1년 이상의 유병기간을 갖는 경우에서는 모두 발현되었으나 1년 미만인 경우에서는 TGF-β1 band가 발현되지 않았다(Table 3).
4) TGF-β1가 발현된 진주종 12례 모두에서 육아조직 형성을 보였고 이중 9례에서는 골파괴 소견을 동반하였으며, TGF-β1의 발현이 없었던 1례에서는 육아조직 및 골파괴 소견을 보이지 않았다(Table 4).
고찰
진주종은 중이강내에 각질화 상피세포로 구성되며 각질화 상피세포가 계속 과다증식하면 이로 인해 인접된 골을 파괴하게 된다. 그러나 골파괴에 대한 병인론은 진주종 팽창에 의한 골흡수, 단핵구 조직세포에서 분비하는 여러 효소에 의한 골흡수, 그리고 IL, TNF, EGF 등 여러 생물학적 요소에 의한 골파괴세포의 활성에 의한 것 등 여러 가설이 알려져 있으나1)11)31)33)34) 아직 정확한 기전은 정립되어 있지 않다. 특히 cytokines들의 상호작용이 진주종의 성장, 증식 및 골파괴에 영향을 미칠것이라 여겨져 최근 이에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다.
Moriyama등18)이 각질화 세포로 구성된 배지에서 섬유아세포의 교원질 분해효소 형성이 증가된다는 것을 관찰하여 상피세포와 간질세포간의 반응이 진주종의 골파괴에 중요한 역할을 한다고 하였고, Bernstein5)은 중이염에 대한 일차 방어로 면역반응이 관여할 것이라 하였다. Yellon등32)은 중이삼출액에서 cytokines이 대식세포, 림프구, 그외 염증부위의 세포에서 분비되는 물질로서 염증반응과 면역반응에 중요한 매개체라 하였다.
TNF-α, TNF-β, IL-1과 EGF는 면역효소 염색방법으로 진주종내에서 분리되었으며 이들 cytokines이 섬유아세포, 파골세포, 염증세포를 자극하여 조직파괴와 개형(remodeling)을 야기한다.1)2)11)33)34) IL-6은 혈액전구세포로부터 골파괴세포 형성을 자극하고,14)15) IL-1과 TNF-α와 밀접히 연관되는 cytokines이며 이들은 각각 서로를 자극한다.7)9)12) IL-4는 이와 반대로 파골전구세포가 파골세포(osteoclast)로 분화되는 것을 방지하여 골흡수를 방어한다.20)
Transforming growth factor(TGF)는 세포에 virus를 감염시킨 후에 분비되는 물질을 연구하는 과정중에서 세포를 변형시키는 cytokine으로 발견된 이후 여러가지 기능이 밝혀져 왔다. TGF군은 α, β가 존재하며 β는 1에서 5까지의 subtype들이 보고되었는데 사람에서는 1, 2, 3만이 밝혀졌고 4는 그 존재가 불확실하며 5는 다른 동물에서 밝혀져 있다.6) 이중 TGF-α는 상피세포의 증식이나 편평세포의 이형성을 촉진시키며 혈관형성을 유발하는 것으로 알려져 있으며26) TGF-β는 25-KD의 단백질로 세포의 이동과 성장을 조절하고 세포외 기질의 합성과 분해를 조절한다.4)28)
TGF-β의 subtype중 TGF-β 1과 2만이 생물학적으로 특징이 있고 이것에 대한 항체가 상업적으로 유용하게 이용되고 있다.16) 일반적으로 TGF-β라 불리우는 TGF-β1은 TGF-β2와 N-terminal이 72%에서 동일성을 보이는데17) TGF-β는 체외에서 실험할 때에는 각 subtype에 차이없이 거의 같은 작용을 하지만 체내에서는 작용부위와 단계마다 각 subtype들의 효과가 다른데25) TGF-β1은 세포외 기질의 생성과 조직 개형(remodeling)을 촉진시키며 염증과정을 조절하고8)13) 조혈전구세포의 증식을 억제하며21), TGF-β2는 개체의 발달에 중요한 것으로 알려져 있으며 강력하게 중배엽 분화를 자극한다.27) 또 TGF-β가 작용하는 I형 또는 II형 등의 수용체(receptor)에 따라서 그 작용효과가 다르게 나타날 수 있다.8)13)
TGF-β에 대한 세포들의 반응은 매우 다양하여 간질세포의 성장은 자극하나 정상 및 종양 상피세포 증식은 억제한다.24)27) 최근 보고들에 의하면 TGF-β는 여러 기관에서 염증반응을 저하조절(down-regulation)한다고 하였다.19) TGF-β는 1ng/ml의 농도에서도 각질세포의 성장을 억제하며3) 상처 치유과정에 중요한 대식세포에서 나오는 여러 세포독성 물질 분비를 억제한다.30) 또한 염증반응 부위에 형성된 결체조직을 파괴하는 단백질 분해효소의 작용을 억제하여 TGF-β 작용부위에서 새로운 육아조직이 형성되는 것을 증가시킨다.29) 본 연구에서는 TGF-β1이 발현된 12례 모두에서 육아조직을 관찰할 수 있었고 육아조직을 관찰할 수 없었던 1례에서는 TGF-β1이 발현되지 않았다.
