교신저자：김선태, 405-760 인천광역시 남동구 구월동 1198  가천의과학대학교 의학전문대학원 길병원 이비인후과학교실
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서     론

   황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 비용종을 동반한 부비동염에서 가장 흔히 검출되는 세균 중 하나로 비용의 발생에 관여될 수 있음이 알려져 있다.^1,2,3)
   황색포도상구균은 사람의 피부나 상기도, 소장 등에 정상 균주의 일부로 존재한다. 사람의 25%는 황색포도상구균에 대한 영구적인 보균자들이며 황색포도상구균 감염자의 20%는 자가감염질환으로 여러 인자들이 이와 같은 감염에 대한 감수성을 높이는데 기여한다.⁴⁾ 이러한 인자들 중에는 알레르기, 피부와 점막에 대한 손상, 비정상적인 백혈구 활동, 바이러스 감염, 대사장애 등이 있다.⁵⁾ 적당한 조건이 되면 정상적으로 존재하는 황색포도상구균들이 분비한 외독소들이 조직내로 침범하여 면역조절자나 염증전구세포들에 영향을 주어서 아토피 피부염 등 만성 염증성 질환의 병인에 중요한 역할을 하게 된다.^6,7)
   황색포도상구균의 경우 19개의 다른 외독소들이 알려져 있는데 이들 중 Staphylococcus aureus exotoxin A(SEA), Staphylococcus aureus exotoxin B(SEB), Toxic Shock Syndrome Toxin 1(TSST-1) 등이 대표적인 외독소들이다.^8,9) 또한 이런 외독소들은 폐렴구균, 마이코플라즈마, 바이러스에 의해서도 분비될 수 있다.¹⁰⁾ 아토피성 피부염에서는 이미 SEA 등에 의한 초항원의 역할이 알려져 있다.^6,11)
   비용의 발생원인 중 감염은 유력한 원인 인자로서 최근에는 황색포도상구균의 외독소가 비용의 발생에 영향을 준다는 주장이 제기되고 있다.^12,13) 포도상구균의 외독소는 초항원과 알레르기 항원으로 각각 작용할 수 있는데 초항원으로 작용하여 특정 T세포 수용체 V(쇄를 표현하는 T세포와 결합하여 일반 항원보다 약 1,000배에서 10,000배의 강도로 직접 T림프구를 강력하게 자극하게 된다.^5,14) 이에 따라 자극된 T세포에 의한 염증반응이 활성화되어 비용 형성에 관여할 수 있다고 알려져 있다.^13,15,16) 그러나 아직까지 비강내 포도상구균 외독소와 비용 조직내의 포도상구균 외독소와의 직접적인 관계를 본 결과는 없었다.
   저자들은 비강내 존재하는 포도상구균의 외독소가 비용의 발생과 관련이 있는지 보고자 비용을 포함한 비강점막과 비강세척액내에서의 포도상구균 외독소의 분포를 비교하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험군은 부비동염이 동반된 비용으로 진단받고 수술 받은 30명의 환자를 대상으로 하였다. 대조군은 실험군과 같이 2006년 1월부터 6월 사이에 내원한 환자 중에서 정상 비점막 소견을 보이며 비용이 없고 비루 등 증상이 없는 비중격 만곡증 및 외비 기형 환자로 총 10명이었다. 알레르기 기왕력이 있거나 피부반응검사나 MAST에서 양성을 보인 환자는 제외하였으며 두 군 간에 성별과 나이에 따른 의미 있는 차이는 없었다. 

방  법

도말배양검사
   비용종이 있는 환자군에서는 비용종의 표면에서 대조군은 중비도 비점막에서 도말을 시행한 후 MacConkey Agar를 사용하여 검체를 접종시킨 후 35℃ 배양기에서 1주일간 배양하였다.

비강세척액
   모든 실험군과 대조군에서 1% phenylephrine hydrochloride를 양측 비강내로 분무시켜 비점막을 수축시킨 후 환자로 하여금 숨을 들이마시고 참게 한 후 양측 비강내로 10 mL 멸균 생리식염수를 주입하였다. 비강내를 세척한 식염수를 모아 비세척액을 채취하였다. 이를 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 침전물을 영하 20℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다.

중합효소연쇄반응(PCR)
   DNA 추출은 침전물과 동량의 2배 용해 완충액을 넣고 68℃ 항온수조에서 3시간 동안 반응시킨 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 취하여 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25：24：1)과 클로로포름/이소아밀알코올(24：1)로 처리과정을 순차적으로 1회씩 처리한 후 3,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 반복하여 취하였다. 이 상층액에 동량의 이소프로필알코올을 첨가하여 영하 20℃ 냉동고에 12시간 이상 보관하였고 보관된 상층액을 3,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA에 70% 에탄올 1 mL를 넣고 세척한 다음 원심 분리하여 만든 침전물을 증류수 50 uL에 녹인 후 흡광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 정량하였다.
   추출된 유전자의 DNA를 이용하여 유전자 발현을 보기 위해 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 2 uL DNA에 10배 중합효소연쇄반응 완충액, 2.5 mM dNTPs, sense 및 antisense primer, Tag DNA polymerase, 증류수 등을 넣어 중합효소연쇄반응에 이용하였다. 이 연구에서 사용된 SEA에 대한 sense primer의 배열은 5'-TTG GAA ACG GTT AAA ACG AA-3' antisense primer는 5'-GAA CCT TCC CAT CAA AAA CA-3'이고 TSST-1에 대한 sense primer의 배열은 5'-ACC CCT GTT CCC TTA TCA TC-3'이고 antisense primer는 5'-TTT TCA GAT TTT GTA ACG CC-3'이다. 중합효소연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2,400(Perkin Elmer, USA)에서 94℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃에서 35초, 53~57℃에서 30초, 72℃에서 30초 주기로 약 35회 증폭한 후 최종 72℃에서 약 5분간 반응을 연장시켰다. 최종 중합효소연쇄반응 산물을 1.5% 아가로스젤에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide 용액으로 30분간 염색하여 확인하였다.

면역조직화학적 염색
   포도상구균 외독소에 대한 면역조직화학염색을 위해 일차 항체로 Anti-rabbit SEA Immunogolbulin G(Toxin echnology, Sarasota, FL)와 Anti-rabbit TSST-1 Immunoglobulin G(Toxin technology, Sarasota, FL)를 사용하였다. 일차 항체의 항원-항체 결합을 검출하기 위해 Universal LSAB2/HRP kit(Dakocytomation, Denmark)을 사용하였다. 내인성 페록시다아제 활성을 억제하기 위해 37℃에서 3% 과산화수소로 10분간 처리하고 나서 삼중 염화 수소 완충액으로 세척하였다. 조직내의 비 특이적인 면역반응을 억제하기 위해 37℃에서 완충액으로 희석된 정상 마우스 혈청으로 30분간 항온 반응시킨 후 일차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 일차 항체의 희석농도는 SEA와 TSST-1의 항체는 1：50 농도로 희석하여 사용하였다. 삼중 염화 수소 완충액으로 세척하고 이차 항체를 37℃에서 30분 반응시킨 다음 완충액으로 세척하고 avidin과 37℃에서 15분간 반응시켰다. AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)와 3% 과산화수소 용액을 잘 혼합한 다음 37℃에서 10분간 반응시키고 증류수로 세척한 다음 1분간 H & E 염색을 시행하였다.

분석 및 통계처리
   SPSS version 12.0(SPSS inc. Chicago, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 도말배양검사 및 중합효소 연쇄반응, 면역조직화학염색검사의 분석은 Z-test를 사용하였다. 도말배양검사 및 중합효소 연쇄반응검사와 면역조직화학염색검사 사이의 관련성은 Chi-square test로 분석하였다. 그리고 p값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다. 본 연구는 본 병원의 임상시험윤리위원회(IRB)의 심의를 통과한 연구이다.