골에 있어서는 TGF-β가 조골세포 증식과 분화 및 골단백질의 형성을 상승조절(up-regulation)하나, 파골세포의 수와 활성도는 저하조절(down-regulation)하여 골흡수와 골형성의 자기조절(self-regulation)에 관여한다.19) 그래서 TGF-β는 진주종 증식에 대해 골과 연부조직의 방어작용을 할 것이라 생각된다. TGF-β가 10∼20ng/ml이면 골파괴세포에서 나오는 산소 자유 잔기(oxygen free radical)를 환원시키며22) 골파괴전구세포의 복제와 분화를 억제하거나23) 이미 형성된 골파괴세포의 다핵형성(multinucleation) 및 흡수소와(resortion lacunae)를 억제한다.19) 본 연구에서 TGF-β1이 발현된 12례중 9례에서는 골파괴 소견과 육아조직 소견을 모두 보였고 3례에서는 육아조직만 보여 이 3례에서는 TGF-β1이 육아조직은 형성하면서 골파괴를 억제하고 있었다고 생각할 수 있으며 이를 보다 정확히 알기 위해선 TGF-β1의 정량 검사가 시행되어야겠다.
TGF-β는 염증반응에서 나오는 다른 cytokines들의 활성을 감소시키는데 대표적인 것으로는 TGF-β가 연골세포 및 진주종에서 IL-1의 활성도와 수용체(receptor)를 억제한다.10) 그래서 진주종에서 IL-1이 일정한 값 이상으로 증가하면 TGF-β의 발현을 유도할것으로 생각된다.16) 따라서 본 연구에서도 유병기간이 1년 미만인 경우에서 TGF-β의 발현이 없고 골파괴와 육아조직이 관찰되지 않은 이유는 IL-1의 발현에 대한 TGF-β의 방어작용이 아직 발현되지 않았다고 추측할 수 있다.
이상과 같이 TGF-β가 염증반응, 골파괴세포, 그리고 각질세포를 억제하면 중이강내에서 진주종의 성장, 증식, 그리고 이에 의한 조직 파괴를 감소시킬 수 있다고 사료된다(Fig. 2).
mRNA의 검출은 여러가지 방법으로 가능한데 외부에서 특별한 표지가 되어 있는 특정 RNA 서열을 첨가한 후 이 염기서열에 보족적인 RNA가닥을 찾는 northern blot, mRNA를 complementary DNA(cDNA)로 reverse transcription시킨 후 PCR로 증폭시켜 gene의 발현을 조사하는 RT-PCR, 조직이나 세포내에서 mRNA의 존재를 검출하기 위한 in situ hybridization(ISH), 시험관 내에서 세포내의 mRNA를 flow-cytometer로 측정하는 fluorescence in situ hybridization(FISH) 등의 방법이 있다. Northern blot방법은 정량적인 검사이나 민감도가 낮아 위음성이 많고 기타 방법들은 실험과정이 어려워 mRNA의 발현을 보기 위한 실험에서는 RT-PCR이 보편적으로 이용될 수 있는 방법이다.
본 연구에서도 진주종 및 정상 후이개 피부 조직을 사용하여 TGF-β1과 β-actin에 대해 RT-PCR을 시행하였는데 β-actin은 인체내의 어떤 세포에서든지 존재하여 mRNA를 발현하는 gene으로서 다른 gene의 mRNA발현을 규명하는 실험에 있어 그 정확성을 확인하는 기준으로 많이 이용되고 있다.
TGF-β의 작용을 확실히 알기 위해서는 TGF-β가 생성되는 세포를 in situ hybridization, immunohistochemistry, keratinocyte assay 등과 같은 방법으로 규명하고 TGF-β가 작용하는 수용체에 대한 연구가 더 요구되고 있다. Marenda와 Aufdemorte16)에 의하면 진주종에서 immunohistochemistry 방법을 이용한 연구에서 TGF-β가 주로 상피세포에서 발현되었고 진주종의 유병기관과 관련되는 것으로 나타나 TGF-β가 진주종 증식과 성장에 방어 작용을 할 것이라 보고하였다. 본 연구에서는 RT-PCR 방법이 정량적인 검사가 아니어서 유병기간과 직접 연관지울 수 없었으나 1년 이상의 유병기간을 갖는 진주종에서는 TGF-β1이 모두 발현되었다.
또한 진주종 조직 13례중 12례에서 TGF-β1 mRNA가 발현되어 92.3%의 발현율을 보였으나, 정상 후이개 조직에서는 8례로 61.5%의 발현율을 보여 진주종의 병인에 TGF-β1이 직접 혹은 간접적으로 연관이 많다는 것을 알 수 있었다.
결론
진주종의 병인, 성장, 증식, 및 골파괴에 대한 기전 및 면역반응을 보다 정확히 알려면 한가지의 cytokine에 의해 설명할 수 없고 지금까지 언급한 여러 cytokines들의 종합적인 검사로 이해해야 마땅하겠다. 저자는 아직 그 기능이 정확히 알려지지 않은 TGF-β의 진주종에서 발현을 측정하여 다른 cytokines들과의 연관성을 알아본 결과, 정상 후이개 피부조직에서보다 진주종조직에서 TGF-β 발현이 높은 것으로 볼때 TGF-β는 진주종의 성장, 증식, 그리고 골파괴에 대해 방어작용을 하는 중요한 요인이라고 추정할 수 있다. 그러나 이점을 확실히 하기 위해서는 앞으로 TGF-β, IL-1, 2, 4, 6, TNF-α 등의 여러 cytokines들의 정량적인 분석과 각각의 진주종 상태를 비교하여 TGF-β의 방어작용이 명확해 진다면 진주종의 병리를 잘 알게 되어 이 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있을 것이다.
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