결     과

도말배양검사
   도말배양검사 결과 비용종군에서 포도상구균은 8명(27%), 대조군에서는 1명(10%)에서 검출되어 황색포도상구균이 비용종을 가진 환자군에서 의미 있게 높게 검출됨을 확인하였다(p<0.05)(Table 1).

중합효소연쇄반응
   수술 전 채취한 비세척액에 대한 중합효소연쇄반응 결과 만성부비동염을 동반한 비용종 환자 30명 중 SEA는 16명(53%)에서 검출되었고 TSST-1은 18명(60%)에서 검출되었다. 정상 대조군 10명 중 SEA는 2명(20%)에서 TSST-1은 1명(10%)에서 검출되어 두 군 간에 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 확인되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 1).

SEA, TSST-1에 대한 면역조직화학염색
   수술 중 채취한 비용종과 정상 비점막 조직에서 시행한 면역조직화학염색의 결과 비용종을 가진 환자 30명 중 SEA는 6명(20%)에서 검출되었고 TSST-1은 10명(33%)에서 검출되었다. 정상 대조군 10명 중에서는 SEA와 TSST-1 모두 검출되지 않아 두 군간의 차이를 확인할 수 있었다(p<0.05)(Table 3, Figs. 2 and 3).

배양검사, 중합효소연쇄반응, 면역조직화학염색 사이의 관련성 조사
   배양검사 양성으로 나온 군에서 SEA에 대한 중합효소연쇄반응과 면역조직화학적 검사 결과가 모두 유의한 관련이 있었다(p<0.05). 또한 각각 SEA와 TSST-1 외독소 모두에서 비즙에 대한 중합효소반응과 비용내 면역조직화학적 검사 결과에 대한 관련성 조사에서 모두 p<0.05로 뚜렷한 연관성을 보여주었다(Table 4). 대조군에서는 SEA에 대한 중합효소연쇄반응과 도말배양검사 사이에서만 관련성이 있었다(p<0.05). 그러나 나머지 결과들은 특별한 관련성을 보이지 않았다(Table 5).

고     찰

   본 연구에서 세균배양검사 결과상 만성부비동염을 동반한 비용종 환자군의 27%에서 황색포도상구균이 검출되었고 대조군에서는 10%에서만 배양되어 비용 환자군에서 정상 대조군에 비해 유의하게 높은 양성률을 보였다. 황색포도상구균은 부비동염에서 가장 흔히 검출되는 세균 중 하나이며¹⁾ Merino 등²⁾은 만성부비동염으로 진단된 510명의 환자에서 상악동 천자 후 세균배양검사를 시행하여 황색포도상구균이 네 번째로 흔한 균주라고 보고하였으며, 일부에서는 비용을 동반한 만성부비동염 환자의 55%에서 포도상구균이 검출되었다고 보고된 바 있다.¹⁷⁾ 이런 이전의 보고들과 저자들의 실험 결과로 볼 때 포도상구균과 비용종을 동반한 만성부비동염에서 많이 검출됨을 알 수 있다.
   본 연구에서 황색포도상구균의 외독소를 중합효소연쇄반응을 이용하여 검출하였을 때 비용 환자의 비세척액에서 통계적으로 의미 있게 높은 결과를 보였다. 이전 Bernstein 등¹⁷⁾은 비용을 가진 환자의 비세척액에서 효소결합 면역흡착검사(ELISA)를 이용하여 비용 환자의 23%에서 SEA를 검출하였고 TSST-1을 15%에서 검출한 바 있다. 이와 비교할 때 중합효소연쇄반응 결과에서는 SEA의 경우에는 53%, TSST-1은 60%로 훨씬 높은 검출률을 보여 외독소의 발생 빈도가 검사 방법에 따라 달라질 수 있음을 보여주었다. 이는 배양검사에는 안 나올 수 있지만 실제적으로 검사 방법의 민감성을 높인다면 더 많은 경우에 외독소가 비강내에 존재함을 의미한다.
   저자들이 시행한 면역조직화학염색검사상 SEA와 TSST-1은 비용종 조직에서 각각 20%, 33%에서 검출되어 전혀 검출되지 않은 정상 대조군과 유의한 차이를 보였으며 비용종 조직내에 황색포도상구균의 외독소가 존재함을 직접적으로 보여주었다. 이전의 연구에서 황색포도상구균의 외독소가 비점막 조직 인접 비분비물에서 발견된 바 있었지만 본 실험에서는 황색포도상구균의 외독소를 비강분비물과 비용종 조직내에서 동시에 발견할 수 있었다. 이로 미루어 볼 때 외독소가 비용 형성에 기여할 수 있다고 생각한다. 또한 본 실험 결과에서도 이러한 외독소가 정상인에서도 10~20%까지 존재함을 보여주었다. 이는 외독소가 정상 균주로 존재하더라도 외독소에 대한 민감성이 사람에 따라 다를 수 있는데 이에는 Allergic fungal sinusitis처럼¹⁴⁾ 아직까지 확실히 알려져 있지는 않지만 사람에 따른 면역학적 반응의 차이가 염증 반응을 일으킬 수 있다고 생각된다.
   또한 포도상구균은 세포외 기질을 이루는 fibronectin, fibrogen, 그리고 collagen 등을 인식하는 수용체를 가지고 있다. 따라서 아토피 피부염 환자에서 포도상구균의 결합은 주로 각질층에서 이루어지며 fibronectin의 재배치도 일어난다.¹⁸⁾ 일반적으로 비용의 면역조직화학염색검사상 fibronectin의 분포는 정상에 비해 비용에서 주로 상피와 상피하에 증가되어 관찰된다.^19,20) 따라서 비용에서 특별한 염증 반응이 있다면 상피세포에서 이러한 포도상구균의 집락을 촉진시킬 수 있는 조건이 되는 것이다.⁵⁾ 그러나 단순히 이러한 외독소의 침투를 통한 염증 반응에 의해서만 비용 형성에 기여한다고 볼 수는 없다. 이는 비용을 치료할 때 항생제 사용과 더불어 스테로이드 제제를 함께 사용하였을 때 비용의 치료에 더 좋은 효과를 보이는데 이는 비용이 감염과 이에 의한 고전적인 염증 반응에 의해서만 발생한다기보다는 그 외에 어떤 면역학적인 요소가 관여한다는 것을 시사한다.²¹⁾
   저자들의 결과에서 SEA와 TSST-1 외독소 모두에서 비즙에 존재하는 것과 비용내에 존재하는 것에 연관성을 보여주었다. 이는 비강에 존재하는 황색포도상구균 외독소가 비점막을 침투하여 비용의 병리기전에 관여할 수 있음을 보여주는 증거이다. 따라서 저자들의 실험 결과로 미루어 볼 때 비강내 정상 균주로 존재하는 황색포도상구균은 비강내에서 외독소를 분비하고 이들 외독소들은 비점막의 손상 부위를 통해 비조직내로 침투하여 비용 형성에 관여할 수 있는 것으로 보인다. 본 연구에서는 만성부비동염이 동반된 비용 환자군을 정상 대조군과 비교하였는데 이후에는 비용종을 동반하지 않은 만성부비동염 환자군을 대조군으로 한 연구도 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서 저자들은 비세척액에서 뿐만 아니라 비용 조직내에서도 황색포도상구균의 외독소를 동시에 검출함으로써 비점막 조직의 외부 및 내부에 존재하는 황색포도상구균의 외독소가 비용 발생에 서로 관여할 수 있음을 보여주었다. 향후 황색포도상구균의 외독소가 조직내로 침투하는 기전에 대해서도 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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